蜱类HSP70-5的结构分析

目录摘要……………………1关键词……………………11前言…………………………22材料与方法………………22.1

蛋白序列的获取………………………32.2蛋白序列的分析……………………………32.2.1信号肽的预测…………………………32.2.2多序列同源性分析………………32.2.3构建蛋白3-模型…………………82.2.4otif分析与展示…………………83结果………………………………83.170-5蛋白的信号肽预测…………………83.270-5蛋白序列保守性分析………………………93.370-5蛋白的3结构模型……………103.470-5蛋白的motif探索……………104分析与讨论………………105结论……………………10参考文献……………………10致谢…………………13摘要：本文通过对来自于niport数据库6种蜱类的hsp70-5蛋白序列进行信号肽预测、比对分析、3结构模拟和otif共性展示,探究6种蜱类70-5的蛋白序列的结构。结果显示：6组蛋白序列高度保守，并且结构中都有序列。6组蛋白通过ignal-4.1软件分析均有信号肽。用otif软件分析结果表明，蛋白的模体结构基本相同，尤其同属的70-5结构完全相同。对6种70-5的分析，表明了70-5蛋白结构高度保守结构基本相似，-70结构的独特性，以及与其他70家族结构的不同。关键词：蜱；HSP70-5；结构特点；序列分析;信号肽预测；保守性bstract:n

this

paper,

hsp70-5

protein

sequences

of

6

ticksfrom

the

niport

database

were

predicted

by

signal

peptide,

parative

analysis,

3

structural

simulation

and

common

otif

display,

to

explore

the

structure

of

the

protein

sequences

of

6ticks

hsp70-5.

he

results

showed

that

the

nine

histone

sequences

were

highly

conserved,

and

sequences

were

present

in

all

the

structures.

ignal

peptides

were

found

in

all

6

histons

analyzed

by

ignal4.1

software.

he

results

of

otif

software

analysis

showed

that

the

structure

of

the

protein

modules

was

basically

the

same,

especially

hsp70-5

of

the

same

genus.

he

analysis

of

6

types

of

hsp70-5

indicatedthat

the

structureof

hsp70-5

protein

was

highly

conserved

and

similar,

and

the

structure

of

hsp-70

was

unique

and

different

from

other

70

family

structures.key

words:

tick;

70-5;

tructural

features;

equence

analysis;

ignal

peptide

prediction;

conservative1前言蜱类属节肢动物门、蛛形纲、蜱螨亚纲、蜱螨目、蜱总目[1]，蜱类侵袭引起家畜痛痒、贫血、消瘦、畜产质量下降，造成经济损失巨大，也传播森林脑炎、莱姆病、梨形虫病等多种人、畜疫病，严重威胁民众的健康和财产[2-3]。蜱是细菌、真菌、病毒与原虫的携带者和传播者，现在已经确认的携带的有脑炎病毒[4]、螺旋体[5]、立克次体[6]、盘尾丝虫[7]和新亚病毒[8]、巴尔通体、盘尾丝虫等病原微生物。自2013年以来，申请人带领团队成员集中精力，在多方面开展研究，并取得了显著的成效，主要体现在如下几方面：⑴严芬对褐黄血蜱的形态、宿主和分布进行了调查(严芬，2015)，增补了其分布范围和寄主种类；⑵李中波等人测定了褐黄血蜱12SrDNA和Cox1等基因的序列及其多态性，丰富了鉴定的分子标记；⑶段德勇等人采用DGGE技术和高通量技术分析了褐黄血蜱唾液、中肠的菌群结构，摸清了其带菌情况；⑷刘磊利用LC/MS/MS技术探明了唾液、中肠和粪便蛋白质成分，为筛选功能蛋白分子提供了准确的线索(Liu，2018)；⑸徐兴莉借助NGS技术比较了饱血、半饱血两状态褐黄血蜱唾液腺和中肠mRNA的差异表达，构建起转录组文库(GSE67247；GSE69721)，成为克隆功能基因、制备活性分子的宝贵依据(Xu，2015；Xu，2016)；⑹刘磊等人分别研究了褐黄血蜱的HSC70、Subolesin和AV422的基因表达、蛋白结构和功能活性(Liu，2017，He，2018)。近几年，一些日、韩学者在褐黄血蜱的超微结构、分布区域、宿主类群和卫生意义方面做了大量的调查和研究，并获得诸多新的发现，如Ejiri和Fujita分离到KabutoMountainvirus和Tarumizutickvirus等两种新病毒。Yun等人从该蜱检出新布尼亚病毒(Yun，2016)、Tick-borneencephalitisvirus和无浆体等病原。Kim等人的调查表明，该蜱是日本和韩国境内的优势蜱种之一，分布范围广，不仅侵袭家畜、也寄生于野生兽类和鸟类。HSP70是迄今为止进化中最保守的蛋白质[9,10,11]。HSP70基因家族的许多成员在正常条件下也有依赖于细胞周期方式(cell-cycledependentmanner)的S期的表达,在正常细胞中,HSP基因家族编码的蛋白质占细胞蛋白质总量的5%～10%[12]。HSP70的分类、结构在受到高温、辐射、感染和癌变等生理和病理因素刺激下，细胞增量表达一类结构保守的伴侣蛋白，以防止蛋白不当聚集、协助蛋白正确折叠、运输。由于这类蛋白最早发现于受高温刺激的果蝇，故命名为热休克蛋白(heat

shock

protein，HSPs)。HSP70基因在所有的细胞内都有结构型表达,其产物总量占细胞蛋白质总量的1%。它的表达为细胞生长依赖性(cellgrowthdependent),在热休克时其表达量有轻度升高[13]。热休克蛋白在抗原呈递过程中结合大量抗原性多肽,具有该细胞特有的抗原库的作用[14]。HSP多肽复合物的抗原性来自于所结合的多肽分子,而非HSP本身。HSP通过参与抗原呈递而起作用[15]。热休克蛋白的生物学功能十分广泛,不仅表现为在应激条件下维持细胞必需的蛋白质空间构象,

保护细胞生命活动,以确保细胞生存,而且在未折

叠新生多肽链、多蛋白复合物的组装和跨膜运输、转位、蛋白质降解,细胞内蛋白质合成后的加工过程,细胞骨架和核骨架稳定等基本功能方面发挥重

要作用。它们调节这些蛋白质的活性,而本身并不参与大分子蛋白质的组成,故称为“分子伴侣”。热休克蛋白在抗原呈递过程中结合大量抗原性多肽,具有该细胞特有的抗原库的作用[18]。

尽管HSP70家族成员众多，但结构保守、特征鲜明，主要表现在：⑴一级结构可区分为NBD(Amino-terminal

ATPase

domain)、SBD(Substrate

binding

domain)和CTD

(C-terminal

domain)三段，相对质量依次为44、15和10ku左右；NBD序列保守、SBD稍次、CTD多变；⑵都有[IV]-D-L-G-T-[ST]-x-[SC]、[LIVMF]-[LIVMFY]-[DN]-[LIVMFS]-G-[GSH]-

[GS]-[AST]-x(3)-[ST]-[LIVM]-[LIVMFC]和[LIVMY]-x-[LIVMF]-x-G-G-x-[ST]-x-[LIVM]-Px-[LIVM]-x-

[DEQKRSTA]三个家族标签，也是鉴定HSP70蛋白的重要依据(Rensing，1994)；⑶C段末端为EEVD或KDEL等，是HSP70分子的定位基序

(Bar-Lavan，2016)。热休克是蜱类等寄生虫常见的生理现象，HSP70家族成员在热休克时产生，他们的种类多样并且功能复杂[16-17]。HSP70-5独特的蛋白结构，均具有信号肽，HSP70-5的结构研究，对探索HSP70-5的生物功能具有重要意义。2材料与方法2.1蛋白序列的获取登陆Uniprot数据库（/），以褐黄血蜱和HSP70-5为词条搜索蜱类HSP70-5蛋白序列，筛选出6种蜱类HSP70-5的蛋白序列，将完整序列转化为DNAman能识别格式（.seq）。2.2蛋白序列分析2.2.1信号肽预测用SignaIP-4.1软件（/tools/signal-peptide.html）对待试蛋白进行信号肽预测，预测HSP70-5蛋白序列中是否存在信号肽，及信号肽的位置。2.2.2多序列同源性分析将6组HSP70-5蛋白质序列通过DNAman6.03软件来进行多序列对比，对比方式为fullAlignment，对比出6组HSP70-5的蛋白质序列的序列差异。2.2.3构建蛋白3-D模型用Swiss-model（)来进行6组蛋白序列的3-D建模，对比6组HSP70-5三维结构。2.2.4Motif分析与展示用MEME（/tools/meme）进行待试蛋白Motif分析与展示。3结果3.1HSP70-5蛋白的信号肽预测用SignalP-4.1软件进行信号肽的预测，结果表明：HSP70-5均具有信号肽（位置均在1-20肽）。结果如图3.1所示。A:A0A0K8RIU3;I.ricinusB:A0A1E1XF89;A.aureolatum C:A0A1L5L8Q9;H.flavaD:A0A5C0ZSP2;R.haemaphysaloides E:A0A023FNL5;A.cajennenseF:A0A131Z3P5;R.appendiculatus图3.1信号肽预测结果Fig3.1Signalpeptidepredictedresults3.2hsp70-5蛋白序列保守性分析用DNAman6.03对6组HSP70-5的蛋白进行多序列比对，结果表明：第一个家族标签序列是IDLGTTYS，位置开始于39aa；第二个家族标签序列是VFDLGGGTFDVSLL

，位置在240aa；第三个家族标签序列是VLVGGSTRIPKVQ

，位置在366aa;

KEDL是HSP70-5的标志。结果如图3.2所示。图3.2序列比对分析结果Fig3.2Sequencealignmentanalysisresults3.3HSP70-5蛋白的3D结构模型用Swiss-model（)来进行6组蛋白序列3-D建模，在相同角度下对比6组蜱类HSP70-5的蛋白三维结构，结果表明6组蛋白序列的蛋白空间结构基本相同.结果如图3.3所示。A：A0A0K8RIU3;I.ricinusB：A0A1E1XF89;A.aureolatumC：A0A1L5L8Q9;H.flavaD：A0A023FNL5;A.cajennenseE：A0A224Z095;R.zambeziensisF：B7PEN4;I.scapularis图3.33-D结构模型Fig3.33-DStructuralmodel3.4HSP70-5蛋白的motif的探索用MEME（/tools/meme）进行待试蛋白Motif分析与展示，结果如图3.4表明。6组HSP70-5序列的模体结构基本相同，尤其同属的HSP70-5的蛋白结构是完全相同的。图3.4蛋白序列的motif分析Fig3.4Motifanalysisofproteinsequences4分析与讨论HSP70家族是一组分子伴侣，在进化上十分保守。它是一个以核基因为主的多基因家族。HSP70-5是HSP70家族的成员,HSP70独特的蛋白结构，与它广泛参与机体的保护功以及对于生物体抵抗和适应不良环境有着十分密切的关系。如在不良环境中,细胞内出现蛋白质变性,其变性过多,就会威胁细胞的生存。而此时出现的变性蛋白可诱导HSP70大量合成,HSP70能使变性蛋白恢复活性,从而保证细胞的生活和生存。5结论通过分析，我们发现HSP70-5蛋白具有HSP70家族标签和定位基序，HSP70-5的序列标志是KEDL，HSP70-5均具有有信号肽，HSP70-5的结构基本相同，同属的HSP70-5结构完全相同，所以HSP70-5蛋白结构高度保守。 参考文献[1]汪明.兽医寄生虫学(第三版)[M].北京:中国农业出版社,2003,75-88.[2]金剑.蜱虫，夏季里的危险小昆虫[J].江苏卫生保健，2019，(6):23.[3]刘天祺，梁光烈，姜紫薇，等.哈尔滨周边旅游区夏季蜱虫的监测及防治初步研究[J].黑龙江畜牧兽医，2016，8(10):141-143.[4]王倩莹,刘凤明,付士红,李樊,滕世荣,陈晓菁,殷启凯,王东强,刘文婧,雷雯雯,何英,梁国栋,李浩,包名家,王环宇.黑龙江边境地区蜱虫携带病原体调查[J].中华实验和临床病毒学杂志,2019(05):504-508.[5]李爽.东北地区蜱传疏螺旋体本底调查[C].中国动物学会寄生虫学专业委员会.中国动物学会寄生虫学专业委员会第十六次全国学术会议暨第七次国际寄生虫学学术研讨会论文摘要集.中国动物学会寄生虫学专业委员会:中国动物学会寄生虫学专业委员会,2017:230.[6]乌兰图雅,高娃,殷旭红,郭生春,阿日奔吉日嘎啦.内蒙古西部地区蜱虫种类与立克次体携带情况的相关性研究[J].现代预防医学,2018,45(11):2059-2062+2072.[7]

Zhang

Y

Z,

Zhou

D

J,

Xiong

Y

W,

et

al.

Hemorrhagic

fever

caused

by

a

novel

tick

borne

Bunyavirus

in

Huaiyangshan,

China[J].中华流行病学杂志,

2011,

32

(3)

:

209-220.[8]

Yu

X

J,

Liang

M

F,

Zhang

S

Y,

et

al.

Fever

with

thrombocytopenia

associated

with

a

novel

Bunyavirus

in

China[J].

N

Engl

J

Med,

2011,

364

(16)

:

1523-1532.[9]Li,

G.C.

and

Werb,

Z.

(1982)

Correlation

between

synthesis

of

heat

shock

proteins

and

development

of

thermotolerance

in

Chinese

hamster

fibroblasts.

Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA

79,

3122–3218.[10]Gupta,R.S.andSingh,B.(1994)Phylogeneticanalysisof70kDheatshockproteinsequencessuggestsachimericoriginfortheeukaryoticcellnucleus.Curr.Biol.4,1104–1114.[11]Hunt,C.andMorimoto,R.I.(1985)Conservedfeaturesofeucaryotichsp70genesreleavedbycomparisionwiththenucleotidesequenceofhumanhsp70.Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,6455–6459.[12]SatishJ.Heatshockproteins:applicationsinhealthanddiseaseTIBTECH1996;14:17-30[13]IshiiT,UdonoH,YamanoT,etal.IsolationofMHCclassT-restrictedtumorantigenpeptideanditsprecur?sorsassociatedwithheatshockproteinshsp70,hsp90,andgp96.Immunol,1999,162:1303-1309[14]Charles,A,Janeway,J.R,etal.Immuno