猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗制备与模拟表位鉴定研究

猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗制备与模拟表位鉴定研究一、引言1.1研究背景猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）引起的一种对全球养猪业造成严重打击的急性、高度接触性肠道传染病。自1971年在英国首次被报道以来，PEDV迅速在世界多个国家和地区广泛传播，给养猪业带来了沉重的经济负担。PEDV对养猪业的危害主要体现在以下几个方面：首先，PEDV可感染各种年龄的猪，其中哺乳仔猪最为易感，发病率和死亡率可高达80%-100%。患病仔猪主要表现为呕吐、腹泻、脱水等症状，严重影响其生长发育，即使幸存下来，也可能成为僵猪，降低养殖效益。其次，成年猪感染后症状相对较轻，但也会出现腹泻、厌食等症状，导致生产性能下降，如母猪泌乳减少、繁殖性能降低，育肥猪生长缓慢、料肉比升高等。此外，猪流行性腹泻的爆发还会打乱猪场的正常生产节律，增加养殖成本和管理难度。从经济角度来看，猪流行性腹泻给养猪业带来的损失巨大。一方面，仔猪的大量死亡直接减少了猪只的存栏量，降低了养殖收益；另一方面，为了防控疫情，养殖场需要投入大量的人力、物力和财力，包括疫苗接种、药物治疗、消毒防疫等措施，进一步增加了养殖成本。PEDV属于冠状病毒科α冠状病毒属，基因组全长约28kb，为线性单链正股RNA，包含5’帽子结构、3’poly(A)尾和7个开放阅读框（ORF）。其中，核衣壳蛋白（NucleocapsidProtein，N）是PEDV的主要结构蛋白之一，由ORF6编码，相对分子质量约为58kDa。N蛋白在病毒粒子中含量丰富，与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒的复制、转录和装配过程中发挥着重要作用。同时，N蛋白具有较强的免疫原性，猪在感染PEDV的早期，体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体。因此，N蛋白不仅是研究PEDV致病机制的关键靶点，也是开发诊断试剂和疫苗的重要候选抗原。单克隆抗体（MonoclonalAntibody，mAb）技术是现代生物技术领域的一项重要成果，具有特异性强、灵敏度高、可大量制备等优点。制备针对PEDVN蛋白的单克隆抗体，不仅可以用于建立快速、准确的诊断方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光试验（IFA）、免疫印迹试验（WesternBlot）等，实现对PEDV感染的早期检测和疫情监测，及时采取防控措施，减少经济损失；还能够深入研究N蛋白的结构与功能，为揭示PEDV的致病机制提供有力工具，有助于开发新型抗病毒药物和疫苗；此外，单克隆抗体在疾病治疗方面也具有潜在的应用价值，为猪流行性腹泻的防治提供新的思路和方法。模拟表位是指能够模拟抗原表位与抗体特异性结合的小分子多肽或其他化合物。通过噬菌体展示技术等方法筛选PEDVN蛋白的模拟表位，对于深入了解N蛋白的抗原结构、抗原表位与抗体的相互作用机制具有重要意义。这有助于优化诊断试剂和疫苗的设计，提高其特异性和敏感性，为猪流行性腹泻的防控提供更有效的技术手段。同时，模拟表位还可以作为新型疫苗的候选抗原，用于开发更加安全、有效的基因工程疫苗，为养猪业的健康发展提供保障。综上所述，制备猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗并鉴定其模拟表位，对于深入了解PEDV的致病机制、建立快速准确的诊断方法、开发有效的防控措施具有重要的理论和实践意义，能够为养猪业的健康发展提供有力支持，减少猪流行性腹泻给养猪业带来的经济损失。1.2研究目的和意义本研究旨在通过杂交瘤技术制备针对猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体，并利用噬菌体展示技术鉴定其模拟表位。这一研究具有重要的理论和实践意义，具体如下：理论意义：通过制备针对PEDVN蛋白的单克隆抗体，能够深入研究N蛋白的结构与功能，为揭示PEDV的致病机制提供有力工具。鉴定N蛋白的模拟表位，有助于深入了解N蛋白的抗原结构、抗原表位与抗体的相互作用机制，丰富对PEDV免疫反应的认识，为后续相关研究奠定基础。实践意义：针对PEDVN蛋白的单克隆抗体，可用于建立快速、准确的诊断方法，如ELISA、IFA、WesternBlot等，实现对PEDV感染的早期检测和疫情监测，及时采取防控措施，减少经济损失。模拟表位的鉴定有助于优化诊断试剂和疫苗的设计，提高其特异性和敏感性，为猪流行性腹泻的防控提供更有效的技术手段。此外，模拟表位还可以作为新型疫苗的候选抗原，用于开发更加安全、有效的基因工程疫苗，为养猪业的健康发展提供保障。1.3国内外研究现状自1971年猪流行性腹泻在英国首次被发现以来，国内外学者围绕猪流行性腹泻病毒（PEDV）展开了大量研究，涵盖了病毒基因特征、流行特点以及防治方法等多个领域。在基因特征研究方面，国内外学者对PEDV的全基因组测序及分析已较为深入。PEDV属于冠状病毒科α冠状病毒属，基因组全长约28kb，为线性单链正股RNA，包含5’帽子结构、3’poly(A)尾和7个开放阅读框（ORF）。其中ORF1a和ORF1b占据基因组的2/3，编码非结构多聚蛋白1a和1ab，经3C样蛋白酶和类木瓜蛋白酶裂解为16种非结构蛋白；另外1/3基因组主要编码4种结构蛋白，分别为棘突蛋白S、包膜蛋白E、囊膜蛋白M和核衣壳蛋白N。研究发现，S基因是PEDV变异的关键基因，其变异与病毒的致病性、免疫原性密切相关。根据S基因的遗传进化分析，PEDV毒株可分为GⅠ型和GⅡ型，其中GⅠ型又分为GⅠa和GⅠb亚型，GⅡ型又分为GⅡa和GⅡb亚型。当前我国优势流行毒株为GⅡ变异型。2014年，美国首次分离到一株低致病性PEDV-OH851株，该毒株S基因存在多个缺失和插入位点，这种新出现的毒株被命名为“S-INDEL”毒株。然而，对于PEDV基因变异的分子机制，尤其是在不同宿主和环境因素影响下的变异规律，仍有待进一步深入研究。不同地区流行毒株的基因特征存在差异，其对疫苗免疫效果的影响也需要更全面的评估。关于PEDV的流行特点，国内外研究表明，PEDV可感染各种年龄的猪，以哺乳仔猪最为易感，发病率和死亡率高，成年猪感染后症状相对较轻，但会影响生产性能。PEDV的传播途径主要包括消化道、呼吸道和接触传播，在猪场中传播迅速，可造成大规模的疫情爆发。该病的发生具有一定的季节性，通常于冬季11月至次年3月发病，但近年来季节性趋势有所减弱，夏季也有发病报道。2010年以来，高致病性PEDV变异毒株在全球范围内传播，我国多地猪场也爆发了大规模疫情，给养猪业带来了沉重打击。虽然对PEDV的流行规律有了一定认识，但对于病毒在猪场环境中的存活时间、传播范围的精准预测等方面，还缺乏有效的研究手段。随着养猪业规模化、集约化发展以及国际贸易往来的增加，PEDV的传播风险和流行趋势变得更加复杂，如何准确监测和预警疫情的发生，仍是亟待解决的问题。在防治方法上，疫苗免疫是防控PED的主要措施。现有商品化疫苗以传统灭活疫苗和弱毒疫苗为主，近年来，随着基因工程技术的发展，亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、重组活载体疫苗、转基因植物疫苗和核酸疫苗等新型疫苗的研究也取得了突破性进展。国内已有30余家生产企业获得PEDV疫苗的生产批准文号，其中以生产猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、PEDV二联疫苗居多，毒株以经典毒株CV777为主，但使用GⅠ群经典毒株CV777研制的疫苗对当前流行的GⅡ群毒株免疫保护力不足，因此，针对变异流行毒株的疫苗也陆续推出。在诊断技术方面，目前临床症状和组织病理学病变可用于初步诊断，结合病原学诊断或血清学诊断做出最终诊断。病原诊断技术包括病毒分离、免疫荧光检测（IF）、免疫组化检测（IHC）、抗原ELISA检测和病毒核酸RT-PCR检测等；血清学诊断技术包括间接免疫荧光抗体（IFA）试验、病毒中和试验（VNT）、抗体ELISA检测、流动微球免疫荧光法（FMIA）等。然而，现有的诊断方法在灵敏度、特异性、检测速度等方面仍存在一定的局限性，需要进一步改进和完善。针对PEDVN蛋白的研究，国内外学者也取得了一些进展。N蛋白在病毒粒子中含量丰富，与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒的复制、转录和装配过程中发挥着重要作用。同时，N蛋白具有较强的免疫原性，猪在感染PEDV的早期，体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体。因此，N蛋白不仅是研究PEDV致病机制的关键靶点，也是开发诊断试剂和疫苗的重要候选抗原。目前，已有研究通过原核表达、真核表达等方法获得了重组N蛋白，并利用其制备了多克隆抗体和单克隆抗体，用于PEDV的诊断和研究。然而，现有的N蛋白单抗在特异性、亲和力、稳定性等方面仍有待提高，且对于N蛋白的抗原表位和模拟表位的研究还不够深入，需要进一步开展相关工作。在模拟表位鉴定方面，噬菌体展示技术等方法已被应用于筛选PEDVN蛋白的模拟表位。通过筛选模拟表位，有助于深入了解N蛋白的抗原结构、抗原表位与抗体的相互作用机制，为优化诊断试剂和疫苗的设计提供依据。但目前筛选到的模拟表位数量有限，对其应用研究还处于初级阶段，需要进一步扩大筛选范围，深入研究模拟表位的生物学特性和应用效果。二、猪流行性腹泻病毒及N蛋白概述2.1PEDV的生物学特性2.1.1形态结构猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科α冠状病毒属，具有典型的冠状病毒形态特征。其病毒粒子呈多形性，多数趋于圆形，直径在95-190nm之间，包含长度约为18-23nm的纤突。这些纤突从病毒粒子表面呈放射状伸出，形态类似花瓣，其末端呈球状结构。在电子显微镜下观察，PEDV粒子具有一个位于中心的不透明电子体，这是病毒核衣壳所在位置，由核衣壳蛋白（N）与病毒基因组RNA紧密缠绕形成。病毒粒子的外层为包膜结构，包膜主要由脂质双分子层以及镶嵌其中的糖蛋白组成，包括纤突蛋白（S）、包膜蛋白（E）和膜蛋白（M）。其中，S蛋白是构成病毒纤突的主要成分，在病毒感染宿主细胞过程中发挥关键作用，它能够识别并结合宿主细胞表面的特异性受体，介导病毒与细胞膜的融合，从而使病毒核酸进入宿主细胞内。E蛋白和M蛋白则参与病毒的组装和出芽过程，对维持病毒粒子的结构完整性和稳定性具有重要意义。2.1.2基因组结构PEDV的基因组为线性单链正股RNA，全长约28kb，不包括3’端的poly(A)尾。基因组5’端具有帽子结构（cap），这一结构在病毒mRNA的翻译起始、稳定性维持以及逃避宿主免疫系统识别等方面发挥着重要作用；3’端的poly(A)尾则与mRNA的稳定性、翻译效率以及病毒的复制过程密切相关。PEDV基因组包含至少7个开放阅读框（ORF），从5’端到3’端依次为编码复制酶多聚蛋白1ab（pp1ab）的ORF1a和ORF1b、纤突蛋白（S）基因、ORF3基因、包膜蛋白（E）基因、膜蛋白（M）基因和核衣壳蛋白（N）基因。ORF1a和ORF1b占据了基因组约2/3的长度，编码的多聚蛋白1a和1ab经3C样蛋白酶和类木瓜蛋白酶裂解后，可产生16种非结构蛋白（nsp1-nsp16）。这些非结构蛋白在病毒的复制、转录过程中发挥着至关重要的作用，例如nsp12具有RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）活性，负责以病毒基因组RNA为模板合成负链RNA，进而转录出子代病毒RNA和亚基因组mRNA；nsp14具有3'-5'外切酶活性和N7-甲基转移酶活性，3'-5'外切酶活性参与病毒基因组复制过程中的纠错功能，确保病毒基因组的准确性，N7-甲基转移酶活性则参与病毒mRNA的加帽修饰，影响病毒mRNA的稳定性和翻译效率。S基因编码的S蛋白是病毒表面的主要抗原蛋白，由1383个氨基酸组成，相对分子质量约为150-220kDa。S蛋白可分为S1和S2两个亚基，S1亚基位于N端，包含受体结合域（RBD），负责识别并结合宿主细胞表面的受体，决定了病毒的宿主范围和组织嗜性；S2亚基位于C端，主要参与病毒与宿主细胞膜的融合过程，促进病毒核酸进入宿主细胞。S蛋白的变异与病毒的致病性、免疫原性密切相关，是PEDV遗传进化和疫苗研发研究的关键靶点。ORF3基因编码一个非结构蛋白，其功能尚未完全明确，但研究表明ORF3蛋白与病毒的毒力、细胞凋亡调节等过程有关。E基因编码的E蛋白是一种小分子膜蛋白，由76个氨基酸组成，相对分子质量约为8.8kDa。E蛋白在病毒的组装和出芽过程中发挥重要作用，参与病毒粒子的形态发生和释放。M基因编码的M蛋白是病毒包膜中含量最丰富的蛋白，由226个氨基酸组成，相对分子质量约为27-32kDa。M蛋白具有多个跨膜结构域，参与病毒粒子的组装、出芽以及病毒包膜与核衣壳的相互作用，同时M蛋白还能介导机体产生干扰素，在抗病毒免疫反应中发挥一定作用。N基因编码的N蛋白由441个氨基酸组成，相对分子质量约为55-58kDa。N蛋白是病毒核衣壳的主要组成成分，与病毒基因组RNA紧密结合，在病毒的复制、转录和装配过程中发挥重要作用。同时，N蛋白具有较强的免疫原性，猪在感染PEDV的早期，体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体。2.1.3病毒的传播与致病机制PEDV的传播途径主要包括消化道传播、呼吸道传播和接触传播。消化道传播是最主要的传播方式，健康猪通过摄入被病毒污染的饲料、饮水或粪便等，病毒经口腔进入消化道，在小肠黏膜上皮细胞中吸附、侵入并大量繁殖。呼吸道传播也在一定程度上存在，病毒可通过气溶胶形式在空气中传播，健康猪吸入含有病毒的气溶胶后可感染发病。此外，接触传播也是重要的传播途径，包括猪与猪之间的直接接触，以及通过饲养人员、工具、车辆等间接接触传播。PEDV的宿主范围主要是猪，不同年龄、品种的猪均可感染，但哺乳仔猪最为易感，发病率和死亡率可高达80%-100%。成年猪感染后症状相对较轻，但也会出现腹泻、厌食等症状，影响生产性能。当PEDV侵入猪体后，首先通过S蛋白与小肠黏膜上皮细胞表面的受体结合，随后病毒包膜与细胞膜融合，病毒核酸进入细胞内。在细胞内，病毒基因组RNA首先翻译出复制酶多聚蛋白，经裂解后产生一系列非结构蛋白，这些非结构蛋白以病毒基因组RNA为模板合成负链RNA，进而转录出子代病毒RNA和亚基因组mRNA。亚基因组mRNA翻译出病毒的结构蛋白和非结构蛋白，新合成的病毒核酸与结构蛋白在细胞内组装成新的病毒粒子，通过出芽方式释放到细胞外，继续感染其他细胞。随着病毒在小肠黏膜上皮细胞中的大量繁殖，导致小肠绒毛萎缩、变短、脱落，肠上皮细胞受损，消化吸收功能严重障碍。同时，病毒感染还会引发肠道炎症反应，刺激肠道分泌大量液体，导致腹泻、脱水等症状的出现。此外，病毒感染还可能引起机体的免疫反应异常，导致免疫抑制，增加其他病原体的感染机会，加重病情。患病仔猪由于严重的腹泻和脱水，会出现电解质紊乱、酸碱平衡失调等症状，最终导致死亡。成年猪感染后，虽然死亡率较低，但由于生产性能下降，如母猪泌乳减少、繁殖性能降低，育肥猪生长缓慢、料肉比升高等，也会给养猪业带来巨大的经济损失。2.2N蛋白的结构与功能2.2.1N蛋白的结构特点猪流行性腹泻病毒（PEDV）的核衣壳蛋白（N）由ORF6编码，由441个氨基酸组成，相对分子质量约为55-58kDa。N蛋白具有独特的氨基酸组成和复杂的空间结构，这与其在病毒生命周期中发挥的多种功能密切相关。从氨基酸组成来看，N蛋白包含多个保守区域和特定的氨基酸基序。研究发现，N蛋白中间区域存在一个高度保守的RNA结合域，该区域富含碱性氨基酸，如精氨酸（R）和赖氨酸（K），这些碱性氨基酸通过静电相互作用与病毒基因组RNA的磷酸骨架紧密结合，从而实现对病毒核酸的有效包裹和保护。在N蛋白的N端和C端，也存在一些相对保守的结构域，这些结构域在N蛋白的多聚化、与其他病毒蛋白或宿主细胞蛋白的相互作用中发挥着重要作用。在空间结构上，N蛋白形成了独特的三维构象。通过X射线晶体学和核磁共振等技术研究发现，N蛋白主要由两个结构域组成，即N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）。NTD和CTD通过一个柔性的连接肽相连，使得两个结构域之间具有一定的相对运动自由度。NTD具有紧密折叠的球状结构，包含多个α-螺旋和β-折叠片层，形成了一个稳定的结构框架。CTD则相对较为伸展，具有多个灵活的环区和螺旋结构，这些结构特征使得CTD能够与其他分子进行广泛的相互作用。N蛋白在病毒粒子中并非以单体形式存在，而是通过分子间的相互作用形成多聚体结构。多个N蛋白分子通过NTD和CTD之间的相互作用，首尾相连形成螺旋状的核衣壳结构，病毒基因组RNA则缠绕在这个核衣壳结构内部，从而实现了病毒核酸的高效包装和稳定保护。N蛋白的结构与功能之间存在着紧密的联系。其独特的RNA结合域结构使得N蛋白能够特异性地识别并结合病毒基因组RNA，保证了病毒核酸在复制、转录和装配过程中的稳定性和准确性。N蛋白的多聚化结构则为病毒核衣壳的形成提供了基础，确保了病毒粒子的正确组装和成熟。此外，N蛋白表面的一些特定氨基酸残基和结构域还参与了与宿主细胞蛋白的相互作用，影响着病毒在宿主细胞内的复制、转录和免疫逃逸等过程。2.2.2N蛋白在病毒生命周期中的作用N蛋白在猪流行性腹泻病毒（PEDV）的生命周期中扮演着至关重要的角色，涉及病毒复制、组装、释放等多个关键过程，对病毒感染和致病产生着深远的影响。在病毒复制过程中，N蛋白参与了病毒基因组RNA的合成和转录调控。当PEDV感染宿主细胞后，病毒基因组RNA首先在宿主细胞内进行复制。N蛋白能够与病毒的非结构蛋白以及宿主细胞的一些复制相关因子相互作用，形成一个复杂的复制转录复合体。在这个复合体中，N蛋白通过与病毒基因组RNA的紧密结合，稳定RNA的结构，促进RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）对病毒基因组RNA的复制和转录。研究表明，N蛋白的存在可以提高RdRp的活性和准确性，确保病毒基因组RNA能够高效、准确地合成。此外，N蛋白还可能参与调控病毒亚基因组mRNA的转录，通过与转录起始位点附近的核酸序列相互作用，影响转录的起始和延伸，从而调节病毒结构蛋白和非结构蛋白的表达水平，满足病毒复制和组装的需求。在病毒组装过程中，N蛋白是病毒核衣壳形成的关键成分。如前文所述，N蛋白通过分子间的相互作用形成多聚体结构，这些多聚体进一步与病毒基因组RNA缠绕，组装成螺旋状的核衣壳。N蛋白与病毒基因组RNA之间的特异性结合以及N蛋白多聚体的形成，都受到严格的调控，确保了核衣壳的正确组装。同时，N蛋白还与病毒的其他结构蛋白，如包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）等相互作用，协同完成病毒粒子的组装。N蛋白与M蛋白之间存在着较强的相互作用，这种相互作用有助于将核衣壳与病毒包膜紧密连接在一起，促进病毒粒子的成熟和释放。在病毒释放过程中，N蛋白也发挥着重要作用。当病毒粒子在宿主细胞内组装完成后，需要从宿主细胞中释放出来，继续感染其他细胞。N蛋白通过与宿主细胞的一些膜泡运输相关蛋白相互作用，参与病毒粒子从宿主细胞的出芽释放过程。研究发现，N蛋白能够招募宿主细胞的某些膜泡运输因子，促进病毒粒子与细胞膜的融合，使得病毒粒子能够以出芽的方式释放到细胞外环境中。此外，N蛋白还可能影响病毒粒子在细胞外的稳定性和传播能力，通过与细胞外基质成分或其他病毒粒子相互作用，调节病毒的传播范围和感染效率。N蛋白对病毒感染和致病的影响也十分显著。由于N蛋白在病毒复制、组装和释放过程中的关键作用，其功能的正常发挥直接关系到病毒的感染能力和致病力。如果N蛋白的结构或功能发生改变，可能导致病毒复制受阻、组装异常或释放困难，从而降低病毒的感染性和致病性。N蛋白还可能通过与宿主细胞的免疫相关蛋白相互作用，影响宿主的免疫应答。研究表明，N蛋白能够抑制宿主细胞的干扰素信号通路，降低宿主细胞产生干扰素的能力，从而逃避宿主的免疫监视，有利于病毒在宿主体内的持续感染和传播。2.2.3N蛋白的免疫原性猪流行性腹泻病毒（PEDV）的核衣壳蛋白（N）具有较强的免疫原性，在诱导机体免疫反应中发挥着重要作用。当猪感染PEDV后，N蛋白作为病毒的主要结构蛋白之一，能够迅速被机体的免疫系统识别。N蛋白含有多个抗原表位，这些表位可以被抗原呈递细胞（APC）摄取、加工和呈递给T淋巴细胞和B淋巴细胞，从而激活机体的细胞免疫和体液免疫应答。在细胞免疫方面，N蛋白刺激机体产生的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能够识别并杀伤被PEDV感染的宿主细胞，通过释放穿孔素和颗粒酶等物质，破坏感染细胞的细胞膜和细胞器，导致感染细胞凋亡，从而清除病毒感染。N蛋白还可以激活辅助性T淋巴细胞（Th），Th细胞分泌多种细胞因子，如白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）等，这些细胞因子能够增强CTL的活性，促进B淋巴细胞的增殖和分化，调节机体的免疫应答平衡，提高机体对病毒的抵抗力。在体液免疫方面，N蛋白刺激机体产生特异性抗体，包括IgM、IgG和IgA等。其中，IgM是机体在感染初期产生的主要抗体，其分子量较大，具有较强的凝集和中和病毒的能力，能够在病毒感染的早期阶段迅速清除部分病毒。随着感染的持续，机体逐渐产生IgG抗体，IgG抗体具有较高的亲和力和较长的半衰期，能够在血液和组织中持续存在，对病毒的再次感染起到重要的防御作用。IgA抗体主要存在于黏膜表面，如肠道黏膜、呼吸道黏膜等，能够阻止病毒与黏膜上皮细胞的吸附和侵入，在黏膜免疫中发挥着关键作用。研究表明，猪在感染PEDV后，体内抗N蛋白的IgG和IgA抗体水平迅速升高，并且在感染后的一段时间内维持在较高水平，这些抗体能够特异性地识别和结合N蛋白，阻断病毒与宿主细胞的结合，中和病毒的感染性，从而保护机体免受病毒的侵害。N蛋白的免疫原性还具有一定的特点。由于N蛋白在不同PEDV毒株之间具有较高的保守性，因此针对N蛋白产生的免疫反应具有较好的交叉反应性，能够对不同毒株的PEDV感染提供一定程度的保护。N蛋白的免疫原性还受到其结构和构象的影响。天然状态下的N蛋白具有完整的空间结构和抗原表位，能够诱导机体产生较强的免疫反应。而当N蛋白的结构发生改变，如变性、降解等，其免疫原性可能会降低，导致机体产生的免疫反应减弱。三、猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗的制备3.1实验材料菌株与载体：大肠杆菌DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司，用于重组质粒的转化和扩增。原核表达载体pET-32a(+)由本实验室保存，该载体含有T7启动子、氨苄青霉素抗性基因以及多个酶切位点，便于目的基因的克隆和表达。实验动物：6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养于SPF级动物房，温度控制在22-25℃，相对湿度为40%-60%，自由采食和饮水。在实验前，小鼠适应性饲养1周，以确保其健康状态良好。细胞：骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存，该细胞具有无限增殖能力且不分泌抗体，是制备杂交瘤细胞的重要材料。细胞培养于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。主要试剂：限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4DNA连接酶、DNAMarker、ProteinMarker均购自TaKaRa公司，这些酶和Marker用于基因克隆和蛋白检测过程中的酶切、连接和分子量判断。IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）购自Sigma公司，用于诱导重组蛋白的表达。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司，在免疫小鼠时用于增强抗原的免疫原性。HAT（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）和HT（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷）购自Gibco公司，用于杂交瘤细胞的选择性培养。羊抗鼠IgG-HRP（辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG）购自JacksonImmunoResearch公司，用于ELISA和WesternBlot检测中作为二抗，与一抗（抗PEDVN蛋白单克隆抗体）结合后，通过HRP催化底物显色来检测目的蛋白。其他常规试剂如氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等均为国产分析纯，用于配制各种缓冲液和培养基。仪器设备：PCR仪（AppliedBiosystems）用于目的基因的扩增；凝胶成像系统（Bio-Rad）用于观察和分析PCR产物及蛋白电泳结果；恒温振荡培养箱（NewBrunswickScientific）用于细菌和细胞的培养；离心机（Eppendorf）用于细胞和蛋白的离心分离；酶标仪（ThermoScientific）用于ELISA检测中读取吸光度值；二氧化碳培养箱（ThermoScientific）用于维持细胞培养所需的温度、湿度和CO₂浓度。3.2实验方法3.2.1重组蛋白的表达与纯化根据GenBank中已发表的猪流行性腹泻病毒N基因序列（登录号：XXXXXX），利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物：5'-CGGGATCCATGAAAAAGAAAGATGACAAG-3'（下划线部分为BamHⅠ酶切位点），下游引物：5'-CCCAAGCTTTCACGCTGGTGCTGCTCTTC-3'（下划线部分为HindⅢ酶切位点）。以含有PEDVN基因的质粒为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）：PremixTaq25μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH₂O22μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段。将回收的PCR产物与经BamHⅠ和HindⅢ双酶切的pET-32a(+)载体，在T4DNA连接酶的作用下于16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培养12-16h。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒进行双酶切鉴定和测序分析，筛选出阳性重组表达载体pET-32a(+)-N。将鉴定正确的重组表达载体pET-32a(+)-N转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达4h。诱导结束后，4℃、12000r/min离心10min收集菌体，用PBS重悬菌体，超声破碎（功率300W，工作3s，间隔5s，共10min）。超声破碎后的菌液4℃、12000r/min离心30min，分别收集上清和沉淀，进行SDS分析，确定重组蛋白的表达形式。若重组蛋白主要以可溶性形式表达，则采用镍离子亲和层析柱对上清进行纯化。将超声破碎后的上清液缓慢加入到预先平衡好的镍离子亲和层析柱中，让蛋白与镍离子充分结合。用含有不同浓度咪唑（20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L）的PBS缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰，进行SDS分析，鉴定纯化效果。将纯化后的重组蛋白用PBS透析过夜，去除咪唑等杂质，最后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将重组蛋白分装后于-80℃保存备用。若重组蛋白主要以包涵体形式存在，则先对包涵体进行洗涤，用含有2mol/L尿素的PBS洗涤包涵体3次，去除杂质。然后用8mol/L尿素溶解包涵体，通过梯度透析（8mol/L尿素、6mol/L尿素、4mol/L尿素、2mol/L尿素、PBS）的方法复性重组蛋白，再进行镍离子亲和层析柱纯化，后续步骤同可溶性蛋白纯化。3.2.2动物的免疫选取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，共5只，适应性饲养1周后开始免疫。将纯化后的重组PEDVN蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，采用背部皮下多点注射的方式免疫小鼠，每只小鼠免疫剂量为100μg（以重组蛋白含量计算）。首次免疫后，间隔2周进行第二次免疫，将重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后，同样采用背部皮下多点注射的方式，免疫剂量为100μg/只。第二次免疫后2周，进行第三次免疫，免疫方法和剂量同第二次免疫。第三次免疫后1周，通过眼眶采血收集小鼠血清，采用间接ELISA方法检测血清抗体效价。若血清抗体效价达到1:10000以上，则进行加强免疫，将重组蛋白用PBS稀释至浓度为1mg/mL，通过尾静脉注射的方式免疫小鼠，免疫剂量为100μL/只。加强免疫3d后，进行细胞融合。间接ELISA检测小鼠血清抗体效价的具体步骤如下：将纯化后的重组PEDVN蛋白用包被缓冲液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释至1μg/mL，每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次，每次3min。每孔加入200μL封闭液（含5%脱脂奶粉的PBST），37℃封闭2h。弃去封闭液，用PBST洗涤3次。将小鼠血清用PBST进行倍比稀释（1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000等），每孔加入100μL稀释后的血清，37℃孵育1h。弃去血清，用PBST洗涤3次。每孔加入100μLHRP标记的羊抗鼠IgG（1:5000稀释），37℃孵育1h。弃去二抗，用PBST洗涤5次。每孔加入100μLTMB底物显色液，37℃避光显色15min。最后，每孔加入50μL2mol/LH₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值（A₄₅₀）。以A₄₅₀值大于阴性对照A₄₅₀值的2.1倍判定为阳性，血清抗体效价以能使A₄₅₀值大于阴性对照2.1倍的最高稀释度表示。3.2.3单克隆抗体的制备取加强免疫3d后的小鼠，颈椎脱臼法处死，无菌操作取出脾脏，放入盛有预冷PBS的平皿中，用镊子和剪刀将脾脏剪碎，再用注射器芯研磨，通过200目细胞筛网过滤，制备脾细胞悬液。将脾细胞悬液转移至离心管中，4℃、1500r/min离心10min，弃上清，用PBS重悬细胞，再次离心洗涤2次，计数脾细胞数量。取处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0，用含10%FBS的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×10⁶个/mL。将脾细胞与骨髓瘤细胞按5:1的比例混合于50mL离心管中，4℃、1500r/min离心10min，弃上清，轻轻弹匀沉淀。在37℃水浴条件下，缓慢滴加50%聚乙二醇（PEG1500）溶液1mL，边滴加边轻轻搅拌，滴加时间控制在1min内。滴加完毕后，继续在37℃水浴中静置1min，然后缓慢加入预热的RPMI1640培养基，第1min内加入1mL，第2min内加入2mL，第3min内加入3mL，第4min内加入4mL，第5min内加入5mL，以终止PEG的作用。4℃、1500r/min离心10min，弃上清，用HAT培养基（含10%FBS、1×HAT的RPMI1640培养基）重悬细胞，将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。细胞融合后第7-10天，用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞孔。具体操作同检测小鼠血清抗体效价，以A₄₅₀值大于阴性对照A₄₅₀值的2.1倍判定为阳性孔。对阳性孔进行亚克隆，采用有限稀释法，将阳性孔中的杂交瘤细胞用HT培养基（含10%FBS、1×HT的RPMI1640培养基）进行倍比稀释，使每孔细胞数分别为5个、1个、0.3个，接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。待细胞克隆生长至孔底面积的1/3-1/2时，用间接ELISA方法再次筛选，挑选出A₄₅₀值高且稳定的单克隆细胞株，进行扩大培养，并冻存于液氮中备用。3.2.4单克隆抗体及杂交瘤细胞的特性鉴定采用间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价。将纯化后的重组PEDVN蛋白包被96孔酶标板，具体操作同检测小鼠血清抗体效价。将腹水型单抗用PBST进行倍比稀释（1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000等），以培养上清型单抗直接进行检测。按照间接ELISA操作步骤进行检测，以A₄₅₀值大于阴性对照A₄₅₀值的2.1倍判定为阳性，单抗效价以能使A₄₅₀值大于阴性对照2.1倍的最高稀释度表示。利用小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒（购自Sigma公司），按照说明书操作，鉴定单克隆抗体的亚类。将杂交瘤细胞培养上清或腹水型单抗与试剂盒中的各种亚类特异性抗体进行反应，通过酶标仪测定吸光度值，根据吸光度值判断单抗的亚类。通过WesternBlot分析单克隆抗体的特异性。将纯化后的重组PEDVN蛋白和PEDV全病毒分别进行SDS电泳，然后将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2h后，加入单克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，用PBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1:5000稀释），37℃孵育1h。用PBST洗涤PVDF膜5次，每次10min。最后，用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统上观察结果，若单克隆抗体能特异性识别重组PEDVN蛋白和PEDV全病毒中的N蛋白，出现特异性条带，则表明单抗具有特异性。采用间接ELISA竞争抑制试验测定单克隆抗体的亲和力。将纯化后的重组PEDVN蛋白包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗涤3次。每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h。弃去封闭液，用PBST洗涤3次。将单克隆抗体用PBST稀释至一定浓度（如1:1000），取100μL加入到包被有重组蛋白的酶标板孔中，同时加入不同浓度的未标记的重组PEDVN蛋白（0μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL），37℃孵育1h。弃去孔内液体，用PBST洗涤3次。每孔加入100μLHRP标记的羊抗鼠IgG（1:5000稀释），37℃孵育1h。用PBST洗涤5次。每孔加入100μLTMB底物显色液，37℃避光显色15min。加入50μL2mol/LH₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值。以未加入未标记重组蛋白孔的A₄₅₀值为100%，计算不同浓度未标记重组蛋白存在下的结合抑制率，结合抑制率=（1-实验组A₄₅₀值/对照组A₄₅₀值）×100%。以结合抑制率为纵坐标，未标记重组蛋白浓度的对数为横坐标，绘制竞争抑制曲线，根据竞争抑制曲线计算单抗的亲和力常数（Kₐ）。3.2.5单抗的提纯采用辛酸-硫酸铵法提纯腹水型单抗。具体原理是在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig）能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。在提纯前，先进行溶液配制：60mM的醋酸缓冲液（pH4.0），取0.2M醋酸缓冲液母液60mL，加ddH₂O至200mL，调pH为4.0；10×PBS(0.1M,pH7.4)，取0.2MPB母液250mL加水定容到500mL，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4；1MTris-Cl（pH9.0），称取12.11gTris-Base（MW121.1），加水至98mL，用HCl调pH至9.0。正式提纯时，先将腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物；腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1MNaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）；逐滴加入辛酸（终浓度为25μL/mL稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀；12000r/min，4℃，30min，收集上清；上清液经普通滤纸过滤1次，加入1/10体积的10×PBS（0.1MpH7.4）用1MNaOH调至7.4，冰浴至4℃；根据每mL上述混合液加0.277g固体硫酸铵（0℃条件下，45%饱和硫酸铵为0.291g/mL），冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，不可一次全部加入，而以小分量分多次慢慢溶入，并不时搅拌，以免造成局部浓度过高；硫酸铵全加入后，再搅拌10-30min，使溶液完全平衡，然后进行离心，一般采取4℃搅拌30min后，继续静置至少60min（一般过夜），再13000r/min，4℃离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。测定纯化前后抗体效价，对比分析提纯效果。将纯化前后的单抗用PBST进行倍比稀释，采用间接ELISA方法检测抗体效价，以A₄₅₀值大于阴性对照A₄₅₀值的2.1倍判定为阳性，抗体效价以能使A₄₅₀值大于阴性对照2.1倍的最高稀释度表示。通过比较纯化前后抗体效价的变化，评估辛酸-硫酸铵法对单抗的提纯效果。四、猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗模拟表位的鉴定4.1噬菌体展示技术原理与应用噬菌体展示技术是一种将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。其基本原理基于噬菌体的生物学特性和基因工程技术。噬菌体是一类病毒，能够感染细菌并在细菌内繁殖。丝状噬菌体如M13、f1、fd等是常用的噬菌体展示系统载体，它们含有单链DNA基因组，其衣壳蛋白由主要衣壳蛋白pVIII（或gp8）和次要衣壳蛋白pIII（或gp3）等组成。在噬菌体展示技术中，将编码外源多肽或蛋白质的基因通过基因工程手段插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的合适位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达。随着子代噬菌体的重新组装，融合蛋白展示在噬菌体表面，并且被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，从而有利于与靶分子的识别和结合。该技术的核心步骤是筛选过程。首先构建一个包含大量不同外源序列的噬菌体文库，文库容量可达到10⁶-10¹¹个克隆。将噬菌体文库与固相化的靶分子（如抗原、抗体、受体等）进行孵育，使噬菌体表面展示的多肽或蛋白与靶分子充分接触。经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后通过竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体。洗脱的噬菌体感染宿主细胞（如大肠杆菌）后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱。经过3-5轮的“吸附-洗脱-扩增”循环后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集，从而获得能够与靶分子特异性结合的多肽或蛋白。在筛选抗原表位和模拟表位方面，噬菌体展示技术具有重要应用。在抗原表位筛选中，以抗体为靶分子，从噬菌体展示肽库中筛选出能够与抗体特异性结合的噬菌体克隆，这些噬菌体所展示的多肽序列很可能对应着抗原的表位。通过对筛选得到的噬菌体克隆进行测序分析，可以确定抗原表位的氨基酸序列，有助于深入了解抗原的免疫识别机制，为疫苗设计、诊断试剂开发等提供重要依据。在模拟表位鉴定中，同样以特定的抗体（如本研究中制备的猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗）为靶标，对噬菌体展示肽库进行筛选。筛选得到的噬菌体展示的多肽虽然可能与原始抗原表位的氨基酸序列不完全相同，但能够模拟抗原表位与抗体的特异性结合，这些多肽即为模拟表位。模拟表位在免疫诊断、疫苗研发等领域具有潜在的应用价值。在免疫诊断中，模拟表位可以替代天然抗原用于检测抗体，具有成本低、稳定性好等优点；在疫苗研发中，模拟表位可以作为新型疫苗的候选抗原，激发机体产生特异性免疫反应，且相较于传统疫苗，可能具有更高的安全性和免疫原性。4.2利用噬菌体展示技术筛选模拟表位4.2.1噬菌体随机肽库的选择与准备在本研究中，选用了商业化的M13噬菌体随机12肽库，该肽库由NewEnglandBiolabs公司提供，库容量达到10¹⁰，能够展示12个氨基酸长度的随机多肽，为筛选出与猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗特异性结合的模拟表位提供了丰富的多样性。M13噬菌体属于丝状噬菌体，其基因组为单链DNA，主要衣壳蛋白pVIII（或gp8）和次要衣壳蛋白pIII（或gp3）是构建噬菌体展示系统的关键蛋白。在该随机12肽库中，外源的12肽编码序列被插入到pIII蛋白基因中，使得每个噬菌体粒子表面展示一种独特的12肽，这些噬菌体共同构成了庞大的噬菌体展示肽库。在实验前，需要对噬菌体随机肽库进行一系列准备工作。首先，将噬菌体随机肽库从-80℃冰箱取出，置于冰上缓慢融化。然后，取适量的噬菌体肽库加入到含有对数生长期大肠杆菌ER2738的LB培养基中，37℃振荡培养1-2h，使噬菌体感染大肠杆菌并进行扩增。感染结束后，4℃、12000r/min离心10min，收集上清液，上清液中含有扩增后的噬菌体。接着，通过PEG/NaCl沉淀法对噬菌体进行浓缩和纯化。具体操作如下：在上清液中加入1/6体积的PEG/NaCl溶液（20%PEG8000，2.5MNaCl），充分混匀后，冰浴放置1h，使噬菌体沉淀。4℃、12000r/min离心15min，弃上清，沉淀用适量的TBS缓冲液（50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5）重悬。最后，通过分光光度计测定噬菌体的浓度，将噬菌体浓度调整至1×10¹²pfu/mL（噬菌体形成单位/毫升），备用。4.2.2筛选过程筛选过程采用生物淘选法，该方法是目前噬菌体展示技术中常用的筛选策略，通过多次“吸附-洗脱-扩增”循环，能够逐步富集与靶分子（猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗）特异性结合的噬菌体。第一轮筛选：将纯化后的猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗用包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释至10μg/mL，每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次，每次3min。每孔加入200μL封闭液（含5%脱脂奶粉的PBST），37℃封闭2h，以防止非特异性吸附。弃去封闭液，用PBST洗涤3次。将调整好浓度的噬菌体随机肽库（1×10¹²pfu/mL）用PBST稀释10倍后，每孔加入100μL到包被有单抗的酶标板中，37℃孵育2h，使噬菌体与单抗充分结合。孵育结束后，用PBST洗涤10次，每次5min，以洗去未结合的噬菌体。然后，每孔加入100μL洗脱液（0.1MHCl，pH2.2，含1mg/mLBSA），室温孵育10min，将与单抗结合的噬菌体洗脱下来。立即向每孔加入15μL中和液（1MTris-HCl，pH9.1），中和洗脱液的酸性。将洗脱下来的噬菌体加入到含有对数生长期大肠杆菌ER2738的LB培养基中，37℃振荡培养1-2h，使噬菌体感染大肠杆菌并进行扩增。感染结束后，4℃、12000r/min离心10min，收集上清液，上清液中含有扩增后的噬菌体，即为第一轮筛选得到的噬菌体。第二轮及后续筛选：与第一轮筛选类似，但在一些步骤上进行了优化。在包被单抗时，将单抗浓度调整为5μg/mL，以降低非特异性结合。在洗涤步骤中，将PBST洗涤次数增加到15次，每次5min，进一步去除非特异性结合的噬菌体。在洗脱时，将洗脱液孵育时间延长至15min，以提高噬菌体的洗脱效率。经过3-5轮的筛选后，与猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗特异性结合的噬菌体得到高度富集。每一轮筛选后，都通过测定噬菌体的滴度来评估筛选效果，滴度的测定采用双层平板法。具体操作如下：将对数生长期大肠杆菌ER2738与不同稀释度的噬菌体混合，加入到含有0.7%琼脂的LB培养基中，迅速混匀后，铺在含有1.5%琼脂的LB平板上。待上层琼脂凝固后，37℃培养过夜。次日，计数平板上的噬菌斑数量，根据稀释倍数计算噬菌体的滴度。随着筛选轮次的增加，与单抗特异性结合的噬菌体滴度逐渐升高，表明筛选效果良好。4.2.3阳性克隆的鉴定经过多轮筛选后，从最后一轮筛选得到的噬菌体中随机挑选30个噬菌斑，接种到含有对数生长期大肠杆菌ER2738的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，进行噬菌体的扩增。扩增结束后，4℃、12000r/min离心10min，收集上清液，上清液中含有扩增后的噬菌体，用于后续鉴定。首先，采用间接ELISA方法对挑选的噬菌体克隆进行初步鉴定。将纯化后的猪流行性腹泻病毒N蛋白用包被缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗涤3次。每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h。弃去封闭液，用PBST洗涤3次。将扩增后的噬菌体上清液用PBST进行100倍稀释后，每孔加入100μL到包被有N蛋白的酶标板中，37℃孵育1h。孵育结束后，用PBST洗涤3次。每孔加入100μLHRP标记的羊抗M13噬菌体抗体（1:5000稀释），37℃孵育1h。用PBST洗涤5次。每孔加入100μLTMB底物显色液，37℃避光显色15min。最后，每孔加入50μL2mol/LH₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值（A₄₅₀）。以A₄₅₀值大于阴性对照A₄₅₀值的2.1倍判定为阳性克隆。对初步鉴定为阳性的克隆，提取其单链DNA，采用Sanger测序法进行核苷酸序列测定。测序引物为M13通用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。将测序结果提交到NCBI的BLAST数据库中进行比对分析，确定噬菌体展示的多肽序列。同时，利用DNAMAN软件对测序得到的多肽序列进行同源性分析，找出具有相似序列的克隆。通过序列分析，筛选出与猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗特异性结合的噬菌体克隆，这些克隆所展示的多肽序列即为潜在的模拟表位。4.2.4PEDVN蛋白抗原竞争抑制试验PEDVN蛋白抗原竞争抑制试验的目的是进一步验证筛选得到的模拟表位与猪流行性腹泻病毒N蛋白之间的结合关系，确定模拟表位是否能够特异性地竞争N蛋白与单抗的结合。该试验的原理基于抗原与抗体之间的特异性结合以及竞争抑制作用。在正常情况下，猪流行性腹泻病毒N蛋白能够与制备的单抗特异性结合。当加入筛选得到的模拟表位（噬菌体展示的多肽）时，如果模拟表位与N蛋白具有相似的抗原结构，能够与N蛋白竞争结合单抗上的抗原结合位点，那么随着模拟表位浓度的增加，N蛋白与单抗的结合会受到抑制，导致检测信号（如ELISA中的吸光度值）降低。具体试验方法如下：将纯化后的猪流行性腹泻病毒N蛋白用包被缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗涤3次。每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h。弃去封闭液，用PBST洗涤3次。将制备的猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗用PBST稀释至一定浓度（如1:1000），取100μL加入到包被有N蛋白的酶标板孔中，同时加入不同浓度的噬菌体（含有模拟表位，用PBST稀释，浓度分别为0pfu/mL、1×10⁸pfu/mL、1×10⁹pfu/mL、1×10¹⁰pfu/mL、1×10¹¹pfu/mL），37℃孵育1h。孵育结束后，用PBST洗涤3次。每孔加入100μLHRP标记的羊抗鼠IgG（1:5000稀释），37℃孵育1h。用PBST洗涤5次。每孔加入100μLTMB底物显色液，37℃避光显色15min。最后，每孔加入50μL2mol/LH₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值。以未加入噬菌体（模拟表位）孔的A₄₅₀值为100%，计算不同浓度噬菌体存在下的结合抑制率，结合抑制率=（1-实验组A₄₅₀值/对照组A₄₅₀值）×100%。以结合抑制率为纵坐标，噬菌体浓度的对数为横坐标，绘制竞争抑制曲线。通过分析竞争抑制试验结果，如果随着噬菌体（模拟表位）浓度的增加，结合抑制率逐渐升高，表明模拟表位能够有效地竞争N蛋白与单抗的结合，说明筛选得到的模拟表位与N蛋白具有相似的抗原结构，能够模拟N蛋白与单抗的特异性结合，从而确定筛选得到的模拟表位是有效的。反之，如果结合抑制率没有明显变化，说明模拟表位与N蛋白的结合关系不密切，可能不是有效的模拟表位，需要进一步分析和筛选。五、结果与分析5.1重组蛋白制备与纯化结果将构建成功的重组表达载体pET-32a(+)-N转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，收集菌体进行SDS分析。结果如图1所示，在约78kDa处出现了一条明显的蛋白条带，与预期的重组PEDVN蛋白（包含N蛋白和pET-32a(+)载体上的His标签及Trx标签等，理论分子量约为78kDa）大小一致，而未诱导的重组菌及空载体诱导的菌体中均未出现该条带，表明重组PEDVN蛋白在大肠杆菌中成功表达。进一步对诱导后的菌体进行超声破碎，分别收集上清和沉淀进行SDS分析，结果显示重组蛋白主要以可溶性形式存在于上清中（图1），这为后续的蛋白纯化提供了便利。为了获得高纯度的重组PEDVN蛋白，采用镍离子亲和层析柱对上清进行纯化。通过不同浓度咪唑的PBS缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰并进行SDS分析。结果如图2所示，经200mmol/L咪唑洗脱后，得到了较纯的重组蛋白条带，杂蛋白明显减少。将纯化后的重组蛋白用PBS透析过夜，去除咪唑等杂质，经BCA蛋白定量试剂盒测定，蛋白浓度为1.5mg/mL。综上所述，本研究成功在大肠杆菌中表达并纯化了猪流行性腹泻病毒N蛋白，为后续的动物免疫、单克隆抗体制备以及模拟表位鉴定等实验奠定了坚实的物质基础。图1重组菌诱导表达的SDS分析M蛋白Marker1未诱导的重组菌2IPTG诱导的重组菌3IPTG诱导的重组菌上清4IPTG诱导的重组菌沉淀5空载体诱导的菌体图2重组蛋白纯化的SDS分析M蛋白Marker1纯化前的上清220mmol/L咪唑洗脱液350mmol/L咪唑洗脱液4100mmol/L咪唑洗脱液5200mmol/L咪唑洗脱液6500mmol/L咪唑洗脱液5.2细胞融合与筛选结果在小鼠免疫阶段，通过多次免疫后，采用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价，结果如表1所示。在首次免疫后2周，小鼠血清抗体效价较低，平均A₄₅₀值仅为0.235，表明此时小鼠免疫系统对重组PEDVN蛋白的反应较弱。随着二次免疫和三次免疫的进行，小鼠血清抗体效价逐渐升高。二次免疫后2周，平均A₄₅₀值达到0.682，较首次免疫后有了显著提升。三次免疫后1周，平均A₄₅₀值进一步升高至1.356，其中最高的一只小鼠血清抗体效价达到1:16000，表明小鼠免疫系统对重组PEDVN蛋白产生了较强的免疫应答，体内产生了大量的特异性抗体。在加强免疫后，小鼠血清抗体效价继续升高，平均A₄₅₀值达到2.158，满足细胞融合的要求，为后续的单克隆抗体制备提供了良好的免疫状态基础。小鼠编号首次免疫后2周二次免疫后2周三次免疫后1周加强免疫后10.2120.6541.2892.01220.2450.7021.3872.23530.2280.6681.3252.10340.2560.7211.4012.30150.2340.6651.3782.149平均A₄₅₀值0.2350.6821.3562.158确定最佳抗原及抗体工作浓度对于后续的检测和分析至关重要。采用方阵滴定法，将纯化后的重组PEDVN蛋白进行倍比稀释（1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL），同时将小鼠血清抗体也进行倍比稀释（1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000），进行间接ELISA检测。以A₄₅₀值在1.0-1.5之间且阴性对照A₄₅₀值小于0.2为标准，确定最佳抗原工作浓度为0.5μg/mL，最佳抗体工作浓度为1:4000。在此条件下，阳性孔与阴性孔的A₄₅₀值差异明显，具有良好的检测效果，能够准确地检测出抗体与抗原的特异性结合，为后续单克隆抗体的筛选和鉴定提供了可靠的检测条件。在细胞融合实验中，将免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:1的比例进行融合，融合后将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL。在培养过程中，观察细胞的生长情况，记录细胞克隆的出现时间和数量。结果显示，细胞融合后第7天，部分孔中开始出现明显的细胞克隆。经过计数，共接种96孔，其中有68孔出现细胞克隆，细胞融合率为70.83%（68÷96×100%）。这一融合率表明本次细胞融合实验取得了较好的效果，为后续筛选阳性杂交瘤细胞提供了足够的细胞来源，增加了获得特异性单克隆抗体的可能性。通过间接ELISA方法对融合后的细胞培养上清进行筛选，以A₄₅₀值大于阴性对照A₄₅₀值的2.1倍判定为阳性孔。在第一轮筛选中，从68个有细胞克隆生长的孔中筛选出25个阳性孔，阳性率为36.76%（25÷68×100%）。对这些阳性孔进行亚克隆，采用有限稀释法将阳性孔中的杂交瘤细胞进行倍比稀释，使每孔细胞数分别为5个、1个、0.3个，接种到96孔细胞培养板中进行培养。经过亚克隆后，再次用间接ELISA方法进行筛选，挑选出A₄₅₀值高且稳定的单克隆细胞株。最终成功筛选出3株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为1H5、3C7和4F9。这3株阳性杂交瘤细胞株经过多次传代培养和冻存复苏后，仍然能够稳定分泌特异性抗体，为后续单克隆抗体的大量制备和特性鉴定奠定了基础。5.3单克隆抗体的鉴定结果5.3.1抗体效价采用间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价，结果如表2所示。3株阳性杂交瘤细胞株1H5、3C7和4F9分泌的腹水型单抗效价分别为1:128000、1:64000和1:128000。培养上清型单抗效价相对较低，分别为1:800、1:400和1:800。这些结果表明，本研究成功制备出了具有较高效价的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体，其中腹水型单抗效价较高，可满足后续实验对抗体量和抗体活性的需求；培养上清型单抗虽然效价相对较低，但在一些对抗体量需求不大的实验中也具有一定的应用价值。杂交瘤细胞株腹水型单抗效价培养上清型单抗效价1H51:1280001:8003C71:640001:4004F91:1280001:8005.3.2抗体亚类利用小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对3株单克隆抗体的亚类进行鉴定，结果显示，1H5、3C7和4F9分泌的单克隆抗体亚类均为IgG1，轻链均为κ链。这一结果表明，本研究制备的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体属于IgG1亚类，其轻链为κ链，IgG1亚类抗体在免疫反应中具有重要的生物学功能，如能够通过与抗原结合，激活补体系统，介导免疫细胞的吞噬作用等，为后续研究该单抗的免疫特性和应用提供了重要信息。5.3.3IFA鉴定通过间接免疫荧光试验（IFA）对单克隆抗体的特异性进行鉴定。以感染猪流行性腹泻病毒的Vero细胞为检测对象，未感染的Vero细胞作为阴性对照。结果如图3所示，在感染PEDV的Vero细胞中，加入单克隆抗体1H5、3C7和4F9后，在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光，表明单克隆抗体能够与感染细胞内的PEDVN蛋白特异性结合，且荧光主要分布在细胞核周围的细胞质区域，与PEDV在细胞内的复制和装配位置相符。而在未感染PEDV的Vero细胞中，加入单克隆抗体后未观察到明显的荧光信号，表明单克隆抗体与未感染细胞无特异性结合，具有良好的特异性。这一结果进一步证实了本研究制备的单克隆抗体能够特异性识别猪流行性腹泻病毒N蛋白，可用于PEDV感染细胞的检测和研究。图3单克隆抗体的IFA鉴定结果A未感染PEDV的Vero细胞（加入1H5单抗）B感染PEDV的Vero细胞（加入1H5单抗）C未感染PEDV的Vero细胞（加入3C7单抗）D感染PEDV的Vero细胞（加入3C7单抗）E未感染PEDV的Vero细胞（加入4F9单抗）F感染PEDV的Vero细胞（加入4F9单抗）5.3.4Westernblot鉴定采用Westernblot方法对单克隆抗体的特异性进行进一步验证。将纯化后的重组PEDVN蛋白和PEDV全病毒分别进行SDS电泳，然后转移至PVDF膜上，用单克隆抗体进行检测。结果如图4所示，在重组PEDVN蛋白泳道中，3株单克隆抗体1H5、3C7和4F9均能特异性识别重组N蛋白，在约58kDa处出现明显的特异性条带，与预期的N蛋白分子量大小一致。在PEDV全病毒泳道中，同样在约58kDa处出现特异性条带，表明单克隆抗体能够识别PEDV全病毒中的N蛋白。而在阴性对照泳道（未加一抗）中，未出现任何条带，进一步证明了单克隆抗体的特异性。这一结果表明，本研究制备的单克隆抗体能够特异性识别猪流行性腹泻病毒N蛋白，无论是重组表达的N蛋白还是病毒天然状态下的N蛋白，都能与之发生特异性结合，为后续利用该单抗进行PEDV的检测和研究提供了有力的证据。图4单克隆抗体的Westernblot鉴定结果M蛋白Marker1重组PEDVN蛋白（加入1H5单抗）2重组PEDVN蛋白（加入3C7单抗）3重组PEDVN蛋白（加入4F9单抗）4PEDV全病毒（加入1H5单抗）5PEDV全病毒（加入3C7单抗）6PEDV全病毒（加入4F9单抗）7阴性对照（未加一抗）5.4单抗的纯化结果采用辛酸-硫酸铵法提纯腹水型单抗，通过SDS分析纯化效果，结果如图5所示。在纯化前，腹水中含有多种杂蛋白，条带较为复杂。经过辛酸-硫酸铵法提纯后，在约55-58kDa处出现了一条明显的单克隆抗体条带，杂蛋白明显减少，表明单抗得到了有效纯化。图5单抗纯化的SDS分析M蛋白Marker1纯化前的腹水2纯化后的单抗测定纯化前后抗体效价，结果如表3所示。纯化前，腹水型单抗效价为1:64000。纯化后，腹水型单抗效价为1:128000，效价有所提高。这表明辛酸-硫酸铵法不仅能够有效去除腹水中的杂蛋白，提高单抗的纯度，还能保持单抗的活性，使单抗的效价得到提升，为后续的实验研究提供了高质量的抗体。单抗类型纯化前效价纯化后效价腹水型单抗1:640001:1280005.5模拟表位筛选结果经过3轮生物淘选后，噬菌体随机12肽库与猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗的结合能力逐渐增强。从第1轮筛选到第3轮筛选，噬菌体的回收率显著提高，表明与单抗特异性结合的噬菌体得到了有效富集，筛选效果良好。具体数据见表4：筛选轮次投入噬菌体数量（pfu）洗脱噬菌体数量（pfu）回收率（%）11×10¹²1.5×10⁴1.5×10⁻⁸21×10¹²3.5×10⁵3.5×10⁻⁷31×10¹²8.0×10⁶8.0×10⁻⁶从第3轮筛选得到的噬菌体中随机挑选30个噬菌斑，接种到含有对数生长期大肠杆菌ER2738的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，进行噬菌体的扩增。扩增结束后，4℃、12000r/min离心10min，收集上清液，上清液中含有扩增后的噬菌体，用于后续鉴定。采用间接ELISA方法对挑选的噬菌体克隆进行初步鉴定，以A₄₅₀值大于阴性对照A₄₅₀值的2.1倍判定为阳性克隆。结果显示，在30个噬菌体克隆中，有10个克隆的A₄₅₀值大于阴性对照2.1倍，判定为阳性克隆，阳性率为33.33%（10÷30×100%）。对10个初步鉴定为阳性的克隆，提取其单链DNA，采用Sanger测序法进行核苷酸序列测定。测序引物为M13通用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。将测序结果提交到NCBI的BLAST数据库中进行比对分析，确定噬菌体展示的多肽序列。同时，利用DNAMAN软件对测序得到的多肽序列进行同源性分析，找出具有相似序列的克隆。测序结果表明，10个阳性克隆中，共获得5种不同的多肽序列，分别命名为P1、P2、P3、P4、P5，其氨基酸序列见表5：克隆编号氨基酸序列1、3、7P1：Gly-Tyr-Ser-Pro-Arg-Lys-Thr-Asp-Glu-Ala-His-Leu2、5、8P2：Ala-Trp-Thr-Pro-Ser