简明生物化学原理 课件 第3章 蛋白质-2 肽

第3章蛋白质-2

共价结构、肽

Peptide简明生物化学原理2Chapter4

Protein的共价结构157页

本章重点内容§1肽和肽键的结构、命名§2蛋白质的空间结构§3蛋白质的空间结构和生物学功能

32.3肽肽和肽键的结构、命名肽的两性解离肽的化学性质天然存在的活性肽42.3.1.肽和肽键的结构、命名肽是氨基酸的线性聚合物。氨基酸顺序：N端－

C端氨基酸残基；寡肽与多肽；环肽N端C端5肽键的结构特征、理化性质62页

具有部分双键特性，不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化。肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化。除脯氨酸外多以反式结构存在。6肽平面、肽单位、二面角,61页7多肽中的二硫键22

二硫键8肽的命名N端C端9开链肽都具有游离的α氨基和α羧基？有的开链肽的N端或C端的游离的α氨基或α羧基被别的基团结合（如烷基化、酰化等）或N端残基自身环化（如：谷氨酸）。脯氨酸在N端也没有游离的α氨基。102.3.2.肽的理化性质-两性解离

62页

具有两性解离和等电点：多肽链中可解离功能团的pKa值）各基团解离常数与游离氨基酸有所不同？11例：pH7时，所带静电荷是？pI是？

是0pI=(4.6+7.8)/2H3N＋－Gly

Lys

Asp－COOHCOOHH3N＋CH34.610.27.83.7－－＋＋12求：三肽Lys-Lys-Lys的pI每个侧链解离后带有1/3个正电荷，此时的pH为pI。利用公式：

pH=pKa+lg（[碱]/[酸]）

pH=10.2＋lg（[2/3]/[1/3]）

pH=10.2＋0.30H3N＋－Lys

Lys

Lys－COO－H3N＋H3N＋H3N＋10.210.210.27.83.7132.3.3肽的化学性质多肽链的水解：酸水解、碱水解、酶水解具有旋光性颜色反应紫外吸收14颜色反应茚三酮反应－－紫色，用于定性和定量肽。双缩脲反应－－紫色或兰紫色(λ＝540nm）。－－－双缩脲法测定蛋白质的含量含有两个或两个以上肽键的化合物有此反应。氨基酸没有

15紫外吸收具紫外吸收：在280nm处有最大吸收峰，可进行肽类定量测定。原因是：含Trp、Tyr、Phe－－－－紫外吸收法测定蛋白质含量162.3.4.天然存在的重要多肽以蛋白质形式存在:相对分子质量在6000以上的多肽称为蛋白质。多肽与蛋白质无严格的界线。以天然活性肽形式存在：分子量比较小的多肽以游离状态存在。具有特殊的生理功能，常称为活性肽在天然活性肽中含有非蛋白质氨基酸和肽键。17天然存在的活性肽(Naturalpeptide)

63页脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。18脑啡肽（五肽）Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽。＋H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO－

＋H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO－前体物：前脑啡肽原（含267个残基）有和吗啡类似的镇痛作用（大脑中有吗啡受体）。19内啡肽包括α－内啡肽（16肽）β－内啡肽（31肽）γ－内啡肽（17肽）前体物：促黑素促皮质激素原20多肽类抗生素：一类具有很强抗菌能力的肽.

青霉素（二肽衍生物）：短杆菌肽（10肽）：H3CH3CHOOCSNOCRNO半胱氨酸和缬氨酸形成的二肽衍生物21催产素和加压素22谷胱甘肽：γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸COOHCHNH2CH2CH2CONH－CH－CO－NH－CH2－COOHγα还原型谷胱甘肽GSHCH2SHγ

Glu－Cys－Glyγ

Glu－Cys－GlySS氧化型谷胱甘肽GSSG23谷胱甘肽重要的生物功能作为抗氧化剂维护蛋白质活性中心的巯基游离。参与二硫化合物相互转化。某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要的作用。GSH：在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和其他红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态。24练习题在一些天然肽中含有蛋白质中不存在的___、___等特殊结构。这些结构上的变化可使这些肽免受蛋白水解酶的作用。蛋白质之所以出现各种内容丰富的构象是因为____键和__

键能有不同程度的转动。双缩脲反应肽、蛋白质、氨基酸都具有的反应。在酸溶剂系统中进行纸层析分离Lys和Leu混合物，问哪种Rf大？用阳离子交换树脂分离PH7的氨基酸混合液Lys、Glu，问哪种先被洗脱出来？2.3蛋白质的结构——蛋白质结构的近代概P67Pr结构一级结构基本结构（初级）二级结构三级结构四级结构空间结构高级结构空间构象

在二级结构和三级结构之间还有另一些层次，如超二级结构和结构域。2.3.3蛋白质分子中的重要化学键：肽键、二硫键、酯键、配位键

氢键、离子键（盐键）疏水作用（疏水键）范德华力（范德华相互作用）

2.3.2蛋白质结构的研究方法70页272.5.4蛋白质的一级结构（化学结构）68页指蛋白质分子中氨基酸的组成、排列顺序、连接方式以及多肽链的数目和关联。（主要为肽键，包括二硫键）是蛋白质空间结构和生理功能的基础。N端C端28蛋白质的一级结构测定

－－－多肽链氨基酸顺序测定要求样品必须是均一的。纯度在>97%以上知道蛋白质的分子量29步骤（待测样品分成多份分别进行各步骤测定）测定蛋白质分子中多肽链的数目拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键分析每一多肽链的氨基酸组成测定并确定多肽链的氨基酸序列确定原多肽链中二硫键的位置30第一步：测定蛋白质分子中多肽链的数目测定末端基（C端或N端），看蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数的比例？若1：1？1：2？1：3？31第二步：拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键借助非共价相互作用缔合的（亚基之间）采用变性剂：8mol/L尿素；6mol/L盐酸胍；SDS处理。通过共价二硫桥（－S－S－）交联的肽链

采用氧化剂或还原剂：将二硫键断裂。分离、纯化多肽链：电泳、层析等方法。猪32第三步：分析每一多肽链的氨基酸组成待测样品经酸(6mol/LHCl)和碱(5mol/LNaOH)完全水解。用氨基酸分析仪进行测定（强阳离子交换，茚三酮反应）。测定水解液中的氨基酸组成和比例，氨量。33第四步：测定多肽链的氨基酸序列N－末端氨基酸测定C－末端分析多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化确定肽段在多肽链中的次序NH2COOH341.N－末端氨基酸测定2,4－二硝基氟苯法（Sanger试剂，DNFB或FDNB）PITC（苯异硫氰酸酯、Edman法）丹磺酰352,4－二硝基氟苯法（Sanger试剂，DNFB或FDNB）1945年由Sanger发明此法，曾用此方法测定了胰岛素的N-末端单肽链＋FDNBDNP－肽链（黄色）DNP－（N端）氨基酸＋n个氨基酸弱碱6mol盐酸中乙醚抽提后层析，与标准DNP－氨基酸比较，确定N端氨基酸？36PITC（苯异硫氰酸酯、Edman法）单肽链＋PITCPTC－肽链（黄色）PTH－（N端，环化）氨基酸

＋余下少一个氨基酸的肽链

弱碱乙醚抽提后层析，与标准PTH－氨基酸比较，确定N端氨基酸？硝基甲烷中，加酸，加热3738Edman（苯异硫氰酸酯法）能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。一次可以连续测出80个左右的残基顺序。大的肽链测序前要化大为小，不能采用全水解。蛋白质顺序仪是以此法为原理设计的。39Edman降解法的改进方法---DNS-Edman降解法用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸原理DNFB法相同但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍可用于微量氨基酸的定量用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链灵敏度提高，能连续测定。多肽顺序自动分析仪样品最低用量可在5pmol40氨肽酶法：从N端依次切断肽键H2NVal－His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu－LysCOOH412.C－末端分析羧肽酶法还原法肼解法42羧肽酶法羧肽酶A：水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸羧肽酶B：只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。

C-末端第二个是Pro时不作用NH2COOHtGlySerVal43还原法

单肽链＋硼氢化锂C－末端氨基酸被还原成α－氨基醇水解，层析44肼解法天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破坏不易测定出。无水加热－453.多肽链部分裂解和肽段混合物的分离纯化要求：选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的蛋白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解。后将所得混合物进行分离纯化。经N未端和C未端测定，确定出每一肽段的序列。选用A种酶第1份选用B种酶第2份46酶解法（表现出专一性）酶专一性抑制水解胰蛋白酶糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）R1＝赖或精侧链，AECysR1＝苯丙、酪、色；亮、蛋、组R2＝脯47化学法溴化氰水解法(CNBr):切割Met的羧基所形成的肽键。Rm=Met，形成高丝氨酸内酯。用羟胺断裂:它断裂－Asn-Gly-,但专一性不高。蛋白质中出现机率低，适于分子量大的蛋白质序列的测定。Rm=AsnRn=Gly48494.确定肽段在多肽链中的次序所得资料：

N－末端残基H

C－末端残基S第一套肽段

OUS

PS

EOVE

RLA

HOWT第二套肽段

SEO

WTOU

VERL

APS

HO借助重叠肽确定肽段次序：

HOWTOUSEOVERLAPS50第五步：确定原多肽链中二硫键的位置采用胃蛋白酶：专一性低，切点多。肽段比较小，分离、鉴定比较容易。作用pH在酸性范围。肽段混合物进行的对角线电泳51对角线电泳暴露在过甲酸蒸气中使二硫键断裂++52巯基的保护53例：有一个A肽？①酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met；②当A肽与FDNB试剂反应后得：DNP-Ala；③当A肽用CNBr降解时得到：游离的Ser和一种肽；④当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽：一种含Ala、Arg，另一种含其它氨基酸⑤当A肽用糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）降解时得到两种肽：一种含Met、Ser，另一种含其它氨基酸；

问A肽的氨基酸排列顺序如何？答：Ala－Arg－Glu－phe－Met－Ser543.5.5蛋白质的一级结构与生物功能P78

同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质具有共同的进化起源血液凝固与氨基酸序列的局部断列同种蛋白质氨基酸个体差异和分子病551.同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质可变残基不变残基序列同源56细胞色素C

79页是一类以铁卟啉为辅基的蛋白质，呼吸链的组分。57不同生物体的细胞色素C序列间氨基酸差异数目的比较

58细胞色素C的一级结构与物种进化间的关系-----物种进化树系统树

592.同源蛋白质具有共同的进化起源氧合血红素蛋白（序列同源，相似的生物功能）

－－－－原始珠蛋白基因肌红蛋白（153）；血红蛋白（141,146）丝氨酸蛋白酶类（序列同源，趋异的生物功能）－－－－祖先丝氨酸蛋白酶基因胰蛋白酶；胰凝乳蛋白酶；凝血酶；纤溶酶一些功能差异很大的蛋白质（序列同源，三级结构相似，不同的生物功能）溶菌酶；α-乳清蛋白603.血液凝固与氨基酸序列的局部断列185页①血液凝固的生物化学机理凝血系统凝血因子，以无活性的前体或酶原形式存在。纤溶系统：纤溶酶原－－单链糖蛋白纤溶酶原激活剂(PA)－－主要是t-PA其他61

内在途径外在途径异物表面接触组织损伤高相对分子质量激肽原

XⅡⅦaXⅠⅠXⅠXaⅧaXXⅡaXⅠaXaXⅦVaCa2+ⅡⅡaⅠ

Ia

XⅢa

激肽释放酶交联的血纤蛋白凝块凝血酶原凝血酶血纤蛋白原

血纤蛋白62凝血酶原的结构示意图

N端C端ABSS274323释放的肽段凝血酶SS凝血酶凝血酶原激酶63血纤蛋白原的结构示意图分子含29个二硫键，6条多肽链由这些二硫键交联成一个整体分子。凝血酶断裂血纤蛋白原中央球状区的4个Arg-Gly键，释放出的肽称血纤肽。64血纤蛋白原转变为软血纤蛋白块

血纤蛋白原H2O血纤肽凝血酶血纤蛋白单体聚集血纤蛋白单体以非共价键结合成血纤蛋白软凝块65纤溶系统t-PA激活纤溶酶原及纤溶酶降解血纤蛋白凝块。t-PA纤溶酶原纤溶酶血纤蛋白凝块表面血纤蛋白血纤蛋白降解物(肽碎片)664.同种蛋白质氨基酸个体差异和分子病同种蛋白质：来自同种生物行使同一生物功能的蛋白质。67例:镰刀形红细胞贫血病－－－分子病正常血红蛋白----Hb,非正常血红蛋白---HbS68血红蛋白的结构由4个多肽亚基组成，属寡聚蛋白质。成人血红蛋白主要是HbA（2α(各141肽)，2β(各146肽)）。69镰刀形红细胞贫血病的分子基础分子基础

HbA:Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys……HbS:Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys……β链12345678脱氧－HbS高浓度存在时，形成长纤维，使红细胞变形70HbA

H2NVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysCOOHHbSH2NVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-LysCOOHβ链12345678Val取代Glu含氧－HbSO2粘性疏水斑O2脱氧－HbS疏水位点脱氧－HbS高浓度存在时，形成长纤维，使红细胞变形。713、肽与蛋白质的人工合成1958年，北大生物系在国内首次合成了具有生物活性的八肽－－催产素。1965年9月，中科院生物化学研究所、有机化学研究所和北大化学系协作，在世界上首次人工合成了结晶牛胰岛素。肽的人工合成有两种类型：由不同氨基酸按照一定顺序控制合成。由一种或两种氨基酸聚合或共聚合。控制合成的困难：接肽反应所需的试剂的选择。接肽以前必须首先把不需参与反应的基团封闭保护。72保护剂应具备两个条件①在接肽时能起保护作用。②在接肽以后又很容易除去