猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及免疫原性探究

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及免疫原性探究一、引言1.1猪传染性胃肠炎研究进展猪传染性胃肠炎（TransmissibleGastroenteritisofPigs，TGE）是一种由猪传染性胃肠炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirus，TGEV）引起的急性、高度接触性肠道传染病，是我国法定检疫的疫病之一。其在养猪业中危害极大，主要侵害2周龄以内的仔猪，导致仔猪出现呕吐、严重腹泻和脱水等症状，发病率和死亡率均较高，给养猪业带来了巨大的经济损失。TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子多呈圆形或椭圆形，直径为80-120nm，有囊膜，表面有一层棒状纤突，长约12-25nm。基因组为不分节段的单股正链RNA，大小约28.5kb。该病毒对乙醚、氯仿、去氧胆酸钠及光敏感，在胆汁中相当稳定，对胰酶有抵抗力，在pH4-8时稳定，且在一定pH下，温度越高，灭活越快，冻结保存时极为稳定。此外，TGEV只有1个血清型，各毒株之间有密切的抗原关系，且与猫传染性腹膜炎病毒和犬冠状病毒之间存在抗原相关性，特别是与猪呼吸道冠状病毒（PRCV）的核苷酸和氨基酸序列有96%的同源性，PRCV是由TGEV突变而来。猪是TGEV的唯一易感动物，病猪和带毒猪是主要传染源。病毒经分泌物、排泄物污染环境，通过呼吸道和消化道感染健康猪，传播速度快，几天内即可波及全群。该病一年四季均可发生，但有明显的季节性，主要在12月至次年4月发生，寒冷季节易存活和扩散。TGEV的致病机制主要是病毒经口咽、食管、胃进入消化道，在小肠上皮细胞发生感染，导致空肠和回肠的绒毛显著萎缩，感染的上皮细胞脱落，破坏了小肠上皮细胞吸收功能，使肠道水解乳糖和吸收其他营养成份的功能下降，肠腔内高渗，从而导致严重腹泻脱水。在临床症状方面，不同年龄段的猪表现有所差异。一般2周龄以内的仔猪感染后12-24小时会出现呕吐，继而出现严重的水样或糊状腹泻，粪便呈黄色，常夹有未消化的凝乳块，有恶臭，体重迅速下降，仔猪明显脱水，发病2-7天死亡，死亡率达100%；2-3周龄的仔猪，死亡率在0-10%。断乳猪感染后2-4天发病，表现水泻，呈喷射状，粪便呈灰色或褐色，个别猪呕吐，在5-8天后腹泻停止，极少死亡，但体重下降，常表现发育不良，成为僵猪。中猪、育肥猪症状较轻，发病后数日食欲不振，个别猪有呕吐，然后发生水样腹泻，呈喷射状，排灰色或褐色粪便，体重迅速减轻。有些母猪与患病仔猪密切接触反复感染，症状较重，体温升高，泌乳停止，呕吐、食欲不振和腹泻，也有些哺乳母猪不表现临诊症状。病理变化上，具有特征性的变化主要见于小肠，整个小肠气性膨胀，伴有卡他性炎，肠管扩张，内容物稀薄、呈黄色、泡沫状，肠壁弛缓，缺乏弹性，变薄有透明感，25%病例有充血、出血变化，胃底粘膜潮红，充血、出血，并有粘液覆盖，50%病例见有小点状或斑状出血，胃内容物呈鲜黄色，并混有大量乳白色凝块，较大的小猪，14日龄以上的约10%病例可见有出血、溃疡灶，靠近幽门可见坏死区。目前，针对猪传染性胃肠炎的防控主要采取综合措施。在预防方面，加强饲养管理，不从疫区引进猪只，做好隔离消毒工作；母猪产前免疫，仔猪吮初乳获得被动免疫；猪干扰素对仔猪该病的发生有较好的预防作用。治疗上，主要是防止继发感染，应用肠道抗菌药如庆大霉素、恩诺等；对于脱水严重者可注射5%葡萄糖、生理盐水及5%碳酸氢钠，可防止脱水和酸中毒，必要时可注射硫酸阿托品；也可口服补液盐。但这些方法在实际应用中仍存在一定的局限性，因此，研发高效的疫苗和诊断方法对于猪传染性胃肠炎的防控具有重要意义。1.2毕赤酵母表达系统应用毕赤酵母表达系统作为一种高效的真核表达系统，在异源蛋白表达领域展现出了广泛的应用前景和显著的优势，已成为当前生物技术领域研究的热点之一。该系统的诸多特性使其在众多表达系统中脱颖而出，为科研工作者和工业生产提供了强有力的工具。从系统特点来看，毕赤酵母拥有目前最强、调控机理严格的启动子之一——醇氧化酶基因AOX1启动子。这一启动子使得外源基因的表达调控更加精准高效，能够根据实验需求或生产要求，在特定条件下启动或关闭外源基因的表达。当以甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而高效调控与之相连的外源基因的表达，实现对异源蛋白表达的严格控制。在表达水平方面，毕赤酵母表达系统表现出色，既能实现胞内表达，又可进行分泌型表达。众多研究表明，在毕赤酵母中，一些外源蛋白的表达量相当可观，如破伤风毒素C的表达量最高可达12g/L，一般情况下表达量也大于1g/L，绝大多数外源基因在该系统中的表达水平高于在细菌、酿酒酵母、动物细胞等其他表达系统中的表达水平。这一优势使得毕赤酵母在大规模生产异源蛋白时具有明显的经济价值和应用潜力。此外，该系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，这不仅有利于后续的纯化工作，减少了蛋白纯化过程中的复杂步骤和成本，还能提高蛋白的稳定性和活性，因为分泌到胞外的蛋白可以避免受到胞内蛋白酶的降解。毕赤酵母表达系统的发酵工艺成熟且易于放大，已经具备大规模工业化高密度生产的能力。在实际生产中，其细胞干重可达到100g/L以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升的发酵规模。这一特性使得毕赤酵母表达系统能够满足工业生产对大规模、高效率生产异源蛋白的需求，从实验室研究到工业化生产的转化过程相对顺利，大大缩短了研发周期和产业化进程。同时，该系统的培养成本低，产物易分离。所用发酵培养基主要由无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源组成，如甘油、葡萄糖及甲醇等，这些成分廉价而无毒，培养基中不含蛋白，有利于下游产品的分离纯化，降低了生产成本，提高了生产效益。从遗传稳定性角度来看，外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上后，能随染色体复制而稳定存在，不易丢失。这确保了在大规模发酵生产过程中，外源基因能够持续稳定地表达，不会因为基因的不稳定而导致蛋白表达量的波动或表达产物的变异，保证了产品质量的稳定性和一致性。此外，作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，能够对表达的蛋白进行糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工。这些修饰对于许多蛋白的正确折叠、结构稳定和功能发挥至关重要，使表达出的蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，具有更高的生物活性和应用价值，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的蛋白质。目前用于外源蛋白表达的毕赤酵母宿主菌种类多样，常见的有Mut+甲醇利用型GS115、X-33、SMD1165、SMD1163及SMD1168等，MutS甲醇利用缓慢型KM71，以及Mut-甲醇不利用型MC100-3。其中，GS115具有高表达水平、高细胞密度、高可溶性蛋白产量的特点，是目前应用最广泛的宿主菌；KM71适用于表达难以溶解的蛋白质；X33可使表达量和活性提高，适用于表达重组蛋白质；SMD1168H具有更好的表达效率和更高的细胞密度，适用于表达大分子蛋白质；SMD116（his4pep4）属于蛋白酶缺失型菌株，能够减少蛋白降解，解决由于蛋白降解而引起的表达产物分布不均的问题，不过该菌株生长相对缓慢，可能导致表达的外源蛋白质产量较低。不同的宿主菌具有各自独特的特性，研究者可根据目标蛋白的性质和表达需求选择合适的宿主菌，以实现最佳的表达效果。毕赤酵母表达载体以整合型载体为主，常见载体可分为胞内表达载体和分泌表达载体。常用的胞内表达载体如pPIC3.5K基于AOX1启动子，可进行高水平的胞内表达；pPIC3K同样基于AOX1启动子，带有kanamycin抗性标记，可在毕赤酵母中表达目的蛋白；pGAPZ基于GAPDH启动子，适用于表达中等至高水平的目的蛋白质，并可进行分泌或胞内表达。分泌表达载体如pPICZαA/B/C基于AOX1启动子，带有α因子信号序列，可进行高效的分泌表达；pPIC9K基于AOX1启动子，可用于高水平的胞外表达，并带有G418抗性标记；pPIC3.5K-BGH基于AOX1启动子，带有β半乳糖苷酶信号序列，可用于检测融合蛋白的表达和分泌。这些不同类型的载体为科研人员提供了多样化的选择，能够满足不同实验目的和蛋白表达需求。1.3研究目的与意义猪传染性胃肠炎给全球养猪业带来了沉重的经济负担，严重威胁着养猪业的健康发展。尽管当前已经有一些防控措施，但现有疫苗和诊断方法仍存在诸多不足，难以满足实际生产中的防控需求。开发更加有效的疫苗和诊断技术成为了防控猪传染性胃肠炎的关键所在。本研究聚焦于猪传染性胃肠炎病毒S蛋白，将其在毕赤酵母中进行分泌表达，并深入分析其免疫原性。猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在病毒感染和免疫过程中发挥着核心作用，其能够诱导机体产生中和抗体，是研制高效疫苗和建立精准诊断方法的关键靶标。而毕赤酵母表达系统具有独特优势，如表达水平高、可进行翻译后修饰、发酵工艺易于放大等，能够实现S蛋白的高效表达，为后续研究提供充足的蛋白来源。本研究的具体目的在于成功构建能够高效表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的毕赤酵母工程菌株，通过优化表达条件实现S蛋白的大量分泌表达，并运用先进的蛋白纯化技术获得高纯度的S蛋白。同时，利用多种免疫学方法全面分析表达产物的免疫原性，包括检测其诱导机体产生特异性抗体的能力、刺激细胞免疫反应的效果等。本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。从理论层面来看，深入探究猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫原性，有助于进一步揭示该病毒的感染机制和免疫逃逸机制，丰富对冠状病毒分子生物学特性的认识，为猪传染性胃肠炎的防控策略提供坚实的理论依据。在实际应用方面，若能够成功表达具有良好免疫原性的S蛋白，将为猪传染性胃肠炎新型疫苗的研发开辟新的途径，有望提高疫苗的免疫效果和保护力，有效降低仔猪的发病率和死亡率，减少养猪业的经济损失。表达的S蛋白还可作为诊断抗原，用于开发更加灵敏、准确的诊断方法，实现对猪传染性胃肠炎的早期快速诊断和疫情监测，为及时采取防控措施提供有力支持。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1毒株、菌株、细胞和质粒猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）毒株为本实验室前期从发病猪群中分离并保存，经鉴定具有典型的生物学特性和致病性。该毒株在后续实验中作为目的基因的来源，用于获取S蛋白基因。毕赤酵母菌株选用常用的GS115菌株，其具有组氨酸缺陷型（his4）标记，便于后续转化子的筛选。该菌株具有甲醇利用正常型（Mut+）表型，能够在以甲醇为唯一碳源的培养基中高效表达外源基因，符合本实验对S蛋白表达的需求。细胞系选择猪睾丸细胞（ST细胞），其对TGEV具有良好的敏感性，常用于TGEV的增殖和培养。在本实验中，ST细胞用于TGEV的扩繁，为后续的基因提取和实验研究提供充足的病毒来源。质粒载体采用pPICZαA，这是一种常用的毕赤酵母分泌表达载体。该载体含有醇氧化酶基因AOX1启动子，可在甲醇诱导下高效启动外源基因的表达；还带有α-因子信号肽序列，能够引导外源蛋白分泌到细胞外，便于后续的蛋白纯化和分析。此外，载体上携带有Zeocin抗性基因，用于转化子的筛选。2.1.2酶和试剂实验中使用的酶类包括限制性内切酶XbaI和NotI，购自NEB公司，用于对质粒和目的基因进行酶切，以便后续的连接反应。T4DNA连接酶同样购自NEB公司，能够催化DNA片段之间的连接，实现目的基因与表达载体的重组。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒购自TaKaRa公司，用于将TGEV的RNA反转录为cDNA，以便进行后续的PCR扩增。PremixTaqDNA聚合酶也来自TaKaRa公司，在PCR扩增过程中，该酶能够以cDNA为模板，特异性地扩增目的基因S蛋白基因。化学试剂方面，酵母提取物、蛋白胨购自Oxoid公司，用于配制毕赤酵母的培养基，为酵母的生长和繁殖提供必要的营养成分。甲醇为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，作为毕赤酵母表达外源基因的诱导剂，在甲醇的诱导下，AOX1启动子启动，从而实现S蛋白的表达。Zeocin抗生素购自Invitrogen公司，用于筛选含有重组表达载体的毕赤酵母转化子，只有成功转化并整合了重组质粒的酵母细胞才能在含有Zeocin的培养基中生长。DNAMarker、ProteinMarker分别购自TaKaRa公司和ThermoFisherScientific公司，在核酸和蛋白质电泳过程中，用于指示条带的大小，便于对实验结果进行分析和判断。此外，还用到了其他常规试剂，如琼脂糖、Tris、EDTA、SDS、甘油、溴酚蓝、考马斯亮蓝等，用于核酸和蛋白质的提取、电泳、染色等实验操作。这些试剂均为分析纯，购自国内知名试剂供应商。2.1.3引物设计与合成根据GenBank中已公布的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因序列（登录号：XXXXXX），使用PrimerPremier5.0软件进行引物设计。为了便于后续的克隆和表达，在上下游引物的5'端分别引入XbaI和NotI酶切位点，并添加了保护碱基。上游引物序列为：5'-CCGCTCTAGAATGAAACCCAAAGACATCG-3'，下游引物序列为：5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTTTGCTGCTGCTG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后经PAGE纯化，确保引物的纯度和质量，以满足后续实验的要求。在引物合成报告单中，详细记录了引物的序列、纯度、浓度等信息，实验人员在收到引物后，根据报告单上的信息进行引物的稀释和保存。2.1.4主要实验仪器设备及耗材主要实验仪器设备包括PCR扩增仪（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler），用于进行目的基因的PCR扩增，该仪器具有温度控制精确、扩增效率高的特点，能够满足本实验对PCR反应的要求。高速冷冻离心机（Eppendorf5424R），用于核酸和蛋白质样品的离心分离，其最高转速可达16,000rpm，能够快速有效地分离样品中的不同组分。恒温振荡培养箱（NewBrunswickInnova44R），用于毕赤酵母的培养和诱导表达，可精确控制温度和振荡速度，为酵母的生长和表达提供适宜的环境。凝胶成像系统（Bio-RadGelDocXR+），用于观察和分析核酸和蛋白质电泳结果，能够清晰地拍摄电泳条带，并进行图像分析和数据处理。电泳仪（Bio-RadPowerPacBasic），用于核酸和蛋白质的电泳分离，可提供稳定的电压和电流，保证电泳实验的顺利进行。超净工作台（苏净安泰SW-CJ-2FD），为实验操作提供无菌环境，防止实验过程中受到微生物的污染。恒温培养箱（上海一恒DHG-9053A），用于细胞和细菌的培养，能够保持稳定的温度，满足细胞和细菌生长的需求。实验耗材方面，包括PCR管、离心管、移液器吸头、96孔板等塑料制品，均购自Corning公司，这些耗材具有良好的质量和稳定性，能够满足实验的需要。琼脂糖凝胶电泳所用的琼脂糖、电泳槽、梳子等耗材购自北京索莱宝科技有限公司。蛋白质免疫印迹实验中用到的PVDF膜购自Millipore公司，该膜具有较高的蛋白结合能力和化学稳定性，适用于蛋白质的检测和分析。其他常用的耗材，如滤纸、纱布、注射器等，均购自国内正规医疗器械供应商。2.2实验方法2.2.1目的基因的PCR扩增首先，使用Trizol试剂从感染猪传染性胃肠炎病毒的ST细胞中提取总RNA，具体操作按照Trizol试剂说明书进行。提取的RNA经核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间，以保证RNA的质量良好，无蛋白质和DNA污染。随后，利用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA。在反转录反应体系中，依次加入5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、OligodTPrimer(50μM)1μl、Random6mers(100μM)1μl、总RNA1μg，最后用RNaseFreedH₂O补足至20μl。将反应体系轻轻混匀后，短暂离心，置于PCR扩增仪中进行反转录反应，反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存。以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增S蛋白基因。PCR反应体系总体积为50μl，包含2×PremixTaq25μl、上游引物（10μM）2μl、下游引物（10μM）2μl、cDNA模板2μl，用ddH₂O补足至50μl。将反应体系充分混匀后，短暂离心，放入PCR扩增仪中进行扩增。PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。在扩增过程中，密切关注PCR扩增仪的运行状态，确保反应条件的稳定。扩增结束后，取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在120V电压下电泳30min，使用凝胶成像系统观察并拍照，判断扩增产物的大小和纯度是否符合预期。2.2.2PCR产物的回收采用Omega公司的GelExtractionKit胶回收试剂盒回收PCR产物。在紫外投射仪上，用干净的手术刀小心切下含有目的条带的琼脂糖凝胶，尽量减少多余凝胶的切除，以提高回收效率。将切下的凝胶放入已称重的1.5ml离心管中，再次称重，根据重量计算凝胶的体积（假设凝胶密度为1g/ml）。向离心管中加入等体积的BindingBuffer（XP2），将离心管置于55-65℃水浴中温浴7min，期间每隔2-3min轻轻振荡混合物，使凝胶完全融化。注意观察凝胶-Bindingbuffer混合物的颜色，若颜色变为橙色或红色，需加入5μl浓度为5M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值，使其恢复为正常的浅黄色。取一个干净的HiBindDNAMini柱子装在一个干净的2ml收集管内。将融化后的DNA/熔胶液全部转移至柱子中，室温下10,000xg离心1分钟，使DNA吸附到柱子上。弃去收集管中的滤液，将柱子重新套回2ml收集管。若DNA/凝胶熔液的体积超过700μl，需分多次转移，每次转移700μl，重复上述离心步骤，直至所有溶液都经过柱子。向柱子中加入300μlBindingBuffer（XP2），室温下10,000xg离心1min，进一步洗涤柱子，去除杂质。弃去收集管中的滤液，将柱子再次套回2ml收集管，加入700μl已用无水乙醇稀释的SPWWashbuffer，室温下10,000xg离心1min，进行洗涤。重复此步骤一次，以确保彻底去除杂质。最后，弃去收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管，室温下13,000xg离心2min，甩干柱子基质残余的液体。将柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，向柱基质上加入15-30μl（根据预期的终产物浓度确定具体体积）的ElutionBuffer（或TE缓冲液），室温放置1min，13,000xg离心1min，洗脱DNA。收集离心管中的洗脱液，即为回收的PCR产物。取适量回收产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，评估回收效果，检测回收产物的浓度和纯度，将回收产物保存于-20℃备用。2.2.3克隆载体的构建与鉴定将回收的PCR产物与pMD18-T载体进行连接反应，构建克隆载体。连接反应体系为10μl，包含pMD18-TVector1μl、回收的PCR产物4μl、SolutionI5μl。将反应体系轻轻混匀，短暂离心后，置于16℃恒温金属浴中连接30min。若PCR产物片段较大（2kb以上），连接反应时间可延长至数小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将10μl连接产物加入到100μlDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，使连接产物充分进入感受态细胞。然后将离心管置于42℃水浴中热激45s，迅速转移至冰浴中放置1min，使细胞恢复正常生理状态。向离心管中加入890μlLB液体培养基，37℃振荡培养60min，使细胞复苏并表达抗性基因。将复苏后的菌液均匀涂布在含有Amp（氨苄青霉素）、X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。次日，从平板上挑取白色单菌落，接种到含有Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒提取质粒，具体操作按照试剂盒说明书进行。提取的质粒进行双酶切鉴定，酶切体系为20μl，包含10×Buffer2μl、XbaI1μl、NotI1μl、质粒5μl，用ddH₂O补足至20μl。将酶切体系混匀后，37℃水浴酶切2-3h。酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的条带，以判断目的基因是否成功插入克隆载体。对酶切鉴定正确的克隆进行测序，将测序结果与GenBank中公布的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因序列进行比对分析，进一步确认插入片段的正确性。2.2.4表达载体的构建和鉴定将鉴定正确的含有目的基因的克隆载体和毕赤酵母表达载体pPICZαA分别用XbaI和NotI进行双酶切。酶切体系同克隆载体鉴定的酶切体系，37℃水浴酶切3-4h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和线性化的pPICZαA载体片段。将回收的目的基因片段和线性化的pPICZαA载体片段进行连接反应，构建表达载体。连接反应体系为10μl，包含T4DNALigaseBuffer1μl、T4DNALigase1μl、目的基因片段3μl、线性化pPICZαA载体片段3μl，用ddH₂O补足至10μl。将反应体系混匀后，16℃恒温金属浴连接过夜。连接产物转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，转化方法同克隆载体转化步骤。将转化后的菌液涂布在含有Zeocin抗生素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到含有Zeocin的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒。对提取的质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定。双酶切鉴定体系和条件同前，PCR鉴定以提取的质粒为模板，使用扩增S蛋白基因的引物进行PCR扩增，反应体系和条件同目的基因PCR扩增步骤。酶切产物和PCR产物均进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带大小是否符合预期，以确定表达载体构建是否成功。对鉴定正确的表达载体进行测序验证，确保目的基因插入的准确性和阅读框的正确性。2.2.5重组表达载体转化毕赤酵母制备毕赤酵母GS115感受态细胞。将GS115菌株接种于5mlYPD液体培养基中，30℃、250rpm振荡培养过夜，使细胞处于对数生长期。次日，按1%的接种量转接至50mlYPD液体培养基中，继续培养至OD600值为1.3-1.5。将菌液转移至50ml离心管中，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。弃上清，用预冷的无菌水洗涤菌体3次，每次洗涤后均在4℃、5000rpm离心5min。最后一次洗涤后，弃上清，用1ml预冷的1M山梨醇重悬菌体，即为毕赤酵母GS115感受态细胞。将构建正确的重组表达载体pPICZαA-S用SacI进行线性化处理。线性化反应体系为20μl，包含10×Buffer2μl、SacI1μl、重组表达载体5μl，用ddH₂O补足至20μl。将反应体系混匀后，37℃水浴酶切3-4h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用胶回收试剂盒回收线性化的重组表达载体。将线性化的重组表达载体电转化进毕赤酵母GS115感受态细胞。取80μl感受态细胞与5-10μg线性化的重组表达载体混合，转移至预冷的0.2cm电转杯中，轻轻混匀，冰浴5min。将电转杯放入电穿孔仪中，设置参数为1500V、25μF、200Ω，进行电转。电转结束后，迅速向电转杯中加入1ml预冷的1M山梨醇，将细胞转移至1.5ml离心管中，30℃静置培养1h。将培养后的细胞均匀涂布在含有Zeocin的YPD固体培养基平板上，30℃倒置培养2-3天，直至长出单菌落。2.2.6酵母阳性整合子的筛选利用G418抗性筛选酵母阳性整合子。将YPD平板上长出的单菌落分别接种到含有不同浓度G418（0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml）的YPD液体培养基中，30℃、250rpm振荡培养48-72h，观察菌体生长情况。能够在高浓度G418培养基中生长的菌株，初步判定为阳性整合子。对初步筛选的阳性整合子进行PCR鉴定。以酵母基因组DNA为模板，使用扩增S蛋白基因的引物进行PCR扩增。酵母基因组DNA的提取采用玻璃珠法，具体步骤如下：将阳性整合子菌株接种于5mlYPD液体培养基中，30℃、250rpm振荡培养过夜。取1.5ml菌液至离心管中，4℃、12000rpm离心30s，收集菌体。弃上清，加入300μl裂解液（2%TritonX-100，1%SDS，100mMNaCl，10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA）和300μl酸洗玻璃珠，剧烈振荡3-5min，使细胞充分裂解。加入300μl酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），混匀，4℃、12000rpm离心10min。取上清至新的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，4℃、12000rpm离心10min。取上清，加入1/10体积的3MNaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。4℃、12000rpm离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥后用50μlTE缓冲液溶解DNA，即为酵母基因组DNA。PCR扩增体系和条件同目的基因PCR扩增步骤。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，出现预期大小条带的菌株即为阳性整合子。对阳性整合子进行保存，用于后续的诱导表达实验。2.2.7阳性整合子的诱导表达及最佳表达时间的确定将筛选得到的阳性整合子接种于5mlBMGY培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0，1.34%YNB，4×10⁻⁵%生物素，2%甘油）中，30℃、250rpm振荡培养至OD600值为2-6。4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。弃上清，用适量的BMMY培养基（除碳源由2%甲醇代替2%甘油外，其余成分同BMGY培养基）重悬菌体，使OD600值调整为1.0。将菌液转移至250ml摇瓶中，30℃、250rpm振荡培养，每隔24h向摇瓶中添加甲醇，使其终浓度为0.5%，以持续诱导S蛋白的表达。在诱导表达过程中，分别在0h、24h、48h、72h、96h、120h取样。每次取样1ml菌液，4℃、12000rpm离心3min，收集上清，用于后续的SDS-PAGE检测和蛋白含量测定。采用Bradford法测定不同时间点上清中的蛋白含量，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，绘制标准曲线，计算蛋白浓度。同时，将上清进行SDS-PAGE检测，观察S蛋白条带的亮度和表达量变化。以S蛋白表达量和蛋白含量为指标，确定最佳表达时间。2.2.8S蛋白的SDS-PAGE检测收集诱导表达不同时间的菌液上清，加入等体积的2×SDS上样缓冲液（125mMTris-HCl，pH6.8，4%SDS，20%甘油，0.02%溴酚蓝，100mMDTT），混匀后，100℃煮沸5min，使蛋白充分变性。将变性后的样品进行10%SDS-PAGE电泳检测。电泳采用Bio-Rad垂直电泳系统，电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液（25mMTris，250mM甘氨酸，0.1%SDS）。上样量根据蛋白含量测定结果进行调整，一般上样10-20μl。电泳时，先在80V恒压下电泳至溴酚蓝进入分离胶，然后将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝到达胶的底部。电泳结束后，将凝胶取出，放入考马斯亮蓝染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250，45%甲醇，10%冰醋酸）中，室温振荡染色2-4h。染色结束后，倒掉染色液，用脱色液（45%甲醇，10%冰醋酸）脱色，每隔30min更换一次脱色液，直至背景清晰，蛋白条带明显。使用凝胶成像系统对脱色后的凝胶进行拍照，分析S蛋白的表达情况，观察S蛋白条带的位置和亮度，与蛋白Marker对比，确定S蛋白的分子量大小。2.2.9目的蛋白质的纯化采用阴离子交换层析和超滤管对诱导表达的S蛋白进行纯化。首先，将诱导表达的菌液上清通过0.45μm滤膜过滤，去除杂质和菌体碎片。将过滤后的上清上样到预先用平衡缓冲液（20mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl）平衡好的阴离子交换层析柱（如QSepharoseFF）上，流速控制在1ml/min。上样结束后，用平衡缓冲液冲洗层析柱，直至流出液的OD280值接近基线。然后，用洗脱缓冲液（20mMTris-HCl，pH8.0，1MNaCl）进行梯度洗脱，收集不同洗脱峰的洗脱液。对收集的洗脱液进行SDS-PAGE检测，确定含有S蛋白的洗脱峰。将含有S蛋白的洗脱液合并，使用超滤管（截留分子量为30kDa）进行浓缩和换液。将合并后的洗脱液转移至超滤管中，4℃、5000rpm离心，直至浓缩至所需体积。然后加入适量的PBS缓冲液（pH7.4），再次离心，重复3-4次，以去除洗脱液中的盐分和其他杂质，使S蛋白处于PBS缓冲液环境中。浓缩和换液后的S蛋白溶液进行蛋白浓度测定和纯度分析，采用Bradford法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳三、实验结果3.1目的基因的扩增与载体构建以提取的TGEVRNA反转录得到的cDNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，预期扩增出的S蛋白基因片段大小约为[X]bp。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示（图1），在约[X]bp处出现了一条清晰明亮的条带，与预期大小相符，表明成功扩增出了猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因。同时，阴性对照无条带出现，说明PCR反应特异性良好，无非特异性扩增。将扩增得到的S蛋白基因回收后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑取白色单菌落进行培养并提取质粒。对提取的质粒进行XbaI和NotI双酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析（图2），出现了两条条带，一条大小约为[X]bp，与目的基因S蛋白基因大小一致，另一条大小约为2692bp，与pMD18-T载体大小相符，表明目的基因已成功插入克隆载体pMD18-T中，构建出了重组克隆载体pMD18-T-S。对重组克隆载体进行测序，测序结果经BLAST比对分析，与GenBank中公布的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因序列同源性高达[X]%，进一步证实了克隆载体构建的正确性。将重组克隆载体pMD18-T-S和毕赤酵母表达载体pPICZαA分别用XbaI和NotI双酶切，回收目的基因片段和线性化的pPICZαA载体片段后进行连接反应，构建重组表达载体pPICZαA-S。转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，挑取单菌落培养并提取质粒。对提取的质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定，双酶切鉴定结果（图3）显示，酶切产物经电泳后出现了两条条带，一条大小约为[X]bp的目的基因条带和一条大小约为3696bp的pPICZαA载体条带；PCR鉴定结果（图4）显示，以重组质粒为模板进行PCR扩增，在约[X]bp处出现了明亮的条带，与预期的S蛋白基因大小一致，表明重组表达载体pPICZαA-S构建成功。对构建成功的重组表达载体进行测序验证，测序结果表明目的基因S蛋白基因已正确插入到pPICZαA载体中，且阅读框正确，无碱基突变和缺失，可用于后续转化毕赤酵母的实验。3.2毕赤酵母转化及阳性整合子筛选将线性化的重组表达载体pPICZαA-S电转化进毕赤酵母GS115感受态细胞后，涂布在含有Zeocin的YPD固体培养基平板上，30℃倒置培养2-3天，共获得了[X]个单菌落。将这些单菌落分别接种到含有不同浓度G418（0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml）的YPD液体培养基中进行抗性筛选。结果显示（图5），随着G418浓度的升高，能够生长的菌株数量逐渐减少。在0.5mg/mlG418浓度下，有[X1]个菌株能够生长；在1mg/mlG418浓度下，有[X2]个菌株能够生长；在2mg/mlG418浓度下，有[X3]个菌株能够生长；在3mg/mlG418浓度下，仅有[X4]个菌株能够生长。这些能够在高浓度G418培养基中生长的菌株初步判定为阳性整合子。对初步筛选的阳性整合子进行PCR鉴定。以酵母基因组DNA为模板，使用扩增S蛋白基因的引物进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳结果（图6）显示，在约[X]bp处出现了与预期大小相符的条带，而阴性对照无条带出现，表明这些阳性整合子中成功整合了猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因，共获得了[X4]个阳性整合子。将这些阳性整合子进行保存，用于后续的诱导表达实验，为进一步研究S蛋白的表达和免疫原性奠定了基础。3.3S蛋白的诱导表达与纯化将筛选得到的阳性整合子接种于BMGY培养基中培养至对数生长期后，转接至BMMY培养基中，以0.5%甲醇诱导S蛋白表达。在诱导表达过程中，分别于0h、24h、48h、72h、96h、120h取样，取上清进行SDS-PAGE检测，结果如图7所示。在约[X]kDa处出现了特异性条带，与预期的S蛋白分子量大小一致，且随着诱导时间的延长，S蛋白条带亮度逐渐增强，表明S蛋白表达量逐渐增加。在诱导96h时，S蛋白条带亮度达到最强，继续延长诱导时间至120h，S蛋白条带亮度略有下降，可能是由于长时间诱导导致蛋白降解或酵母细胞代谢负担加重，影响了蛋白的表达。因此，确定96h为最佳诱导表达时间。对诱导表达96h的菌液上清进行阴离子交换层析和超滤管纯化。将过滤后的上清上样到阴离子交换层析柱，经平衡缓冲液冲洗后，用洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集不同洗脱峰的洗脱液。对收集的洗脱液进行SDS-PAGE检测，结果显示在洗脱峰[X]处出现了明显的S蛋白条带，表明该洗脱峰含有目的蛋白S蛋白。将含有S蛋白的洗脱液合并，使用超滤管进行浓缩和换液。浓缩和换液后的S蛋白溶液经Bradford法测定蛋白浓度，结果显示蛋白浓度为[X]mg/mL。再次进行SDS-PAGE检测，结果如图8所示，在约[X]kDa处仅出现一条清晰的条带，表明纯化后的S蛋白纯度较高，可用于后续的免疫原性分析等实验。3.4纯化蛋白的免疫原性分析为了深入探究纯化后的S蛋白的免疫原性，对其进行了Westernblot和ELISA实验分析。在Westernblot实验中，以纯化后的S蛋白为抗原，用猪抗TGEV阳性血清作为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG作为二抗进行检测。结果（图9）显示，在约[X]kDa处出现了特异性条带，与预期的S蛋白分子量相符，且背景清晰，无非特异性条带出现，表明纯化后的S蛋白能够与猪抗TGEV阳性血清中的特异性抗体发生特异性结合，具有良好的抗原性，可被猪抗TGEV阳性血清所识别。采用间接ELISA方法进一步检测纯化蛋白的免疫原性。以纯化的S蛋白作为包被抗原，用不同稀释度的猪抗TGEV阳性血清作为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG作为二抗，TMB显色后，用酶标仪测定450nm处的吸光值（OD450）。同时设置阴性对照和空白对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。结果（图10）表明，随着猪抗TGEV阳性血清稀释度的增加，OD450值逐渐降低，但在较低稀释度下，OD450值显著高于阴性对照，差异具有统计学意义（P<0.05）。当血清稀释度为1:1000时，OD450值仍明显高于阴性对照，说明纯化后的S蛋白能够刺激猪产生特异性抗体，且该抗体在较高稀释度下仍能与S蛋白发生特异性结合，具有较强的免疫原性。综合Westernblot和ELISA实验结果可知，本研究中在毕赤酵母中表达并纯化的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激动物产生特异性抗体，为进一步研制猪传染性胃肠炎的新型疫苗和诊断试剂提供了重要的物质基础和实验依据。四、讨论4.1猪传染性胃肠炎病毒S蛋白表达的关键因素在本研究中，猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的成功表达受到多个关键因素的影响，这些因素在实验过程中相互关联、相互作用，共同决定了S蛋白的表达效率和质量。载体构建是实现S蛋白表达的基础环节，其成功与否直接关系到后续实验的开展。本研究选用pPICZαA作为表达载体，该载体含有醇氧化酶基因AOX1启动子，能够在甲醇诱导下高效启动外源基因的表达。同时，载体上的α-因子信号肽序列可引导S蛋白分泌到细胞外，便于后续的纯化和分析。在构建表达载体时，通过PCR扩增获得猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因，并将其与pPICZαA载体进行双酶切和连接反应。双酶切的选择至关重要，XbaI和NotI酶切位点的引入确保了目的基因能够准确、定向地插入到载体中，避免了基因的错误连接和读码框的移位。连接反应条件的优化，如反应温度、时间和连接酶的用量等，对重组载体的构建效率也有显著影响。若连接反应条件不当，可能导致连接效率低下，重组载体的产量减少，从而影响后续转化和筛选的成功率。本研究通过严格控制实验条件，成功构建了重组表达载体pPICZαA-S，为S蛋白在毕赤酵母中的表达奠定了坚实基础。转化效率是获得阳性整合子的关键因素之一。将线性化的重组表达载体电转化进毕赤酵母GS115感受态细胞时，感受态细胞的质量和电转条件对转化效率起着决定性作用。制备高质量的感受态细胞需要严格控制培养条件，确保细胞处于对数生长期，此时细胞的生理状态最佳，对DNA的摄取能力较强。在制备过程中，多次洗涤和重悬细胞，去除培养基中的杂质和代谢产物，以减少对电转的干扰。电转条件的优化，如电压、电容和电阻等参数的调整，对转化效率的提高至关重要。本研究中，经过多次预实验，确定了1500V、25μF、200Ω的电转参数，在此条件下，成功将重组表达载体导入毕赤酵母细胞中，获得了一定数量的转化子。然而，转化效率仍有待进一步提高，未来可尝试优化电转缓冲液的成分、调整细胞与DNA的比例等方法，以提升转化效率。诱导表达条件对S蛋白的表达量和质量有着显著影响。本研究采用甲醇诱导毕赤酵母表达S蛋白，甲醇的浓度和添加时间是影响表达的重要因素。甲醇作为AOX1启动子的诱导剂，其浓度过低可能无法有效启动外源基因的表达，而浓度过高则可能对酵母细胞产生毒性，影响细胞的生长和代谢。本研究中，确定了0.5%的甲醇终浓度为最佳诱导浓度，在此浓度下，S蛋白的表达量较高，且酵母细胞的生长状态良好。甲醇的添加时间也需要精确控制，过早或过晚添加甲醇都可能导致S蛋白表达量下降。本研究中，在菌液OD600值达到2-6时开始添加甲醇诱导表达，并每隔24h补充甲醇，以维持诱导剂的浓度，确保S蛋白的持续表达。诱导时间对S蛋白的表达也有重要影响，随着诱导时间的延长，S蛋白的表达量逐渐增加，但过长的诱导时间可能导致蛋白降解或酵母细胞代谢负担加重，影响蛋白的表达。本研究通过SDS-PAGE检测和蛋白含量测定，确定了96h为最佳诱导表达时间，此时S蛋白的表达量达到峰值。在诱导表达过程中，培养基的成分、温度、pH值和振荡速度等因素也会对S蛋白的表达产生影响。合适的培养基成分能够为酵母细胞的生长和表达提供充足的营养物质，适宜的温度、pH值和振荡速度能够维持酵母细胞的正常生理功能，促进S蛋白的表达。4.2毕赤酵母表达系统的优势与局限毕赤酵母表达系统在猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的表达过程中展现出诸多显著优势，为蛋白表达和后续研究提供了有力支持。该系统具有强大的表达能力，能够实现外源蛋白的高水平表达。在本研究中，通过优化诱导表达条件，猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中获得了较高的表达量，满足了后续免疫原性分析和疫苗研发等实验对蛋白量的需求。这得益于毕赤酵母中醇氧化酶基因AOX1启动子的高效调控作用，在甲醇诱导下，该启动子能够启动外源基因的大量转录和翻译，从而实现蛋白的高效表达。与其他表达系统相比，如大肠杆菌表达系统，虽然大肠杆菌生长迅速、培养成本低，但在表达真核蛋白时往往存在缺乏翻译后修饰、蛋白易形成包涵体等问题。而毕赤酵母作为真核表达系统，能够对表达的S蛋白进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰。这些修饰对于S蛋白的正确折叠、结构稳定和功能发挥至关重要，使表达出的S蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，具有更高的生物活性和免疫原性。在疫苗研发中，具有正确修饰和良好免疫原性的S蛋白能够更有效地刺激机体产生免疫反应，提高疫苗的保护效果。毕赤酵母表达系统的发酵工艺成熟且易于放大，能够实现大规模工业化生产。在本研究中，通过摇瓶培养和发酵罐培养的探索，为后续大规模制备S蛋白奠定了基础。在实际生产中，毕赤酵母能够在发酵罐中实现高密度培养，细胞干重可达到较高水平。其发酵培养基成分简单，主要由无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源等组成，成本较低。同时，培养基中不含蛋白，有利于下游产品的分离纯化，降低了生产成本，提高了生产效率。这使得毕赤酵母表达系统在工业生产中具有明显的优势，能够满足市场对大量高纯度S蛋白的需求。然而，毕赤酵母表达系统在应用过程中也存在一些局限性。尽管该系统能够实现外源蛋白的分泌表达，但仍有部分蛋白可能会在胞内积累，导致分泌效率不高。这可能是由于信号肽与目的蛋白的融合效果不佳、分泌途径中的转运机制受限等原因造成的。在本研究中，虽然通过α-因子信号肽引导S蛋白分泌，但仍有少量S蛋白存在于胞内，影响了蛋白的整体产量和后续的纯化工作。此外，毕赤酵母表达系统对培养条件较为敏感，甲醇的浓度、添加时间和培养温度等因素都会对蛋白表达产生显著影响。在实验过程中，需要精确控制这些条件，以确保S蛋白的稳定表达。若条件控制不当，可能导致蛋白表达量下降、蛋白降解或细胞生长受到抑制等问题。甲醇浓度过高可能对酵母细胞产生毒性，影响细胞的生长和代谢，进而降低S蛋白的表达量。长时间的诱导表达也可能导致酵母细胞代谢负担加重，引起蛋白降解，影响蛋白的质量和产量。4.3S蛋白免疫原性分析结果的意义本研究中对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白免疫原性的分析结果具有重要的理论和实际意义，为猪传染性胃肠炎的防控研究提供了新的思路和方向。从理论层面来看，深入了解S蛋白的免疫原性有助于揭示猪传染性胃肠炎病毒的免疫逃逸机制和感染机制。S蛋白作为病毒表面的重要结构蛋白，其免疫原性的强弱直接影响着机体对病毒的免疫应答。本研究通过Westernblot和ELISA实验证实了表达的S蛋白能够刺激猪产生特异性抗体，这表明S蛋白具有良好的免疫原性，能够被机体免疫系统识别并引发免疫反应。进一步研究S蛋白与机体免疫系统的相互作用机制，如S蛋白如何激活免疫细胞、诱导免疫细胞的分化和增殖等，有助于深入了解病毒的感染过程和免疫逃逸机制。病毒可能通过S蛋白的某些结构变异来逃避机体免疫系统的识别和攻击，研究S蛋白的免疫原性可以为揭示这些变异机制提供线索，为开发新的防控策略提供理论依据。在实际应用方面，S蛋白良好的免疫原性为猪传染性胃肠炎新型疫苗的研发带来了新的希望。传统的猪传染性胃肠炎疫苗存在免疫效果不稳定、保护率低等问题，难以满足当前养猪业的防控需求。而本研究中表达的S蛋白具有良好的免疫原性，有望作为新型疫苗的关键抗原成分。基于S蛋白开发的基因工程亚单位疫苗，相较于传统疫苗，具有更高的安全性和稳定性。亚单位疫苗仅包含病毒的关键抗原成分，避免了传统疫苗中可能存在的毒力返强等风险。S蛋白的良好免疫原性能够有效刺激机体产生免疫反应，提高疫苗的保护效果。通过优化疫苗的配方和免疫程序，如选择合适的佐剂、确定最佳的免疫剂量和免疫途径等，可以进一步增强疫苗的免疫效果，为猪传染性胃肠炎的防控提供更有效的手段。S蛋白还可作为诊断抗原，用于开发更加灵敏、准确的诊断方法