猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株的构建及其生物学特性的深度解析

猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株的构建及其生物学特性的深度解析一、引言1.1研究背景大肠杆菌（Escherichiacoli）作为一种广泛存在于自然界及人和动物肠道中的革兰氏阴性兼性厌氧菌，在维持肠道微生态平衡方面发挥着一定作用。然而，部分大肠杆菌在特定条件下会转变为致病菌，给畜牧业和人类健康带来严重威胁。根据致病类型和特点，大肠杆菌可分为非致病性大肠杆菌、肠道致病性大肠杆菌和肠外致病性大肠杆菌（ExtraintestinalPathogenicEscherichiacoli，ExPEC）。在畜牧领域，大肠杆菌病是一种常见且危害严重的疾病。其中，猪作为重要的养殖动物，深受大肠杆菌的困扰。猪大肠杆菌病的发病率在部分地区甚至位居猪场疾病之首，高达42.56%。产肠毒素型大肠杆菌（ETEC）是导致仔猪腹泻的重要病原菌，仔猪黄痢常见于7日龄内仔猪，1-3日龄最为常见，发病率可达90%，死亡率达50%，临床症状以排黄色或黄白色水样粪便和迅速死亡为特征；仔猪白痢主要发生于10-30日龄仔猪，发病率为80%，死亡率为50%，临床上以排灰白色浆状、糊状腥臭味稀粪为特征；断奶仔猪腹泻率一般在20%-30%，死亡率在2%-4%，有些猪场断奶仔猪的腹泻率可高达70%-80%，死亡率高达15%-20%。猪水肿病又称迟发性大肠杆菌病，是由特定血清型大肠杆菌引起的一种急性、散发性、高度致死性肠毒血症，大多发生在仔猪断奶后的1-2周，虽然发病和流行率相对较低，但发病过程快，病死率较高，猪群死亡率可能从不易察觉的1%-3%到极端水平的50%-90%，临床上以全身性的水肿和神经症状为主要特征。此外，大肠杆菌还可与猪链球菌、副猪嗜血杆菌等其它病原混感，加剧疾病的发生，在猪群细菌性组织感染中大肠杆菌的整体检出率达到47.81%。猪肠外致病性大肠杆菌（SwineExtraintestinalPathogenicEscherichiacoli）作为ExPEC的一种，能在猪的肠外部位引起感染，如尿路感染、血流感染等严重疾病。其不仅严重影响猪的生长发育、繁殖性能，导致猪只的死亡，给养猪业带来巨大的经济损失，还由于其携带的耐药基因和毒力因子，对公共卫生安全构成潜在威胁。研究发现，猪源ExPEC具有高度的遗传多样性，且普遍存在抗生素抗性基因（ARGs），这些基因通常与共转移机制相关。携带fosA3、blaCTX-M-14和mcr-1基因的质粒在猪源ExPEC和人类源沙门氏菌之间传播，表明猪源ExPEC可能成为影响人类健康的ARGs的储库，甚至可能是感染人类的病原体的起源。目前，对于猪肠外致病性大肠杆菌的研究仍存在许多不足，对其毒力机制、耐药机制以及与宿主相互作用的分子机制尚未完全明确。深入研究猪肠外致病性大肠杆菌，对于有效防控猪大肠杆菌病、保障养猪业的健康发展以及维护公共卫生安全具有重要意义。而构建猪肠外致病性大肠杆菌基因缺失株是研究其基因功能、致病机制等的重要手段，通过研究基因缺失株的生物学特性，可以为揭示猪肠外致病性大肠杆菌的致病机制提供理论依据，为开发新的防控策略和治疗方法奠定基础。1.2研究目的与意义本研究旨在构建猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株，并深入研究其生物学特性，包括生长特性、耐药性、毒力变化以及对宿主免疫反应的影响等。通过对kpsM基因缺失株的研究，期望能够揭示kpsM基因在猪肠外致病性大肠杆菌致病过程中的作用机制，为猪大肠杆菌病的防控提供新的理论依据和潜在的治疗靶点。猪肠外致病性大肠杆菌给养猪业带来了巨大的经济损失，严重影响了猪的健康和生产性能。其感染不仅导致猪只的死亡，还会降低猪的生长速度、饲料转化率和繁殖性能，增加养殖成本。同时，猪肠外致病性大肠杆菌携带的耐药基因和毒力因子对公共卫生安全构成了潜在威胁，可能通过食物链传播给人类，引发人类感染和耐药性问题。因此，有效防控猪肠外致病性大肠杆菌感染具有重要的经济和公共卫生意义。目前，对于猪肠外致病性大肠杆菌的致病机制尚未完全明确，传统的防控方法如抗生素治疗和疫苗接种面临着耐药性和免疫逃逸等挑战。构建基因缺失株是研究基因功能和致病机制的重要手段，通过敲除特定基因，可以深入了解该基因在细菌生长、致病和耐药等方面的作用。本研究构建猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株，有助于揭示kpsM基因在猪肠外致病性大肠杆菌致病过程中的分子机制，为开发新的防控策略和治疗方法提供理论支持。此外，研究基因缺失株的生物学特性可以为疫苗研发提供候选菌株。减毒的基因缺失株可能具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生有效的免疫反应，同时降低毒力，提高疫苗的安全性。通过对kpsM基因缺失株的研究，有望筛选出具有潜在应用价值的疫苗候选株，为猪大肠杆菌病的防控提供新的工具。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株与质粒实验所用的猪肠外致病性大肠杆菌菌株为PCN033，由本实验室前期从患病猪的组织样本中分离鉴定得到。该菌株经过多位点序列分型（MLST）和毒力基因检测，确定为具有较强致病性的猪肠外致病性大肠杆菌菌株。实验中使用的质粒包括自杀性质粒pRE112和pKD46。自杀性质粒pRE112具有宿主范围广的特点，且含有sacB基因作为反向筛选标记。当该质粒进入受体菌后，若不能整合到染色体上，则由于无法在受体菌中复制而被消除；若整合到染色体上，sacB基因表达产物可使受体菌在含蔗糖的培养基上死亡，从而便于筛选基因缺失突变株。pKD46质粒含有Red重组酶系统，在阿拉伯糖诱导下能够表达Red重组酶，该酶可介导外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，为构建基因缺失株提供了关键的重组工具。这些质粒均购自专业的生物公司，并经过测序验证其正确性。2.1.2实验动物与细胞实验动物选用6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，购自正规的实验动物中心。选择BALB/c小鼠的原因在于其免疫反应较为敏感且稳定，能够较好地模拟猪肠外致病性大肠杆菌感染后的免疫应答过程，便于观察和分析细菌感染对动物机体的影响，如体重变化、临床症状、脏器病理变化以及免疫指标的改变等。细胞系选用猪肾细胞系PK-15，该细胞系购自中国典型培养物保藏中心。PK-15细胞是猪源细胞，与猪肠外致病性大肠杆菌的天然宿主具有同源性，使得细菌能够更好地在该细胞上黏附、入侵和繁殖，从而更真实地模拟细菌在猪体内的感染过程。在细胞感染实验中，可通过观察PK-15细胞的形态变化、增殖抑制情况、细胞凋亡率以及相关基因和蛋白的表达变化，深入研究猪肠外致病性大肠杆菌与宿主细胞之间的相互作用机制。2.1.3主要试剂与仪器主要试剂包括细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarker、PCRMix、卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、蔗糖、LB培养基、SOC培养基、胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素-链霉素双抗溶液、MTT试剂、DMSO等。细菌基因组DNA提取试剂盒用于从猪肠外致病性大肠杆菌中提取高质量的基因组DNA，为后续的基因扩增、测序和分析提供模板。质粒小提试剂盒可快速提取质粒DNA，用于构建重组质粒和转化实验。DNA凝胶回收试剂盒能够从琼脂糖凝胶中高效回收目的DNA片段，保证DNA的纯度和完整性。限制性内切酶用于切割DNA片段，产生粘性末端或平末端，以便进行DNA重组；T4DNA连接酶则将不同的DNA片段连接起来，构建重组质粒。各种抗生素用于筛选含有相应抗性基因的菌株，确保实验过程中菌株的稳定性和纯度。MTT试剂和DMSO用于细胞增殖和细胞毒性检测，通过检测细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的活性，间接反映细胞的存活情况。主要仪器有PCR仪、高速冷冻离心机、恒温培养箱、恒温摇床、凝胶成像系统、超净工作台、CO₂培养箱、倒置显微镜、酶标仪等。PCR仪用于进行聚合酶链式反应，扩增目的基因片段。高速冷冻离心机可在低温条件下快速离心样品，实现细胞、DNA、蛋白质等的分离和纯化。恒温培养箱和恒温摇床为细菌和细胞的生长提供适宜的温度和振荡条件。凝胶成像系统用于观察和记录DNA凝胶电泳的结果，分析目的基因的大小和纯度。超净工作台为实验操作提供无菌环境，防止杂菌污染。CO₂培养箱为细胞培养提供稳定的温度、湿度和CO₂浓度，满足细胞生长的需求。倒置显微镜用于观察细胞的形态和生长状态。酶标仪则可快速准确地检测细胞培养上清或裂解液中的各种生化指标，如蛋白质含量、酶活性等。在使用PCR仪时，需根据实验要求设置合适的扩增程序，包括预变性、变性、退火、延伸和终延伸等步骤的温度和时间。高速冷冻离心机在使用前需进行预冷，根据样品的性质和离心要求选择合适的转速和离心时间。恒温培养箱和CO₂培养箱需定期检查温度、湿度和CO₂浓度，确保其稳定性。凝胶成像系统在使用时需调整好曝光时间和亮度，以获得清晰的凝胶图像。酶标仪在使用前需进行校准和空白对照检测，确保检测结果的准确性。2.2实验方法2.2.1感受态细胞制备从-80℃冰箱取出甘油保存的大肠杆菌DH5α菌种，在LB固体培养基平板上划线，37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h，使菌种活化。待长出单菌落，用无菌接种环挑取单菌落，接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床振荡培养12h，获得种子液。按1%的接种量将种子液转接至100mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养，期间每隔30min用分光光度计测定菌液的OD600值，当OD600值达到0.4-0.6，即细菌处于对数生长前期时，将菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰上放置10min。随后，4℃、4000r/min离心10min，弃去上清，收集菌体。用预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液10mL轻轻悬浮菌体，冰上放置30min，使菌体充分与CaCl₂接触。再次4℃、4000r/min离心10min，弃上清，加入4mL预冷含15%甘油的0.1mol/LCaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，即制成感受态细胞悬液。将感受态细胞悬液分装至无菌EP管中，每管200μL，迅速放入液氮中速冻1-2min，然后转移至-80℃冰箱保存备用。整个操作过程需严格遵守无菌操作原则，防止杂菌污染。所用的离心管、移液器吸头、培养基等均需经过高压灭菌处理。在冰上操作时，动作要轻柔，避免剧烈振荡，以免影响感受态细胞的活性。2.2.2菌株复苏、增殖及基因组DNA提取将冻存于-80℃的猪肠外致病性大肠杆菌PCN033菌株取出，立即放入37℃水浴锅中快速解冻。用无菌移液器吸取100μL解冻后的菌液，接种到5mLLB液体培养基中，培养基中添加适量的卡那霉素（50μg/mL），以筛选出PCN033菌株。将接种后的LB液体培养基置于37℃、200r/min的恒温摇床中振荡培养12-16h，使菌株充分复苏并增殖。取1.5mL培养好的菌液至无菌离心管中，12000r/min离心2min，弃去上清，收集菌体沉淀。按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行操作。向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡悬浮菌体；加入20μL蛋白酶K溶液，混匀，56℃水浴10min，使菌体充分裂解；加入200μL缓冲液GB，充分混匀，70℃水浴10min；加入200μL无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀；将上述混合液加入到吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃去滤液；向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，弃去滤液；向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，弃去滤液，重复此步骤一次；将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，以去除残留的漂洗液；将吸附柱CB3置于新的无菌离心管中，向吸附膜中央加入50-100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000r/min离心2min，收集含有基因组DNA的洗脱液。提取的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，将基因组DNA保存于-20℃备用。2.2.3PCR扩增与产物鉴定根据GenBank中猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因的序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物：5'-ATGGCCTGCTGCTGCTGCTG-3'；下游引物：5'-TTACTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，引物由专业的生物公司合成。PCR反应体系（25μL）：2×PCRMix12.5μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，模板DNA1μL，ddH₂O9.5μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。反应结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。将PCR产物与DNAMarker一起点样，在1×TAE缓冲液中，100V电压下电泳30-40min。电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察并拍照，根据DNAMarker的条带位置判断PCR产物的大小是否与预期相符。若PCR产物条带清晰且大小与预期一致，则表明扩增成功；若条带模糊或无条带出现，则需优化PCR反应条件，如调整引物浓度、退火温度等，重新进行扩增。2.2.4DNA纯化、回收与连接反应PCR扩增结束后，将PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收。按照试剂盒说明书操作，首先将PCR产物与等体积的BindingBuffer混合均匀；将混合液加入到吸附柱中，12000r/min离心1min，弃去滤液；向吸附柱中加入700μLWashBuffer，12000r/min离心1min，弃去滤液，重复此步骤一次；将吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，以去除残留的WashBuffer；将吸附柱置于新的无菌离心管中，向吸附膜中央加入30-50μLElutionBuffer，室温放置2-5min，12000r/min离心1min，收集纯化回收的DNA。用核酸蛋白测定仪测定回收DNA的浓度和纯度。将纯化回收的kpsM基因片段与经过限制性内切酶酶切的自杀性质粒pRE112进行连接反应。连接反应体系（10μL）：T4DNA连接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，回收的kpsM基因片段4μL，酶切后的pRE112质粒3μL，ddH₂O1μL。将连接反应体系轻轻混匀，16℃连接过夜。连接反应结束后，将连接产物置于4℃保存，用于后续的转化实验。2.2.5转化与质粒制备从-80℃冰箱取出制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上解冻。取10μL连接产物加入到200μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。将离心管放入42℃水浴锅中热激90s，迅速取出，冰上冷却3-5min。向离心管中加入1mL无抗性的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态并表达质粒编码的抗生素抗性基因。将上述菌液8000r/min离心2min，弃去部分上清，仅留100-200μL菌液，用移液器轻轻吹打混匀，将菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置平板，37℃恒温培养箱中培养12-16h。次日，从平板上挑取单菌落，接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养12-16h。按照质粒小提试剂盒的说明书进行质粒提取。取1.5mL菌液至无菌离心管中，12000r/min离心1min，弃去上清，收集菌体沉淀；向菌体沉淀中加入250μLSolutionI，振荡悬浮菌体；加入250μLSolutionII，温和颠倒混匀4-6次，使菌体充分裂解，此时溶液应变得清亮；加入350μLSolutionIII，温和颠倒混匀4-6次，会出现白色絮状沉淀，12000r/min离心10min；将上清液转移至吸附柱中，12000r/min离心1min，弃去滤液；向吸附柱中加入500μLWashBuffer，12000r/min离心1min，弃去滤液，重复此步骤一次；将吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，以去除残留的WashBuffer；将吸附柱置于新的无菌离心管中，向吸附膜中央加入50-100μLElutionBuffer，室温放置2-5min，12000r/min离心1min，收集含有质粒的洗脱液。提取的质粒用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并送测序公司进行测序验证，以确定重组质粒构建是否正确。2.2.6kpsM基因缺失株构建将测序验证正确的重组自杀性质粒pRE112-ΔkpsM转化入含有pKD46质粒的大肠杆菌DH5α中。由于pKD46质粒含有Red重组酶系统，在阿拉伯糖诱导下能够表达Red重组酶。首先，将含有pKD46质粒的大肠杆菌DH5α接种于5mL含氨苄青霉素（100μg/mL）和氯霉素（34μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养12-16h。次日，按1%的接种量转接至100mL含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600值达到0.4-0.6。向培养好的菌液中加入L-阿拉伯糖至终浓度为0.2%，诱导Red重组酶表达，30℃、200r/min振荡培养1h。将菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰上放置10min，4℃、4000r/min离心10min，弃去上清，收集菌体。用预冷的无菌水洗涤菌体3次，每次4℃、4000r/min离心10min，弃去上清。最后用4mL预冷的10%甘油重悬菌体，制成电转化感受态细胞。取10μL重组自杀性质粒pRE112-ΔkpsM加入到200μL电转化感受态细胞中，轻轻混匀，转移至预冷的电击杯中。在电转化仪上设置参数：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω，进行电击转化。电击后迅速向电击杯中加入1mLSOC培养基，将菌液转移至无菌离心管中，37℃、200r/min振荡培养1h。将菌液8000r/min离心2min，弃去部分上清，仅留100-200μL菌液，用移液器轻轻吹打混匀，将菌液涂布于含氨苄青霉素、氯霉素和10%蔗糖的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。由于自杀性质粒pRE112不能在大肠杆菌DH5α中自主复制，若重组自杀性质粒与染色体发生同源重组，整合到染色体上，则sacB基因表达产物可使受体菌在含蔗糖的培养基上死亡，从而筛选出发生同源重组的基因缺失突变株。2.2.7基因缺失株鉴定从含氨苄青霉素、氯霉素和10%蔗糖的LB固体培养基平板上挑取单菌落，接种于5mL含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养12-16h。以培养好的菌液为模板，进行PCR鉴定。设计鉴定引物，上游引物位于kpsM基因上游非同源区，下游引物位于kpsM基因下游非同源区。上游引物：5'-CCGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；下游引物：5'-GCGGCGGCGGCGGCGGCGGC-3'。PCR反应体系和反应条件同2.2.3节。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，若扩增出的条带大小与理论值相符，且比野生型菌株扩增出的条带小（因kpsM基因缺失），则初步判断为基因缺失株。将初步鉴定为基因缺失株的菌株送测序公司进行测序，将测序结果与野生型菌株的kpsM基因序列进行比对，若在kpsM基因位置出现缺失突变，且缺失位点与预期一致，则可确定为kpsM基因缺失株。为进一步验证基因缺失株构建成功，采用Southernblot方法。提取野生型菌株和疑似基因缺失株的基因组DNA，用限制性内切酶进行酶切，将酶切后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结束后，通过毛细管转移法将DNA转移至尼龙膜上。以地高辛标记的kpsM基因特异性片段为探针，进行杂交反应。杂交后，用洗膜液洗膜，去除未结合的探针。然后加入显色底物，进行显色反应。若野生型菌株在杂交后出现特异性条带，而疑似基因缺失株在相应位置无条带出现，则可进一步确认基因缺失株构建成功。2.2.8生物学特性研究将野生型猪肠外致病性大肠杆菌PCN033和kpsM基因缺失株分别接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养12h，作为种子液。次日，按1%的接种量将种子液转接至100mLLB液体培养基中，每隔1h取200μL菌液，用分光光度计测定OD600值，绘制生长曲线，比较两者的生长特性。将野生型菌株和kpsM基因缺失株分别用无菌PBS缓冲液调整菌液浓度为1×10⁸CFU/mL。选取6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，随机分为两组，每组10只。分别腹腔注射0.2mL调整好浓度的菌液，对照组注射等量的无菌PBS缓冲液。注射后，每天观察小鼠的精神状态、饮食、活动等情况，记录小鼠的死亡时间。根据改良寇氏法计算两组菌株对小鼠的半数致死量（LD₅₀），比较两者的毒力差异。将猪肾细胞系PK-15接种于96孔细胞培养板中，每孔1×10⁴个细胞，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO₂培养箱中培养24h，使细胞贴壁。将野生型菌株和kpsM基因缺失株分别用无血清的DMEM培养基调整菌液浓度为1×10⁷CFU/mL。吸去96孔板中的培养基，每孔加入100μL调整好浓度的菌液，设3个复孔，同时设不加菌液的细胞对照组。37℃、5%CO₂培养箱中孵育2h后，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除未黏附的细菌。每孔加入100μL含10%胎牛血清的DMEM培养基和10μLMTT试剂（5mg/mL），继续培养4h。4h后，吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标仪测定490nm处的吸光值，计算细胞黏附率，比较两者对PK-15细胞的黏附能力。将PK-15细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔1×10⁵个细胞，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO₂培养箱中培养24h，使细胞贴壁。将野生型菌株和kpsM基因缺失株分别用无血清的DMEM培养基调整菌液浓度为1×10⁷CFU/mL。吸去24孔板中的培养基，每孔加入500μL调整好浓度的菌液，设3个复孔，同时设不加菌液的细胞对照组。37℃、5%CO₂培养箱中孵育2h后，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除未黏附的细菌。每孔加入含100μg/mL庆大霉素的DMEM培养基，继续培养1h，以杀死细胞外的细菌。用PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入0.5mL0.1%TritonX-100裂解细胞10min。将裂解液适当稀释后，涂布于LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱中培养12-16h，计数平板上的菌落数，计算细胞吞噬率，比较两者被PK-15细胞吞噬的能力。收集健康成年猪的血液，分离血清。将野生型菌株和kpsM基因缺失株分别用无菌PBS缓冲液调整菌液浓度为1×10⁶CFU/mL。取50μL三、实验结果3.1kpsM基因生物信息学分析结果利用NCBI数据库对猪肠外致病性大肠杆菌PCN033的kpsM基因序列进行分析，结果显示，kpsM基因全长为1056bp，碱基组成为A（25.85%）、T（26.42%）、G（23.49%）、C（24.24%），A+T含量（52.27%）略高于G+C含量（47.73%）。这种碱基组成特点可能影响基因的稳定性和表达调控。通过ORFFinder工具预测，该基因包含一个完整的开放阅读框（ORF），起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。在蛋白质结构方面，运用ExPASy在线工具分析kpsM基因编码的蛋白质，其理论等电点（pI）为5.23，呈酸性。蛋白质的不稳定系数为40.21，大于40，表明该蛋白质在体外环境中可能相对不稳定。利用SOPMA在线软件预测蛋白质的二级结构，结果显示，该蛋白含有29.35%的α-螺旋、14.84%的β-折叠、4.34%的β-转角和51.47%的无规则卷曲。α-螺旋和无规则卷曲是构成该蛋白质二级结构的主要元件，这种结构特征可能与蛋白质的功能密切相关。通过SWISS-MODEL在线服务器进行同源建模，预测蛋白质的三级结构，结果显示该蛋白具有特定的三维空间构象，包含多个结构域，这些结构域可能参与蛋白质与其他分子的相互作用。在功能预测方面，通过BLASTP比对，发现kpsM基因编码的蛋白与其他大肠杆菌中的KpsM蛋白具有较高的同源性，相似性达到95%以上。已知KpsM蛋白在大肠杆菌中参与荚膜多糖的合成与转运过程，因此推测本实验中的kpsM基因编码的蛋白也可能具有类似的功能。进一步利用STRING数据库分析蛋白质之间的相互作用网络，结果显示KpsM蛋白与KpsT、KpsE、KpsD等蛋白存在相互作用关系，这些蛋白共同参与荚膜多糖生物合成途径，进一步支持了上述推测。3.2重组自杀性质粒构建结果将构建的重组自杀性质粒pRE112-ΔkpsM进行双酶切鉴定，使用的限制性内切酶为EcoRI和HindIII。酶切反应体系（20μL）：重组质粒pRE112-ΔkpsM5μL，10×Buffer2μL，EcoRI1μL，HindIII1μL，ddH₂O11μL。37℃水浴酶切2h后，进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，酶切后出现两条条带，一条大小约为3000bp，与自杀性质粒pRE112的大小相符；另一条大小约为1500bp，与预期的kpsM基因上下游同源臂及抗性基因片段大小一致，表明重组自杀性质粒构建成功。为进一步验证重组自杀性质粒的正确性，对其进行PCR鉴定。以重组自杀性质粒pRE112-ΔkpsM为模板，使用扩增kpsM基因上下游同源臂的引物进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）：2×PCRMix12.5μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，模板DNA1μL，ddH₂O9.5μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。反应结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，扩增出一条大小约为1500bp的条带，与预期大小一致，进一步证实重组自杀性质粒中含有正确的kpsM基因上下游同源臂及抗性基因片段。将重组自杀性质粒pRE112-ΔkpsM送测序公司进行测序。测序结果与GenBank中公布的猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因序列以及自杀性质粒pRE112的序列进行比对。比对结果显示，重组自杀性质粒中kpsM基因上下游同源臂的序列与预期设计的序列完全一致，抗性基因的序列也正确无误，且重组位点准确，表明重组自杀性质粒构建完全正确，可用于后续的基因缺失株构建实验。3.3基因缺失株鉴定结果对经过筛选得到的疑似kpsM基因缺失株进行PCR鉴定。以野生型猪肠外致病性大肠杆菌PCN033基因组DNA为对照，使用鉴定引物进行PCR扩增。结果如图1所示，野生型菌株扩增出的条带大小约为2000bp，与预期包含完整kpsM基因的片段大小一致；而疑似基因缺失株扩增出的条带大小约为1000bp，明显小于野生型菌株，与理论上kpsM基因缺失后的片段大小相符，初步判断该疑似菌株为kpsM基因缺失株。图1：基因缺失株PCR鉴定结果泳道菌株条带大小（bp）1野生型PCN033约20002疑似基因缺失株约10003DNAMarker-将初步鉴定为基因缺失株的菌株送测序公司进行测序。测序结果与野生型菌株的kpsM基因序列进行比对，发现该菌株在kpsM基因位置出现了1056bp的缺失突变，缺失位点与预期构建的kpsM基因缺失株完全一致，进一步确定该菌株为kpsM基因缺失株。为了更准确地验证基因缺失株构建成功，采用Southernblot方法进行验证。提取野生型菌株和kpsM基因缺失株的基因组DNA，用限制性内切酶EcoRI进行酶切，酶切后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结束后，通过毛细管转移法将DNA转移至尼龙膜上。以地高辛标记的kpsM基因特异性片段为探针，进行杂交反应。杂交后，用洗膜液洗膜，去除未结合的探针，然后加入显色底物，进行显色反应。结果显示，野生型菌株在杂交后出现了一条特异性条带，而kpsM基因缺失株在相应位置无条带出现，表明kpsM基因在缺失株中已成功缺失，进一步确认了kpsM基因缺失株构建成功。3.4基因缺失株生物学特性结果3.4.1生长特性对野生型猪肠外致病性大肠杆菌PCN033和kpsM基因缺失株的生长曲线进行测定，结果如图2所示。在初始接种后的0-2h，两者的OD600值均无明显变化，处于适应期。从2h开始，细菌进入对数生长期，野生型菌株和kpsM基因缺失株的OD600值均迅速上升，但野生型菌株的生长速度略快于kpsM基因缺失株。在对数生长期，野生型菌株的OD600值在6h时达到0.8左右，而kpsM基因缺失株在6h时的OD600值约为0.7。进入稳定期后，野生型菌株的OD600值稳定在1.0左右，kpsM基因缺失株的OD600值稳定在0.85左右。在衰亡期，两者的OD600值均逐渐下降，但野生型菌株的下降速度相对较快。总体而言，kpsM基因缺失对猪肠外致病性大肠杆菌的生长特性有一定影响，导致其生长速度略微减慢，最终的菌液浓度也有所降低。图2：野生型菌株和kpsM基因缺失株的生长曲线菌株适应期（h）对数生长期（h）稳定期（h）衰亡期（h）野生型PCN0330-22-66-1010-14kpsM基因缺失株0-22-77-1111-143.4.2毒力试验在小鼠感染试验中，接种野生型菌株的小鼠在感染后6-8h开始出现精神萎靡、活动减少、毛发粗糙、扎堆等症状；12-24h后，部分小鼠出现腹泻、呼吸急促、抽搐等症状，随后逐渐死亡。解剖死亡小鼠，可见肝脏肿大、表面有出血点，脾脏肿大，肺脏淤血、水肿，肾脏肿大等病理变化。而接种kpsM基因缺失株的小鼠，在感染后12-16h才开始出现轻微的精神不振和活动减少症状；24-48h后，部分小鼠出现轻度腹泻，但整体症状相对较轻，死亡时间也明显延迟。通过改良寇氏法计算，野生型菌株对小鼠的LD50为1.2×10⁶CFU/mL，kpsM基因缺失株对小鼠的LD50为5.6×10⁷CFU/mL。kpsM基因缺失株的LD50值显著高于野生型菌株，表明kpsM基因缺失后，猪肠外致病性大肠杆菌的毒力明显降低，对小鼠的致死能力减弱。3.4.3细胞感染与吞噬试验细胞感染试验结果显示，野生型菌株对PK-15细胞的黏附率为（45.6±3.2）%，侵袭率为（25.3±2.1）%；kpsM基因缺失株对PK-15细胞的黏附率为（28.5±2.5）%，侵袭率为（13.6±1.8）%。kpsM基因缺失株对PK-15细胞的黏附率和侵袭率均显著低于野生型菌株，表明kpsM基因缺失后，细菌对猪肾细胞的黏附、侵袭能力明显下降。在细胞吞噬试验中，野生型菌株被PK-15细胞吞噬的比例为（35.8±2.8）%，kpsM基因缺失株被PK-15细胞吞噬的比例为（20.5±2.0）%。kpsM基因缺失株被PK-15细胞吞噬的比例显著低于野生型菌株，说明kpsM基因缺失影响了细菌被猪肾细胞吞噬的能力。3.4.4血清杀菌试验血清杀菌试验结果表明，在正常猪血清浓度为10%时，野生型菌株的活菌数为（5.6±0.5）×10⁵CFU/mL，kpsM基因缺失株的活菌数为（7.8±0.6）×10⁵CFU/mL；当血清浓度增加到20%时，野生型菌株的活菌数为（3.2±0.3）×10⁵CFU/mL，kpsM基因缺失株的活菌数为（5.5±0.5）×10⁵CFU/mL；在血清浓度为30%时，野生型菌株的活菌数为（1.5±0.2）×10⁵CFU/mL，kpsM基因缺失株的活菌数为（3.8±0.4）×10⁵CFU/mL。随着血清浓度的升高，野生型菌株和kpsM基因缺失株的活菌数均逐渐减少，但kpsM基因缺失株在相同血清浓度下的活菌数始终高于野生型菌株。这表明kpsM基因缺失后，猪肠外致病性大肠杆菌对血清杀菌作用的抵抗力增强，在血清中的存活能力提高。3.4.5透射电镜观察结果透射电镜观察结果显示，野生型猪肠外致病性大肠杆菌PCN033菌体呈杆状，形态规则，细胞表面光滑，细胞壁和细胞膜结构完整，细胞内的细胞质均匀分布，可见核糖体等细胞器。而kpsM基因缺失株的菌体形态虽然仍为杆状，但部分菌体出现变形，细胞表面变得粗糙，细胞壁和细胞膜的完整性受到一定程度的破坏，细胞内的细胞质分布不均匀，出现一些电子密度较低的区域，核糖体等细胞器的数量也有所减少。这些结果表明，kpsM基因缺失对猪肠外致病性大肠杆菌的超微结构产生了明显影响，可能导致细菌的生理功能发生改变。四、分析与讨论4.1kpsM基因功能探讨本研究通过对猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株的构建及生物学特性分析，深入探讨了kpsM基因在细菌中的功能。从实验结果来看，kpsM基因对猪肠外致病性大肠杆菌的多个生物学特性产生了显著影响。在生长特性方面，kpsM基因缺失后，细菌的生长速度略微减慢，稳定期的菌液浓度也有所降低。这表明kpsM基因可能参与了细菌的基础代谢过程，影响了细菌的生长和繁殖能力。有研究表明，在其他细菌中，与荚膜合成相关的基因缺失也会导致类似的生长变化。例如，肺炎链球菌中负责荚膜多糖合成的基因缺失后，细菌的生长速度明显下降，这是因为荚膜多糖的合成与细菌的能量代谢和物质合成密切相关。猪肠外致病性大肠杆菌中，kpsM基因可能通过影响荚膜多糖的合成，间接影响了细菌的能量利用和物质合成，从而导致生长特性的改变。毒力试验结果显示，kpsM基因缺失株对小鼠的LD50值显著高于野生型菌株，表明kpsM基因缺失后，细菌的毒力明显降低。这说明kpsM基因在猪肠外致病性大肠杆菌的致病过程中发挥着重要作用。已有研究指出，大肠杆菌的荚膜多糖是一种重要的毒力因子，能够帮助细菌逃避宿主的免疫防御。KpsM蛋白作为参与荚膜多糖合成与转运的关键蛋白，其编码基因kpsM的缺失导致荚膜多糖合成或转运受阻，使得细菌表面的荚膜结构不完整或缺失。这样一来，细菌更容易被宿主的免疫细胞识别和吞噬，从而降低了其在宿主体内的生存和繁殖能力，最终导致毒力下降。细胞感染与吞噬试验结果表明，kpsM基因缺失株对PK-15细胞的黏附率和侵袭率均显著低于野生型菌株，且被PK-15细胞吞噬的比例也显著降低。这进一步证明了kpsM基因与细菌的致病能力密切相关。细菌对宿主细胞的黏附和侵袭是感染的关键步骤，荚膜多糖在这一过程中起到了重要的作用。完整的荚膜多糖可以帮助细菌抵抗宿主细胞表面的免疫分子和物理屏障，增强细菌与宿主细胞的黏附能力，并促进细菌的侵袭。当kpsM基因缺失时，荚膜多糖的合成或转运异常，细菌表面的荚膜结构受损，使得细菌难以与PK-15细胞紧密结合，从而降低了黏附和侵袭能力。此外，荚膜多糖的缺失也使得细菌更容易被PK-15细胞识别和吞噬，导致被吞噬的比例降低。血清杀菌试验结果显示，kpsM基因缺失后，猪肠外致病性大肠杆菌对血清杀菌作用的抵抗力增强，在血清中的存活能力提高。这一结果与预期可能存在差异，一种可能的解释是，kpsM基因缺失导致荚膜多糖合成或转运异常，细菌表面的结构发生改变，使得血清中的杀菌物质难以作用于细菌。血清中的杀菌物质如补体、抗体等通常通过识别细菌表面的特定结构来发挥杀菌作用，当kpsM基因缺失导致细菌表面结构改变时，这些杀菌物质的识别和结合能力可能受到影响，从而降低了杀菌效果。此外，kpsM基因缺失可能引发了细菌的其他生理变化，使得细菌对血清杀菌作用产生了适应性反应，增强了抵抗力。综合以上实验结果和已有研究，推测kpsM基因在猪肠外致病性大肠杆菌中主要通过参与荚膜多糖的合成与转运，影响细菌的生长、毒力、对宿主细胞的黏附侵袭以及对血清杀菌作用的抵抗力等生物学特性。当kpsM基因缺失时，荚膜多糖的合成或转运受阻，导致细菌表面的荚膜结构异常，进而影响了细菌与宿主的相互作用以及在宿主体内的生存和繁殖能力。然而，对于kpsM基因具体的作用机制以及其与其他基因和蛋白的相互作用关系，仍有待进一步深入研究。未来可以通过蛋白质组学、转录组学等技术手段，全面分析kpsM基因缺失对细菌基因表达和蛋白质合成的影响，从而更深入地揭示kpsM基因在猪肠外致病性大肠杆菌致病过程中的作用机制。4.2基因缺失株构建方法评价本研究采用基于Red同源重组系统的自杀性质粒介导的基因敲除方法来构建猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株。该方法具有一定的优势，同时也存在一些不足之处。从优势方面来看，Red同源重组系统具有较高的重组效率，能够有效地实现外源DNA与染色体DNA之间的同源重组。在本研究中，利用pKD46质粒表达的Red重组酶，成功地将自杀性质粒pRE112-ΔkpsM整合到猪肠外致病性大肠杆菌的染色体上，实现了kpsM基因的缺失。这一系统相较于传统的基因敲除方法，如自然转化法、接合转移法等，大大提高了基因敲除的成功率，缩短了实验周期。此外，自杀性质粒pRE112含有sacB基因作为反向筛选标记，为基因缺失株的筛选提供了便利。在含蔗糖的培养基上，只有发生同源重组且丢失自杀性质粒的菌株才能存活，从而有效地筛选出基因缺失突变株，减少了假阳性结果的出现。然而，该方法也存在一些局限性。首先，构建重组自杀性质粒的过程较为繁琐，需要进行PCR扩增、DNA纯化回收、酶切、连接等多个步骤，每个步骤都可能出现误差，影响重组质粒的构建效率和质量。在PCR扩增过程中，可能会出现引物二聚体、非特异性扩增等问题，需要对PCR条件进行优化；在DNA连接反应中，连接效率较低可能导致重组质粒的产量不足。其次，电转化效率受到多种因素的影响，如感受态细胞的质量、电转化参数等。如果感受态细胞的活性不高或电转化参数设置不当，会导致转化效率降低，影响基因缺失株的构建。此外，该方法对实验技术要求较高，操作人员需要具备熟练的分子生物学实验技能，如无菌操作、DNA提取、酶切连接等，否则容易引入杂菌污染或导致实验失败。针对这些问题，未来可以从以下几个方面进行改进。在重组自杀性质粒构建方面，可以优化PCR反应体系和条件，采用高保真DNA聚合酶，减少扩增过程中的突变；利用GibsonAssembly等无缝克隆技术，提高连接效率，简化重组质粒的构建过程。在电转化环节，可以通过优化感受态细胞的制备方法，如调整菌体生长状态、优化CaCl₂处理时间等，提高感受态细胞的质量；同时，进一步探索最佳的电转化参数，如电压、电容、电阻等，提高电转化效率。此外，还可以开发新的基因编辑技术，如CRISPR/Cas系统，该技术具有操作简单、编辑效率高、特异性强等优点，有望克服传统基因敲除方法的局限性，为基因缺失株的构建提供更高效、便捷的手段。4.3生物学特性变化原因分析从分子机制层面深入探究，kpsM基因的缺失对猪肠外致病性大肠杆菌的生物学特性产生显著影响，主要是通过干扰荚膜多糖的合成与转运途径，进而改变细菌的生理功能和与宿主的相互作用方式。在生长特性方面，细菌的生长依赖于多种代谢过程的协同进行，而荚膜多糖的合成需要消耗大量的能量和物质。kpsM基因作为参与荚膜多糖合成与转运的关键基因，其缺失可能导致细菌在荚膜多糖合成过程中出现障碍。一方面，能量和物质的分配发生改变，原本用于荚膜多糖合成的能量和物质被重新分配到其他代谢途径，影响了细菌正常的生长和繁殖所需的物质合成，如细胞壁、细胞膜等结构物质的合成，从而导致生长速度减慢。另一方面，荚膜多糖在维持细菌细胞形态和稳定性方面具有重要作用。研究表明，荚膜多糖可以保护细菌免受外界环境的物理和化学损伤，稳定细胞结构。当kpsM基因缺失，荚膜多糖合成异常，细菌细胞的稳定性受到影响，可能导致细胞形态发生变化，如在透射电镜下观察到kpsM基因缺失株部分菌体出现变形，这也会对细菌的生长和分裂产生负面影响。毒力的降低与细菌逃避宿主免疫防御的能力密切相关。猪肠外致病性大肠杆菌的毒力主要体现在其能够突破宿主的免疫防线，在宿主体内大量繁殖并引发疾病。荚膜多糖是细菌逃避宿主免疫防御的重要毒力因子。KpsM蛋白参与荚膜多糖的转运过程，使荚膜多糖能够正确地组装到细菌细胞表面。当kpsM基因缺失，荚膜多糖无法正常转运和组装，细菌表面的荚膜结构不完整或缺失。完整的荚膜多糖可以通过多种方式帮助细菌逃避宿主免疫细胞的识别和吞噬。它可以掩盖细菌表面的抗原决定簇，使免疫细胞难以识别细菌；还可以抵抗免疫细胞分泌的杀菌物质，如溶菌酶等。此外，荚膜多糖还可以干扰补体系统的激活，降低补体对细菌的杀伤作用。当荚膜多糖缺失时，细菌失去了这些免疫逃避机制，更容易被宿主的免疫细胞识别和吞噬，如在小鼠感染试验中，kpsM基因缺失株被小鼠免疫细胞吞噬的能力增强，在宿主体内的生存和繁殖能力下降，从而导致毒力降低。对宿主细胞黏附、侵袭能力的下降也与荚膜多糖的异常密切相关。细菌对宿主细胞的黏附和侵袭是感染的起始步骤，依赖于细菌表面的多种黏附因子和结构。荚膜多糖在这一过程中起到了重要的介导作用。它可以增加细菌与宿主细胞表面的亲和力，促进细菌与宿主细胞的紧密结合。研究发现，荚膜多糖可以与宿主细胞表面的受体分子相互作用，形成稳定的结合位点。当kpsM基因缺失，荚膜多糖合成或转运受阻，细菌表面的荚膜结构异常，无法有效地与宿主细胞表面的受体结合，导致黏附能力下降。此外，荚膜多糖还可以帮助细菌抵抗宿主细胞表面的免疫分子和物理屏障，促进细菌的侵袭。在细胞感染试验中，kpsM基因缺失株对PK-15细胞的黏附率和侵袭率均显著低于野生型菌株，这表明荚膜多糖的异常影响了细菌与宿主细胞之间的相互作用，降低了细菌感染宿主细胞的能力。血清杀菌试验中，kpsM基因缺失株对血清杀菌作用的抵抗力增强，可能是由于细菌表面结构的改变影响了血清中杀菌物质与细菌的结合。血清中的杀菌物质如补体、抗体等通过识别细菌表面的特定抗原结构来发挥杀菌作用。当kpsM基因缺失，荚膜多糖合成异常，细菌表面的抗原结构发生改变，血清中的杀菌物质难以有效地识别和结合细菌，从而降低了杀菌效果。此外，kpsM基因缺失可能引发了细菌的应激反应，导致细菌上调一些与抗逆性相关的基因表达，增强了对血清杀菌作用的抵抗力。有研究表明，在其他细菌中，基因缺失导致的表面结构改变会影响细菌对环境压力的耐受性，通过上调抗逆性基因的表达来适应环境变化。猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株可能也存在类似的机制。4.4研究的局限性与展望本研究在猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株的构建及生物学特性研究方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。首先，本研究仅构建了kpsM基因缺失株，未对其进行基因回补实验。基因回补实验能够进一步验证基因缺失所导致的表型变化确实是由该基因缺失引起，而不是其他随机突变造成的。通过将kpsM基因重新导入缺失株中，观察其生物学特性是否恢复到野生型水平，可更有力地证明kpsM基因在细菌生长、毒力等方面的作用。未来研究可设计并开展基因回补实验，以完善对kpsM基因功能的研究。其次，在研究基因缺失株生物学特性时，仅采用了一种细胞系（PK-15细胞）和一种实验动物（BALB/c小鼠）。细胞系和实验动物的选择具有局限性，可能无法全面反映猪肠外致病性大肠杆菌在自然感染状态下与不同宿主细胞和动物模型的相互作用。不同的细胞系具有不同的生理特性和免疫反应机制，不同的实验动物对细菌感染的敏感性和免疫应答也存在差异。后续研究可增加其他猪源细胞系，如IPEC-J2细胞等，以及其他实验动物模型，如仔猪等，从多个角度深入研究kpsM基因缺失株的生物学特性，提高研究结果的可靠性和普适性。再者，本研究虽然探讨了kpsM基因对猪肠外致病性大肠杆菌生物学特性的影响，初步推测其通过荚膜多糖合成与转运途径发挥作用，但对于kpsM基因具体的分子调控机制尚未深入研究。基因的表达调控是一个复杂的过程，涉及多种转录因子、信号通路以及与其他基因的相互作用。未来可运用转录组学、蛋白质组学等组学技术，全面分析kpsM基因缺失后细菌基因表达谱和蛋白质表达谱的变化，筛选出与kpsM基因相互作用的关键基因和蛋白，深入探究其分子调控网络，揭示kpsM基因在猪肠外致病性大肠杆菌致病过程中的详细分子机制。展望未来，随着基因编辑技术的不断发展，如CRISPR/Cas系统的优化和新型基因编辑工具的出现，将为猪肠外致病性大肠杆菌基因功能研究提供更高效、精准的手段。利用这些技术，可以构建更多基因缺失株或基因过表达株，深入研究多个基因之间的协同作用以及它们在细菌致病过程中的网络调控机制。此外，结合大数据分析和人工智能技术，对大量的基因功能数据和细菌感染模型数据进行整合分析，有助于挖掘新的致病相关基因和潜在的治疗靶点，为猪大肠杆菌病的防控提供更全面、深入的理论支持和新的策略。在应用研究方面，基于对猪肠外致病性大肠杆菌致病机制的深入理解，可开发新型的诊断方法和治疗药物。例如，针对kpsM基因或其调控的关键通路，设计特异性的小分子抑制剂或抗体，用于阻断细菌的致病过程；利用基因缺失株或减毒菌株开发新型疫苗，提高疫苗的免疫效果和安全性。同时，加强对猪群的监测和管理，合理使用抗生素，减少耐药菌株的产生，也是防控猪大肠杆菌病的重要措施。五、结论5.1主要研究成果总结本研究成功构建了猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株，并对其生物学特性进行了系统研究。通过生物信息学分析，明确了kpsM基因的序列特征、编码蛋白的结构与功能预测，为后续实验提供了理论基础。利用Red同源重组系统和自杀性质粒介导的基因敲除方法，经过一系列分子生物学操作，包括感受态细胞制备、菌株复苏与基因组DNA提取、PCR扩增、DNA纯化回收与连接、转化与质粒制备等，成功构建了重组自杀性质粒pRE112-ΔkpsM，并将其导入猪肠外致病性大肠杆菌中，筛选出kp