猪轮状病毒NSP4基因表达载体构建及表达特性解析：原核与真核视角

猪轮状病毒NSP4基因表达载体构建及表达特性解析：原核与真核视角一、引言1.1研究背景与意义猪轮状病毒（PorcineRotavirus，PoRV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是一种双链RNA病毒，无囊膜，病毒粒子呈球形，在电镜下观察其形态类似车轮状。PoRV具有多个血清群和血清型，其中血清A型是引起断奶前后仔猪腹泻最常见的亚型，在由PoRV引起商品化猪群的腹泻病中占90%以上。猪轮状病毒病是一种以腹泻、呕吐、厌食、脱水为主要临床症状的急性胃肠炎传染病，主要感染5周龄内仔猪，通过口腔或鼻腔感染后，破坏小肠绒毛，导致消化吸收机能丧失。PoRV具有潜伏期短、传染性强、流行范围广、发病率高等特征，常与其他细菌、病毒混合感染，致使病情加重，患病猪群死亡率升高。据相关研究表明，我国猪轮状病毒的流行率达到42%左右，其中华北地区的流行率最高，达47.69%。感染PoRV的仔猪发病后，会出现精神不振、食欲下降的情况，随后出现严重的呕吐以及腹泻症状，粪便从粥样逐渐变为水样，含有大量凝乳块且具有恶臭气味。1周龄以内的仔猪在发病后的3-7天就会出现明显的脱水症状，体重可减轻30%，病死率较高；2周龄以后仔猪感染发病时，病死率较低，但会导致仔猪体质下降，变成僵猪。成年猪和母猪感染后多不表现出临床症状，或仅表现出轻微的食欲下降和粪便呈粥样，有时还可见个别病猪出现呕吐，病猪常经过4-5天会自行恢复，不出现死亡情况。猪轮状病毒病给全球养猪业造成了巨大的经济损失，严重制约了养猪业的健康发展。轮状病毒粒子由11个分段的RNA片段构成，分别编码6个结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7）和5或6个非结构蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5/6）。其中，非结构蛋白NSP4是一种跨内质网膜糖蛋白，在病毒的形态发生和致病机理中起着重要的作用，是最早发现的一种病毒肠毒素，能够引起新生小鼠的腹泻，而在组织学上无病变发生。研究发现NSP4能刺激有效的免疫反应，其编码基因可以作为轮状病毒疫苗发展的候选基因。对NSP4基因进行深入研究，构建其原核与真核表达载体并实现表达，对于揭示猪轮状病毒的致病机制、开发新型诊断方法和疫苗具有重要意义。在疫苗研制方面，传统的轮状病毒疫苗主要基于结构蛋白，但保护效果存在一定局限性。NSP4作为一种具有免疫原性的非结构蛋白，为疫苗研发提供了新的思路。通过构建NSP4基因表达载体并实现高效表达，有望开发出更加有效的轮状病毒疫苗，提高对猪轮状病毒病的防控效果。在诊断方法上，目前针对猪轮状病毒的诊断主要集中在检测病毒的结构蛋白或核酸，但这些方法存在灵敏度不高、特异性不强等问题。利用NSP4蛋白开发新型诊断试剂，能够为猪轮状病毒病的早期准确诊断提供有力工具，有助于及时采取防控措施，减少疾病传播和经济损失。此外，对NSP4基因表达和蛋白功能的研究，还能加深对猪轮状病毒感染机制的理解，为抗病毒药物的研发提供理论基础。本研究通过构建猪轮状病毒NSP4基因的原核与真核表达载体，并对其在不同表达系统中的表达情况进行研究，旨在获得大量具有生物学活性的NSP4蛋白，为进一步研究NSP4的功能、开发基于NSP4的诊断试剂和疫苗奠定基础，对有效防控猪轮状病毒病、减少养猪业经济损失具有重要的现实意义。1.2国内外研究现状猪轮状病毒（PoRV）作为引起仔猪腹泻的重要病原体之一，一直是国内外兽医学领域的研究热点。在过去几十年中，众多学者围绕PoRV的病毒学特性、流行病学、致病机制以及防控措施等方面开展了广泛而深入的研究，取得了一系列重要成果。在PoRV的病毒学特性研究方面，国内外学者对其形态结构、基因组组成和蛋白功能进行了系统解析。PoRV属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，其病毒粒子呈球形，无囊膜，由11个分段的RNA片段构成，分别编码6个结构蛋白和5或6个非结构蛋白。其中，非结构蛋白NSP4因其在病毒形态发生和致病机理中的关键作用，受到了特别关注。研究表明，NSP4是一种跨内质网膜糖蛋白，具有肠毒素活性，能够引起新生小鼠腹泻，且在病毒的装配和释放过程中发挥重要作用。在流行病学研究方面，国内外的调查显示，PoRV在全球养猪业中广泛流行，不同地区的感染率和流行血清型存在一定差异。我国猪轮状病毒的流行率约为42%，其中华北地区流行率最高，达47.69%。血清A型是引起断奶前后仔猪腹泻最常见的亚型，在商品化猪群腹泻病中占比90%以上。此外，PoRV常与其他细菌、病毒混合感染，增加了疾病防控的难度。关于NSP4基因的研究，国内外学者在基因克隆、序列分析和表达方面取得了显著进展。通过对不同毒株NSP4基因的克隆和测序，发现该基因存在一定的遗传变异，可分为不同的基因型。在表达研究方面，已成功构建了多种原核和真核表达载体，并实现了NSP4蛋白的表达。然而，目前对NSP4基因表达调控机制的研究还相对较少，不同表达系统中NSP4蛋白的表达效率和生物学活性仍有待进一步提高。在疫苗研发方面，虽然已有一些针对PoRV的疫苗上市，但传统疫苗主要基于结构蛋白，保护效果存在一定局限性。NSP4作为一种具有免疫原性的非结构蛋白，为新型疫苗的研发提供了新的思路。一些研究尝试将NSP4基因与其他抗原基因联合构建多价疫苗，以提高疫苗的免疫效果，但相关研究仍处于探索阶段，尚未取得突破性进展。在诊断方法上，目前常用的检测手段主要针对病毒的结构蛋白或核酸，如RT-PCR技术、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验等。这些方法在临床诊断中发挥了重要作用，但存在灵敏度不高、特异性不强等问题。利用NSP4蛋白开发新型诊断试剂，有望提高检测的准确性和灵敏度，但相关研究还不够深入，需要进一步探索。综上所述，虽然国内外在猪轮状病毒NSP4基因的研究方面已取得了一定成果，但仍存在诸多不足之处。如对NSP4基因的表达调控机制研究不够深入，不同表达系统中NSP4蛋白的表达效率和活性有待提高；基于NSP4的疫苗和诊断试剂研发尚处于探索阶段，需要进一步优化和完善。本研究旨在通过构建猪轮状病毒NSP4基因的原核与真核表达载体，并对其在不同表达系统中的表达情况进行深入研究，以期获得大量具有生物学活性的NSP4蛋白，为后续开发基于NSP4的诊断试剂和疫苗奠定基础，填补相关研究领域的空白，为猪轮状病毒病的防控提供新的策略和方法。1.3研究目标与内容1.3.1研究目标本研究旨在成功构建猪轮状病毒NSP4基因的原核与真核表达载体，并对其在大肠杆菌和真核细胞中的表达情况进行系统研究，获得大量具有生物学活性的NSP4蛋白，为深入探究NSP4蛋白的功能、开发基于NSP4的诊断试剂和疫苗奠定坚实基础。具体而言，期望通过本研究解决以下关键问题：一是优化原核和真核表达体系，提高NSP4蛋白的表达量和活性；二是明确NSP4蛋白在不同表达系统中的表达特征和生物学功能；三是为后续基于NSP4蛋白的诊断试剂和疫苗研发提供技术支持和理论依据，为猪轮状病毒病的防控提供新的策略和方法。1.3.2研究内容（1）猪轮状病毒NSP4基因的克隆：从感染猪轮状病毒的细胞或组织中提取总RNA，利用反转录PCR（RT-PCR）技术扩增NSP4基因。根据GenBank中已公布的猪轮状病毒NSP4基因序列，设计特异性引物，通过PCR扩增获得目的基因片段。对扩增产物进行测序验证，确保基因序列的准确性，为后续载体构建提供正确的基因模板。（2）原核表达载体的构建与表达：将克隆得到的NSP4基因与原核表达载体（如pET系列）进行连接，构建重组原核表达载体。通过转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，并对重组质粒进行酶切鉴定和测序验证。将鉴定正确的重组表达载体转化至大肠杆菌表达菌株（如BL21）中，优化诱导表达条件，包括诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等，以获得高表达量的NSP4蛋白。利用SDS和Westernblot技术对表达产物进行分析，确定蛋白的表达情况和分子量大小，同时检测蛋白的可溶性和免疫反应性。（3）真核表达载体的构建与表达：选择合适的真核表达载体（如pcDNA3.1），将NSP4基因克隆至真核表达载体中，构建重组真核表达载体。通过脂质体转染等方法将重组载体导入真核细胞（如HEK293T细胞、CHO细胞等）中，利用荧光显微镜观察转染效率，通过RT-PCR和Westernblot技术检测NSP4基因在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。对真核表达条件进行优化，如转染试剂的选择、转染时间、细胞密度等，以提高蛋白的表达水平。（4）表达蛋白的鉴定与分析：对原核和真核表达系统中获得的NSP4蛋白进行纯化，采用亲和层析、离子交换层析等方法获得高纯度的蛋白。利用质谱分析、圆二色谱等技术对纯化后的蛋白进行结构和功能鉴定，分析蛋白的氨基酸序列、二级结构和三级结构，以及蛋白的生物学活性，如与其他蛋白的相互作用、对细胞生理功能的影响等。通过免疫印迹、免疫荧光等技术研究NSP4蛋白的免疫原性，为后续诊断试剂和疫苗的研发提供数据支持。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1病毒与细胞本实验选用猪轮状病毒[具体毒株名称]，该毒株分离自[来源地及分离时间]，经多次传代和鉴定，其生物学特性稳定。猪轮状病毒是引起仔猪腹泻的重要病原体，[具体毒株名称]在后续实验中作为目的基因NSP4的来源，通过对其进行培养和增殖，提取病毒RNA，为基因克隆提供模板。细胞系选用非洲绿猴肾细胞（MA104），该细胞系对猪轮状病毒具有良好的敏感性，能够支持病毒的吸附、侵入和复制过程。MA104细胞具有生长迅速、易于培养和传代的特点，在本实验中用于猪轮状病毒的增殖。将病毒接种于MA104细胞，在适宜的培养条件下，病毒能够在细胞内大量繁殖，从而获得高滴度的病毒液，为后续的实验操作提供充足的病毒材料。2.1.2载体与菌株原核表达载体选用pET-32a(+)，该载体具有T7启动子，能够在大肠杆菌中高效启动外源基因的转录；多克隆位点便于目的基因的插入；含有His标签，方便后续对表达蛋白进行亲和层析纯化。选择pET-32a(+)作为原核表达载体，是因为其在大肠杆菌表达系统中应用广泛，具有成熟的表达和纯化体系，能够有效提高目的蛋白的表达量和纯度。真核表达载体选用pcDNA3.1(+)，该载体含有CMV启动子，可在多种真核细胞中驱动基因的表达；具备筛选标记，便于筛选阳性克隆。pcDNA3.1(+)在真核表达领域具有较高的通用性和可靠性，能够满足本实验在真核细胞中表达NSP4基因的需求。宿主菌株选用大肠杆菌BL21(DE3)，该菌株是一种常用的原核表达宿主菌，具有蛋白酶缺陷型（lon和ompT蛋白酶缺陷），能够减少表达蛋白的降解；含有T7RNA聚合酶基因，可与pET-32a(+)载体上的T7启动子配合，实现目的基因的高效表达。2.1.3主要试剂与仪器主要试剂包括RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR扩增试剂、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarker、蛋白质Marker、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、亲和层析介质、SDS凝胶制备试剂、Westernblot相关试剂等。RNA提取试剂盒用于从感染猪轮状病毒的细胞或组织中提取总RNA；反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，为后续的PCR扩增提供模板；PCR扩增试剂用于扩增NSP4基因；限制性内切酶用于切割载体和目的基因，以便进行连接；T4DNA连接酶将载体和目的基因连接成重组质粒；DNAMarker和蛋白质Marker分别用于DNA和蛋白质的分子量鉴定；IPTG作为诱导剂，可诱导大肠杆菌中重组蛋白的表达；亲和层析介质用于纯化表达的重组蛋白；SDS凝胶制备试剂用于制备聚丙烯酰胺凝胶，对蛋白进行分离；Westernblot相关试剂用于检测蛋白的表达和免疫反应性。主要仪器有PCR仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、电泳仪、转膜仪、酶标仪等。PCR仪用于进行基因扩增反应；凝胶成像系统用于观察和记录PCR产物及蛋白电泳结果；离心机用于细胞和病毒的收集、核酸和蛋白的分离等；恒温培养箱和恒温摇床为细胞培养和细菌培养提供适宜的温度和振荡条件；超净工作台保证实验操作在无菌环境下进行；电泳仪和转膜仪分别用于蛋白的电泳分离和转膜；酶标仪用于检测ELISA实验结果。2.2实验方法2.2.1NSP4基因的克隆参考GenBank中已公布的猪轮状病毒NSP4基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物：5'-[具体序列含酶切位点及保护碱基]-3'；下游引物：5'-[具体序列含酶切位点及保护碱基]-3'。引物两端分别引入合适的限制性内切酶酶切位点，如BamHI和HindIII，以便后续的载体构建，同时在酶切位点外侧添加2-3个保护碱基，以确保酶切反应的顺利进行。将保存的猪轮状病毒接种至生长状态良好的MA104细胞中，细胞密度达到80%-90%时进行接种。病毒接种后，在37℃、5%CO₂培养箱中吸附1-2小时，然后弃去病毒液，加入含有2μg/mL胰蛋白酶的维持液，继续培养，观察细胞病变效应（CPE）。当70%-80%的细胞出现明显CPE时，收获病毒液，反复冻融3次，使细胞充分裂解，释放病毒。12000r/min离心10分钟，取上清，保存于-80℃冰箱备用。使用RNA提取试剂盒提取病毒液中的总RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，通过紫外分光光度计测定其浓度和纯度，确保RNA的质量符合后续实验要求。以提取的总RNA为模板，利用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。反转录反应体系包括5×反转录缓冲液、dNTPMix、随机引物、反转录酶和RNA模板等，总体积为20μL。反应条件为：42℃60分钟，70℃10分钟，终止反应后，将cDNA保存于-20℃备用。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系包括10×PCR缓冲液、dNTPMix、上下游引物、TaqDNA聚合酶和cDNA模板等，总体积为50μL。反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，[退火温度]退火30秒，72℃延伸[延伸时间]，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并拍照，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，按照试剂盒说明书操作，获得纯化的NSP4基因片段。将回收的NSP4基因片段与pMD-19T载体进行连接，连接体系包括10×连接缓冲液、T4DNA连接酶、NSP4基因片段和pMD-19T载体，总体积为10μL。16℃连接过夜，然后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化后的感受态细胞涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16小时，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定和质粒提取。对提取的重组质粒pMD-19T-NSP4进行双酶切鉴定，使用的限制性内切酶为BamHI和HindIII，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序，将测序结果与GenBank中已公布的NSP4基因序列进行比对分析，确认克隆的NSP4基因序列的准确性。2.2.2NSP4基因原核表达载体的构建将重组质粒pMD-19T-NSP4和原核表达载体pET-32a(+)分别用BamHI和HindIII进行双酶切。酶切反应体系包括10×酶切缓冲液、限制性内切酶、质粒DNA和无菌水，总体积为20μL。37℃酶切3-4小时，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用DNA凝胶回收试剂盒分别回收目的基因片段（NSP4基因）和线性化的载体片段。将回收的NSP4基因片段与线性化的pET-32a(+)载体按照摩尔比3:1-5:1的比例混合，加入10×连接缓冲液和T4DNA连接酶，16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将转化后的感受态细胞涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16小时。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，反应体系和条件与NSP4基因克隆时的PCR扩增相同。将菌落PCR鉴定为阳性的单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养12-16小时，提取重组质粒。对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系和条件与构建时的双酶切相同，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的目的条带。将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序，将测序结果与NSP4基因序列进行比对，确认重组质粒中NSP4基因的序列正确且读码框无误。2.2.3NSP4基因在原核系统中的表达与分析将鉴定正确的重组质粒pET-32a-NSP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为0.1-1.0mmol/L，分别在16℃、25℃、37℃下诱导表达4-8小时，设置未诱导的重组菌和空载体诱导菌作为对照。诱导表达结束后，取1mL菌液于1.5mL离心管中，12000r/min离心1分钟，弃上清，加入100μLPBS重悬菌体，然后加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀后100℃煮沸5分钟，使蛋白充分变性。取10-15μL样品进行SDS分析，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。电泳结束后，使用考马斯亮蓝R-250染色液染色30-60分钟，然后用脱色液脱色至背景清晰，观察并分析蛋白表达情况，确定目的蛋白的表达量和分子量大小。将诱导表达后的菌液4℃、12000r/min离心10分钟，收集菌体沉淀。用PBS洗涤菌体沉淀2-3次，然后加入适量的BindingBuffer重悬菌体，使用超声破碎仪进行超声破碎，功率为300-500W，工作3秒，间歇5秒，共超声30-40分钟，使菌体充分破碎。破碎后的菌液4℃、12000r/min离心30分钟，分别收集上清和沉淀，取上清和沉淀进行SDS分析，确定目的蛋白的可溶性。将超声破碎后的上清液过Ni-NTA亲和层析柱，先使用BindingBuffer平衡层析柱，然后将上清液缓慢加入层析柱中，使目的蛋白与Ni-NTA树脂结合。用WashingBuffer洗涤层析柱3-5次，去除杂蛋白，最后用ElutionBuffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液。对洗脱得到的目的蛋白进行SDS分析，检测蛋白的纯度，使用Bradford法测定蛋白浓度。将纯化后的NSP4蛋白进行Westernblot分析，以检测其免疫反应性。将蛋白样品进行SDS电泳后，通过半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1-2小时，然后加入稀释好的鼠抗His标签单克隆抗体（一抗），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3-5次，每次10分钟，然后加入稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG（二抗），室温孵育1-2小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3-5次，每次10分钟，最后使用化学发光试剂进行显色，在凝胶成像系统下观察并拍照。2.2.4NSP4基因真核表达载体的构建将重组质粒pMD-19T-NSP4用KpnI和XhoI进行双酶切，酶切体系和条件与原核表达载体构建时的双酶切类似。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因片段（NSP4基因）。将真核表达载体pcDNA3.1(+)同样用KpnI和XhoI进行双酶切，回收线性化的载体片段。将回收的NSP4基因片段与线性化的pcDNA3.1(+)载体按照摩尔比3:1-5:1的比例混合，加入10×连接缓冲液和T4DNA连接酶，16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化后的感受态细胞涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16小时。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，反应体系和条件根据引物和模板的特点进行优化。将菌落PCR鉴定为阳性的单菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养12-16小时，提取重组质粒。对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系和条件与构建时的双酶切相同，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的目的条带。将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序，将测序结果与NSP4基因序列进行比对，确认重组质粒中NSP4基因的序列正确且读码框无误。2.2.5NSP4基因在真核系统中的表达与分析将处于对数生长期的HEK293T细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔接种1×10⁵-2×10⁵个细胞，加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO₂培养箱中培养至细胞密度达到70%-80%。使用脂质体转染试剂将重组真核表达载体pcDNA3.1-NSP4转染至HEK293T细胞中，按照脂质体转染试剂的说明书进行操作。转染时，将适量的重组质粒和脂质体分别用Opti-MEM培养基稀释，然后将两者混合，室温孵育15-20分钟，形成DNA-脂质体复合物。将复合物加入到细胞培养孔中，轻轻混匀，继续培养。设置转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞和未转染的细胞作为对照。转染后48-72小时，收集细胞，提取细胞总RNA和总蛋白。使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，操作按照试剂盒说明书进行。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，通过紫外分光光度计测定其浓度和纯度。以提取的总RNA为模板，利用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，进行RT-PCR检测，反应体系和条件根据引物和模板的特点进行优化。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的目的条带，以确定NSP4基因在mRNA水平的表达情况。将收集的细胞用PBS洗涤2-3次，然后加入适量的RIPA裂解液，冰上裂解30分钟，使细胞充分裂解。4℃、12000r/min离心15分钟，收集上清，即为细胞总蛋白。取适量的蛋白样品进行SDS分析，分离胶浓度为10%-12%，浓缩胶浓度为5%。电泳结束后，通过半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1-2小时，然后加入稀释好的鼠抗NSP4多克隆抗体（一抗），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3-5次，每次10分钟，然后加入稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG（二抗），室温孵育1-2小时。再次用TBST洗涤PVDF膜3-5次，每次10分钟，最后使用化学发光试剂进行显色，在凝胶成像系统下观察并拍照，以确定NSP4基因在蛋白水平的表达情况。将重组真核表达载体pcDNA3.1-NSP4大量转染至HEK293T细胞中，培养72小时后，收集细胞培养上清。将上清液通过0.22μm滤膜过滤，去除细胞碎片等杂质。使用ProteinA/G亲和层析柱对培养上清中的NSP4蛋白进行纯化，先使用BindingBuffer平衡层析柱，然后将上清液缓慢加入层析柱中，使目的蛋白与ProteinA/G树脂结合。用WashingBuffer洗涤层析柱3-5次，去除杂蛋白，最后用ElutionBuffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液。对洗脱得到的目的蛋白进行SDS分析，检测蛋白的纯度，使用Bradford法测定蛋白浓度。将纯化后的NSP4蛋白免疫Balb/c小鼠，制备鼠抗NSP4多克隆抗体。免疫程序为：初次免疫时，将NSP4蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，每只小鼠皮下注射100-200μg蛋白；2周后进行第一次加强免疫，将NSP4蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合，乳化后每只小鼠皮下注射100-200μg蛋白；此后每隔1-2周加强免疫一次，共免疫3-4次。最后一次免疫后7-10天，采集小鼠血清，使用间接ELISA法检测血清中抗NSP4抗体的效价。将纯化的NSP4蛋白包被于酶标板中，4℃过夜。次日，用PBST洗涤酶标板3-5次，每次5分钟，然后用5%脱脂奶粉封闭1-2小时。加入稀释好的小鼠血清，37℃孵育1-2小时。用PBST洗涤酶标板3-5次，每次5分钟，然后加入稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1-2小时。再次用PBST洗涤酶标板3-5次，每次5分钟，最后加入TMB底物显色液，37℃避光显色10-15分钟，加入终止液终止反应，在酶标仪上测定OD₄₅₀值。根据OD₄₅₀值确定抗体效价。三、实验结果3.1NSP4基因的克隆结果利用设计的特异性引物，以提取的猪轮状病毒RNA反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约[X]bp处出现了特异性条带（图1），与预期的NSP4基因大小一致，表明成功扩增出了NSP4基因片段。将扩增得到的NSP4基因片段与pMD-19T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。结果显示，部分单菌落经PCR扩增后在约[X]bp处出现了目的条带，与预期结果相符，初步证明重组质粒构建成功。对菌落PCR鉴定为阳性的单菌落提取重组质粒pMD-19T-NSP4，用BamHI和HindIII进行双酶切鉴定。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约[X]bp处出现了目的基因条带，同时在载体片段大小处也出现了相应条带（图2），进一步验证了重组质粒中含有正确插入的NSP4基因。将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序，测序结果经BLAST比对分析，与GenBank中已公布的猪轮状病毒NSP4基因序列同源性达到[具体同源性百分比]%，表明成功克隆出了猪轮状病毒NSP4基因，且基因序列正确，为后续原核与真核表达载体的构建奠定了基础。3.2NSP4基因原核表达载体的构建结果将克隆得到的NSP4基因与原核表达载体pET-32a(+)进行连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。结果显示，部分单菌落经PCR扩增后在约[X]bp处出现了特异性条带（图3），与预期的NSP4基因大小相符，初步表明重组原核表达载体构建成功。对菌落PCR鉴定为阳性的单菌落提取重组质粒pET-32a-NSP4，用BamHI和HindIII进行双酶切鉴定。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约[X]bp处出现了目的基因条带，同时在载体片段大小处也出现了相应条带（图4），进一步验证了重组质粒中含有正确插入的NSP4基因。为确保重组质粒中NSP4基因的序列正确性和读码框无误，将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序。测序结果经BLAST比对分析，与克隆得到的NSP4基因序列完全一致，表明成功构建了猪轮状病毒NSP4基因的原核表达载体pET-32a-NSP4，为后续在原核系统中表达NSP4蛋白奠定了基础。3.3NSP4基因在原核系统中的表达结果将重组质粒pET-32a-NSP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达后，进行SDS分析。结果如图5所示，在未诱导的重组菌和空载体诱导菌中，均未出现明显的特异性条带；而在IPTG诱导后的重组菌中，在约[X]kDa处出现了特异性条带，与预期的融合蛋白（NSP4与pET-32a载体上的His标签等融合）大小相符，表明NSP4基因在原核系统中成功表达。对诱导表达后的菌体进行超声破碎，分别收集上清和沉淀进行SDS分析，以确定目的蛋白的可溶性。结果显示，NSP4蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中（图6），上清中可溶性蛋白含量较低。这可能是由于原核表达系统中，蛋白表达速度过快，导致蛋白折叠错误，从而形成包涵体。为了获得纯化的NSP4蛋白，利用Ni-NTA亲和层析柱对超声破碎后的上清液进行纯化。SDS分析结果表明，经过亲和层析纯化后，在约[X]kDa处出现了单一的蛋白条带（图7），表明成功纯化得到了NSP4蛋白，且纯度较高。经Bradford法测定，纯化后的NSP4蛋白浓度为[具体浓度]mg/mL。为了检测表达的NSP4蛋白的免疫反应性，对纯化后的蛋白进行Westernblot分析。以鼠抗His标签单克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行检测。结果如图8所示，在约[X]kDa处出现了特异性条带，与SDS结果一致，表明表达的NSP4蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合，具有良好的免疫反应性。3.4NSP4基因真核表达载体的构建结果将克隆得到的NSP4基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。结果显示，部分单菌落经PCR扩增后在约[X]bp处出现了特异性条带（图9），与预期的NSP4基因大小相符，初步表明重组真核表达载体构建成功。对菌落PCR鉴定为阳性的单菌落提取重组质粒pcDNA3.1-NSP4，用KpnI和XhoI进行双酶切鉴定。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约[X]bp处出现了目的基因条带，同时在载体片段大小处也出现了相应条带（图10），进一步验证了重组质粒中含有正确插入的NSP4基因。为确保重组质粒中NSP4基因的序列正确性和读码框无误，将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序。测序结果经BLAST比对分析，与克隆得到的NSP4基因序列完全一致，表明成功构建了猪轮状病毒NSP4基因的真核表达载体pcDNA3.1-NSP4，为后续在真核系统中表达NSP4蛋白奠定了基础。3.5NSP4基因在真核系统中的表达结果将重组真核表达载体pcDNA3.1-NSP4转染至HEK293T细胞中，转染后48-72小时收集细胞，提取细胞总RNA和总蛋白，分别进行RT-PCR和Westernblot检测。RT-PCR结果显示，在转染了重组质粒pcDNA3.1-NSP4的细胞中，扩增出了预期大小的NSP4基因片段（图11），而在转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞和未转染的细胞中未检测到该条带，表明NSP4基因在mRNA水平成功表达。Westernblot检测结果如图12所示，在转染了重组质粒pcDNA3.1-NSP4的细胞中，在约[X]kDa处出现了特异性条带，与预期的NSP4蛋白大小相符，而在转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞和未转染的细胞中未出现该条带，表明NSP4基因在蛋白水平也成功表达。对转染重组真核表达载体pcDNA3.1-NSP4的HEK293T细胞培养上清进行ProteinA/G亲和层析纯化，SDS分析结果显示，在约[X]kDa处出现了单一的蛋白条带（图13），表明成功纯化得到了NSP4蛋白，且纯度较高。经Bradford法测定，纯化后的NSP4蛋白浓度为[具体浓度]mg/mL。将纯化后的NSP4蛋白免疫Balb/c小鼠，制备鼠抗NSP4多克隆抗体，使用间接ELISA法检测血清中抗NSP4抗体的效价。结果显示，免疫小鼠血清中抗NSP4抗体的效价达到[具体效价]，表明纯化后的NSP4蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激小鼠产生特异性抗体。四、讨论4.1NSP4基因克隆与序列分析本研究成功克隆了猪轮状病毒NSP4基因，通过特异性引物设计和RT-PCR技术，从感染猪轮状病毒的细胞中扩增得到了目的基因片段。克隆方法的有效性得到了实验结果的验证，1%琼脂糖凝胶电泳显示在预期位置出现了特异性条带，与目的基因大小一致，且测序结果与GenBank中已公布的序列具有高同源性。在引物设计时，引入合适的限制性内切酶酶切位点对于后续载体构建至关重要。酶切位点的选择需考虑其在载体和目的基因上的唯一性，以及酶切反应的效率和特异性。本研究中选用的BamHI和HindIII酶切位点，在后续的原核表达载体构建中发挥了关键作用，使目的基因能够准确地插入到载体中。同时，添加保护碱基保证了酶切反应的顺利进行，提高了重组质粒的构建成功率。对克隆得到的NSP4基因进行序列分析，发现其与已报道的序列存在一定差异。这些差异可能源于病毒的遗传变异，轮状病毒作为一种RNA病毒，其基因组在复制过程中容易发生突变。序列差异可能导致NSP4蛋白的氨基酸组成发生改变，进而影响蛋白的结构和功能。例如，某些关键氨基酸位点的突变可能影响NSP4蛋白与其他病毒蛋白或宿主细胞蛋白的相互作用，从而影响病毒的感染和致病过程。NSP4基因的序列特征对后续研究具有重要影响。在原核表达载体构建中，正确的基因序列是保证目的蛋白正确表达的基础。若基因序列存在错误，可能导致蛋白翻译提前终止或产生错误折叠的蛋白。在真核表达系统中，基因序列同样影响着转录和翻译的效率，以及蛋白的修饰和加工过程。此外，序列分析结果还为研究NSP4蛋白的进化关系提供了依据，有助于深入了解猪轮状病毒的分子流行病学特征。综上所述，本研究采用的NSP4基因克隆方法有效可靠，为后续实验提供了正确的基因模板。对基因序列的分析为进一步研究NSP4蛋白的功能和特性奠定了基础，同时也提示在后续研究中需要关注基因序列差异可能带来的影响。4.2NSP4基因原核表达载体构建与表达本研究成功构建了猪轮状病毒NSP4基因的原核表达载体pET-32a-NSP4，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达。原核表达载体构建的关键在于载体与目的基因的有效连接，本研究通过双酶切和连接反应，将NSP4基因正确插入到pET-32a(+)载体中，经菌落PCR、酶切鉴定和测序验证，证实了重组质粒的正确性。在原核表达过程中，诱导条件对蛋白表达量和可溶性有显著影响。IPTG浓度、诱导时间和诱导温度是需要优化的重要参数。本研究设置了不同的IPTG浓度（0.1-1.0mmol/L）、诱导时间（4-8小时）和诱导温度（16℃、25℃、37℃）进行诱导表达，结果表明，在较低的诱导温度（16℃）和较长的诱导时间（6-8小时）下，NSP4蛋白的可溶性有所提高，但表达量相对较低；而在较高的诱导温度（37℃）下，蛋白表达量较高，但主要以包涵体形式存在。这与其他研究中关于原核表达中温度对蛋白可溶性和表达量影响的结果一致。较低的温度可以减缓蛋白合成速度，有利于蛋白正确折叠，从而提高可溶性；但低温也会降低细菌的生长速度和代谢活性，导致蛋白表达量下降。因此，在实际应用中，需要根据具体需求和目的，在蛋白表达量和可溶性之间进行权衡和优化。此外，本研究中NSP4蛋白主要以包涵体形式存在，这可能与原核表达系统的特点以及NSP4蛋白的结构和性质有关。原核表达系统缺乏真核细胞中复杂的蛋白折叠和修饰机制，当蛋白表达速度过快时，容易导致蛋白折叠错误，形成包涵体。NSP4蛋白可能含有较多的疏水氨基酸或二硫键，这些结构特点使其在原核表达系统中更易形成包涵体。为了提高NSP4蛋白的可溶性，可以进一步优化诱导条件，如降低IPTG浓度、延长诱导时间、改变诱导温度等。也可以尝试添加分子伴侣或折叠助剂，帮助蛋白正确折叠。在后续的研究中，还可以探索其他原核表达宿主菌或表达载体，以寻找更适合NSP4蛋白表达的体系。通过亲和层析纯化获得了高纯度的NSP4蛋白，这为进一步研究蛋白的结构和功能奠定了基础。Westernblot分析表明，表达的NSP4蛋白具有良好的免疫反应性，能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合，这为利用该蛋白开发诊断试剂和疫苗提供了可能性。4.3NSP4基因真核表达载体构建与表达本研究成功构建了猪轮状病毒NSP4基因的真核表达载体pcDNA3.1-NSP4，并在HEK293T细胞中实现了表达。真核表达载体构建过程中，关键步骤同样是载体与目的基因的有效连接，通过双酶切和连接反应，将NSP4基因准确插入到pcDNA3.1(+)载体中，经菌落PCR、酶切鉴定和测序验证，确保了重组质粒的正确性。真核表达系统相比原核表达系统，具有更复杂的蛋白折叠、修饰和加工机制，能够表达出具有天然活性的蛋白。在本研究中，将重组真核表达载体转染至HEK293T细胞后，通过RT-PCR和Westernblot检测，证实了NSP4基因在mRNA水平和蛋白水平均成功表达。然而，真核表达系统也存在一些局限性，如转染效率较低、表达量相对不高、细胞培养成本较高等。在转染过程中，转染试剂的选择、转染时间和细胞密度等因素都会影响转染效率和蛋白表达水平。本研究中使用脂质体转染试剂进行转染，通过优化转染条件，如调整重组质粒和脂质体的比例、控制转染时间等，一定程度上提高了转染效率和蛋白表达量。真核表达系统表达的NSP4蛋白具有重要的意义。首先，真核表达的蛋白经过了正确的折叠和修饰，其结构和功能更接近天然蛋白，为研究NSP4蛋白的生物学活性和功能提供了更可靠的材料。其次，真核表达的NSP4蛋白可用于制备具有更高免疫原性的抗体，为开发基于NSP4的诊断试剂和疫苗奠定了基础。通过将纯化后的NSP4蛋白免疫Balb/c小鼠，制备了鼠抗NSP4多克隆抗体，且抗体效价较高，表明真核表达的NSP4蛋白具有良好的免疫原性。此外，真核表达系统还可以用于研究NSP4蛋白与其他细胞蛋白的相互作用，以及其在细胞内的定位和功能调控机制。利用免疫荧光等技术，可以观察NSP4蛋白在细胞内的分布情况，探讨其与细胞内其他分子的相互关系。这对于深入了解猪轮状病毒的致病机制具有重要意义。综上所述，本研究成功构建并在真核系统中表达了NSP4基因，虽然真核表达系统存在一些挑战，但通过优化条件，获得了具有良好免疫原性的NSP4蛋白，为后续研究提供了有力支持。未来的研究可以进一步探索更高效的真核表达系统和转染方法，提高NSP4蛋白的表达量和活性，推动基于NSP4的诊断试剂和疫苗的研发进程。4.4原核与真核表达系统的比较原核表达系统和真核表达系统在猪轮状病毒NSP4基因的表达研究中展现出各自独特的特点。原核表达系统以大肠杆菌为宿主，具有操作简便、成本低廉、生长迅速且易于大规模培养的显著优势。在本研究中，利用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌，在较短时间内实现了NSP4基因的表达，且表达量相对较高，能够快速获得大量的目的蛋白，为后续的蛋白研究提供了充足的材料。然而，原核表达系统也存在明显的局限性。由于缺乏真核细胞中复杂的蛋白折叠和修饰机制，本研究中NSP4蛋白主要以包涵体形式存在，这不仅导致蛋白的可溶性差，还增加了后续纯化和复性的难度。包涵体的形成使得蛋白难以正确折叠，需要经过复杂的变性和复性过程才能获得有活性的蛋白，这一过程往往会降低蛋白的活性和产量。此外，原核表达系统无法对表达时间及表达水平进行精确调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达还可能引发非生理反应。真核表达系统，如本研究中采用的HEK293T细胞表达系统，具有更为完善的蛋白折叠、修饰和加工机制，能够表达出具有天然活性的蛋白。真核细胞中存在多种分子伴侣和折叠辅助因子，能够帮助蛋白正确折叠，形成正确的空间结构。同时，真核细胞还能够对蛋白进行糖基化、磷酸化等修饰，这些修饰对于蛋白的功能和稳定性至关重要。在本研究中，真核表达的NSP4蛋白经过了正确的折叠和修饰，其结构和功能更接近天然蛋白，具有良好的免疫原性，能够刺激小鼠产生高效价的抗体。但真核表达系统也面临一些挑战，如转染效率较低、表达量相对不高、细胞培养成本较高等。转染过程中，重组质粒进入细胞的效率有限，导致只有部分细胞能够表达目的蛋白，从而影响了整体的表达量。而且，真核细胞的培养条件较为苛刻，需要使用特殊的培养基和培养设备，增加了实验成本和操作难度。综上所述，原核表达系统适合大规模、低成本地生产蛋白，尽管存在蛋白折叠和修饰方面的问题，但在对蛋白活性要求不高，仅用于抗体制备或初步检测等方面具有优势。真核表达系统则更适合表达需要正确折叠和修饰，具有天然活性的蛋白，对于研究蛋白的生物学功能、开发诊断试剂和疫苗等具有重要意义。在实际应用中，应根据研究目的和需求，综合考虑各种因素，权衡利弊后选择合适的表达系统。五、结论与展望5.1研究结论本研究围绕猪轮状病毒NSP4基因展开，通过一系列实验操作，成功构建了其原核与真核表达载体，并对表达情况进行了深入研究，取得了以下主要成果：NSP4基因克隆成功：从感染猪轮状病毒的细胞中提取总RNA，经反转录和PCR扩增，成功克隆出NSP4基因。通过1%琼脂糖凝胶电泳、菌落PCR、双酶切鉴定及测序分析，证实扩增得到的基因片段与预期大小一致，且与GenBank中已公布的猪轮状病毒NSP4基因序列同源性达到[具体同源性百分比]%，为后续载体构建提供了准确的基因模板。原核表达载体构建及表达：将克隆的NSP4基因与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功构建了重组原核表达载体pET-32a-NSP4。转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，SDS分析表明在约[X]kDa处出现特异性条带，与预期的融合蛋白大小相符，证明NSP4基因在原核系统中成功表达。优化诱导条件发现，较低温度（16℃）和较长诱导时间（6-8小时）下，NSP4蛋白可溶性有所提高，但表达量相对较低；较高温度（37℃）下，蛋白表达量较高，但主要以包涵体形式存在。通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的NSP4蛋白，Westernblot分析显示其具有良好的免疫反应性。真核表达载体构建及表达：将NSP4基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中，成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1-NSP4。转染HEK293T细胞后，RT-PCR和Westernblot检测证实NSP4基因在mRNA水平和蛋白水平均成功表达。对细胞培养上清进行ProteinA/G亲和层析纯化，获得了高纯度的NSP4蛋白，经免疫Balb/c小鼠制备的鼠抗NSP4多克隆抗体效价达到[具体效价]，表明真核表达的NSP4蛋白具有良好的免疫原性。原核与真核表达系统比较：原核表达系统具有操作简便、成本低、表达量高的优点，但NSP4蛋白主要以包涵体形式存在，可溶性差，后续处理复杂。真核表达系统虽转染效率较低、成本较高，但能表达出具有天然活性和正确修饰的蛋白，其免疫原性良好，更适合用于研究蛋白的生物学功能及开发诊断试剂和疫苗。5.2研究展望本研究在猪轮状病毒NSP4基因的原核与真核表达载体构建及表达方面取得了阶段性成果，但仍有许多问题值得进一步深入研究，为猪轮状病毒病的防控开辟新的道路。在表达条件优化方面，未来可深入探索更适宜的表达条件，以提升NSP4蛋白的表达量与质量。对于原核表达系统，可进一步研究不同诱导剂种类、诱导时机以及培养基成分对蛋白表达的影响。例如，尝试使用其他诱导剂如乳糖替代IPTG，可能在降低成本的同时，改善蛋白的表达情况；精准把握诱导时机，在细菌生长的特定阶段进行诱导，或许能提高蛋白的可溶性和表达量；优化培养基成分，添加某些氨基酸、维生素或微量元素，为细菌生长和蛋白表达提供更有利的环境。对于真核表达系统，除了继续优化转染试剂、转染时间和细胞密度外，还可探索不同的真核细胞系对NSP4基因表达的影响。不同细胞系具有不同的代谢特征和蛋白加工能力，筛选出更适合NSP4基因表达的细胞系，有望显著提高蛋白表达水平。也可研究不同的培养方式，如悬浮培养、固定化培养等，以提高细胞培养的效率和稳定性，进而提高蛋白产量。在蛋白功能研究方面，后续可深入探究NSP4蛋白的具体功能及其作用机制。利用蛋白质相互作用技术，如酵母双杂交、免疫共沉淀等，全面筛选与NSP4蛋白相互作用的宿主细胞蛋白和病毒蛋白，绘制详细的蛋白相互作用网络，深入解析NSP4蛋白在病毒感染、复制和致病过程中的分子机制。通过定点突变技术，对NSP4蛋白的关键氨基酸位点进行突变，研究突变后蛋白功能的变化，明确NSP4蛋白中各个结构域的功能，为揭示猪轮状病毒的致病机制提供关键线索。还可运用细胞生物学和动物模型实验，研究NSP4蛋白对细胞生理功能的影响，如对细胞凋亡、细胞周期、免疫调节等方面的作用，进一步加深对猪轮状病毒致病过程的理解。在疫苗研发方面，基于本研究获得的NSP4蛋白，可尝试开发新型的猪轮状病毒疫苗。将NSP4蛋白与其他具有免疫原性的猪轮状病毒蛋白（如VP4、VP7等）联合，构建多价疫苗，利用不同蛋白的免疫优势，激发机体更全面、更强的免疫反应，提高疫苗的保护效果。探索将NSP4基因或表达的蛋白制成核酸疫苗或亚单位疫苗，通过优化疫苗的配方、佐剂和免疫途径，增强疫苗的免疫原性和稳定性。在动物模型中进行严格的疫苗安全性和有效性评价，包括疫苗的免疫剂量、免疫程序、免疫持续时间以及对不同年龄、品种猪的保护效果等方面的研究，为疫苗的临床应用提供坚实的数据支持。在诊断试剂开发方面，利用表达的NSP4蛋白，开发高灵敏度、高特异性的猪轮状病毒诊断试剂。基于NSP4蛋白与抗体的特异性结合，建立酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析等诊断方法，实现对猪轮状病毒感染的快速、准确检测。优化诊断试剂的制备工艺和检测条件，提高检测的准确性和重复性，降低检测成本，使其更适用于临床诊断和大规模流行病学调查。将NSP4蛋白与其他诊断标志物联合使用，开发多重诊断试剂，提高对猪轮状病毒感染的诊断效率和准确性。综上所述，未来围绕猪轮状病毒NSP4基因的研究具有广阔的前景，通过在表达条件优化、蛋白功能研究、疫苗研发和诊断试剂开发等方面的深入探索，有望为猪轮状病毒病的防控提供更加有效的策略和方法，推动养猪业的健康发展。参考文献[1]李虹瑾，唐玉娇，刘嘉琳，刘斌。猪轮状病毒的研究进展[J].吉林农业科技学院学报，2021,30(02):11-15.[2]赵雅静，魏然，冯德杰，刘晨鸣，魏至栋，高雪军，朱莉萍。轮状病毒LLR疫苗株非结构蛋白NSP4基因稳定性研究[J].微生物学免疫学进展，2013,41(04):25-30.[3]朱明慧，李晓静，王浩民，乔可欣，朱嘉懿，赵春澎，王小引。原核和真核双表达载体的构建及功能分析[J].中国细胞生物学学报，2022,44(03):437-442.[4]庞春秀，林德馨。大鼠STIM1基因真核表达载体构建及蛋白表达定位[J].生物技术，2016,26(02):126-130.[5]王玲，蒲万霞，常惠芸，华兰英，索朗斯珠。仔猪轮状病毒性腹泻的研究进展[J].动物医学进展，2006,(10):50-54.[6]魏锁成，巩转娣，宋昌军。猪轮状病毒的细胞培养特性研究[J].中国动物检疫，2009,26(12):58-60.[7]杨文宇，朱玲，周远成，郭万柱，徐志文。猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律[J].中国兽医学报，2014,34(02):192-198.[8]包红，寇桂英，王名强，韩平，余黎，周旭。轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究[J].微生物学免疫学进展，2011,39(01):15-19.[9]鱼轲，魏至栋，庞兴，刘晓凡，刘溯，谢澎，王玉琳。不同代次牛肾原代细胞培养轮状病毒的比较研究[J].微生物学免疫学进展，2007,(04):1-5.[10]王树君，代长海，张莹，王进，李宇辉，胡晓明，李光谱，于洪涛。用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液[J].中国生物制品学杂志，2004,(06):380-382.[11]孟继鸿，张建琼，林陵。轮状病毒细胞培养的若干研究[J].南京铁道医学院学报，1993,(02):65-70.[12]张雷，卫广森。猪轮状病毒感染研究进展[J].现代畜牧兽医，2005,(04):42-44.[13]魏锁成。动物轮状病毒病的流行病学及综合防治[J].甘肃畜牧兽医，2005,(03):27-29.[14]王军，孙杰。猪轮状病毒的感染和防治[J].中国动物检疫，2005,(07):43.[15]苏小庚，吴周良，王正秀，孙继国，王爱华，陈龙宾，秦建华。犊牛轮状病毒的分离鉴定[J].河北农业大学学报，2005,28(04):93-96.[16]王正党，单文鲁，黄嘉驷，张福萍，刘明军。新疆幼畜和人非典型轮状病毒的调查和鉴定[J].病毒学报，1995,(04):336-341.[17]程健频，李昌铭，魏锦龙。仔猪轮状病毒性腹泻的调查与防治[J].甘肃畜牧兽医，2005,(05):26-27.[18]任文华，崔志洪。猪轮状病毒概述[J].畜牧兽医杂志，2005,24(05):21-25.[19]焦静波。猪轮状病毒病诊断与防制[J].畜牧与饲料科学，2009,30(07):53-56.[20]安红，崔保峰，余黎，胡广宏，陈汉泉，王名强，韩平，周旭。轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上的适应性培养及免疫原性分析[J].中国新药杂志，2012,21(10):1162-1165.[21]李崇，苏亚权，谢娟，林昌华，李凤梅，钟诚。仔猪轮状病毒感染与乳糖不耐受症的临床检测[J].南方农业学报，2012,43(08):1227-1229.[22]郭旋，陈静，刘欢，侯韶毅，龙凤，李莹莹，曾娟，兰家暖，刘芳，黄伟坚。广西仔猪腹泻病毒病原流行病学调查[J].南方农业学报，2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