CN112074294B 从冻干球生产肺炎链球菌荚膜多糖载体蛋白缀合物的方法 （默沙东有限责任公司）

2020.10.29PCT/US2019/0290342019.04.25WO2019/212842EN2019.11.07US2016252300A1,2016.09.01US2018099039A1,2018.0WO2017013548A1,2017.01从冻干球生产肺炎链球菌荚膜多糖载体蛋描述了一种生产肺炎球菌荚膜多糖蛋白缀或多种活化的肺炎球菌多糖和载体蛋白以载体蛋白冻干球和一种或多种多糖冻干球的形式分含特定血清型的多糖的多种缀合物用于生产用于疫苗的含有缀合物的组合的多价肺炎球菌免2(ii)两种或更多种第一水溶液，每种第一水溶液包含(i)4％至6％的蔗糖和(ii)两种(iii)缓冲剂，其中两种或更多种第二水溶液的量对应于至少所述两(c)在生产冻干球的升华干燥方法中分别干燥所述两种或更多种第一水溶液和所述两种或更多种第二水溶液以生产两种或更多种第一冻干球组合物和两种或更多种第二冻干(d)独立地将一定量的第一冻干球组合物与一定量的第二冻干球组合物组合，以提供所述重构的混合物包含浓度在1.1g/L至3.8g/L之间(g)将两种或更多种所述多种缀合物溶液组合，以生产包含两种或更多种缀合物的多2.根据权利要求1所述的方法，其中所述升华干燥4.根据权利要求1所述的方法，其中所述重构在八分钟或更短时间内进行和所述混合5.根据权利要求1所述的方法，其中每种缀合物溶液包含以重量对重量计以0.6至6.根据权利要求1所述的方法，其中每种缀合物溶液包含小于所述溶液中总多糖的39.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种多糖是从选自以下的一种或多种10.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体蛋白是选自以下的灭活的细菌类毒素：13.一种制备多价肺炎球菌缀合物疫苗的方法，所述多价肺炎球菌缀合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖(a)提供23种载体蛋白冻干球组合物和23种活化的多糖冻干球组合物，每种所述活化化的多糖冻干球组合物均不包含来自相同的肺炎链(b)分别将所述23种载体蛋白冻干球组合物的每一种与所述23种活化的多糖冻干球组(c)分别用有机溶剂重构每种所述23种冻干球混合物并混合，以生产多种重构的混合所述重构的混合物包含浓度在1.1g/L至3.8g/L之间(e)将所述23种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多14.一种制备多价肺炎球菌缀合物疫苗的方法，所述多价肺炎球菌缀合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖(a)提供15种载体蛋白冻干球组合物和15种活化的多糖冻干球组合物，每种所述活化的多糖冻干球组合物包含来自选自4(b)分别将所述15种载体蛋白冻干球组合物的每一种与所述15种活化的多糖冻干球组(c)分别用有机溶剂重构每种所述15种冻干球混合物并混合，以生产多种重构的混合所述重构的混合物包含浓度在1.1g/L至3.8g/L之间(e)将所述15种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多的所述多价肺炎球菌缀合物疫15.一种制备多价肺炎球菌缀合物疫苗的方法，所述多价肺炎球菌缀合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖(a)提供13种载体蛋白冻干球组合物和13种活化的多糖冻干球组合物，每种所述活化的多糖冻干球组合物包含来自选自(b)分别将所述13种载体蛋白冻干球组合物的每一种与所述13种活化的多糖冻干球组(c)分别用有机溶剂重构每种所述13种冻干球混合物并混合，以生产多种重构的混合所述重构的混合物包含浓度在1.1g/L至3.8g/L之间(e)将所述13种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多种缀合物溶液包含小于所述溶液中总多糖的15％的游离16.一种制备多价肺炎球菌缀合物疫苗的方法，所述多价肺炎球菌缀合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖(a)提供10种载体蛋白冻干球组合物和10种活化的多糖冻干球组合物，其中每种所述活化的多糖冻干球组合物包含来自选自5(b)分别将所述10种载体蛋白冻干球组合物的每一种与所述10种活化的多糖冻干球组(c)分别用有机溶剂重构每种所述10种冻干球混合物并混合，以生产多种重构的混合所述重构的混合物包含浓度在1.1g/L至3.8g/L之间(e)将所述10种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多液包含小于所述溶液中总多糖的15％的游离6球菌血清型的一种或多种活化的肺炎球菌多糖和载体蛋白分别以载体蛋白冻干球和一种血清型的多糖的多种缀合物用于生产用于疫苗的含有缀合物的组合的多价肺炎球菌免疫炎的死亡率高达8神经系统后遗症高达25％。参见Arditi等，1998,Pediatrics102:多糖免疫原与载体蛋白的化学缀合可将婴儿的免疫应答转化为一种依赖T细胞的免疫应[0006]因此，已经开发了包含与载体蛋白缀合的细菌荚膜多糖的多糖_蛋白缀合物疫苗，并且正在开发其他疫苗。已开发的缀合物疫苗的实例包括乙型流感嗜血杆菌菌(例如，PREVNAR@和PREVNAR)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria数的能力以及以所需溶液规格生产载体蛋白和多糖血清型供7[0009]本发明提供了一种生产用于肺炎球菌疫苗的多价肺炎球菌多糖载体蛋白缀合物多糖和载体蛋白离散干燥成冻干球的方法提供了优于多糖和载体蛋白共冻干的各种优点，[0011](a)提供第一冻干球组合物和第二冻干球组合物，所述第一冻干球组合物包含来[0012](b)将一定量的所述第一冻干球组合物与一定量的所述第二冻干球组合物组合在[0016](a)提供第一冻干球组合物和第二冻干球组合物，所述第一冻干球组合物包含来[0017](b)将一定量的所述第一冻干球组合物与一定量的所述第二冻干球组合物组合在一起，以提供具有所述一种或多种活化的多糖与所述载体蛋白的预定比率的冻干球混合[0021](a)提供第一冻干球组合物和第二冻干球组合物，所述第一冻干球组合物包含来[0022](b)将一定量的所述第一冻干球组合物与一定量的所述第二冻干球组合物组合在8[0025]在本发明的任何一种方法的特定实施方式中，通过选自冻干和辐射能真空(REV)脱水(微波真空干燥(MDV))的升华干燥方法第一冻干球组合物和所述第二冻干球组合物分别具有约3％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一冻干球组合物和所述第二冻干球组合物分别具有约2％或更低的第二水溶液包含载体蛋白和缓冲剂，其中所述第一水溶液和所述第二水或更多的蔗糖，且其中所述升华干燥选自冻干和辐射能真空(REV)脱水。在特定实施方式[0028]在特定实施方式中，所述第一水溶液包含浓度为约6至9mg/mL的所述多糖和所述[0030]在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(c)中的所述重9[0034]在特定实施方式中，所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的载体蛋白赖氨酸损失[0044](b)在生产冻干球的升华干燥方法中分别干燥所述第一水溶液和所述第二水溶[0045](c)将一定量的所述第一冻干球组合物与一定量的所述第二冻干球组合物组合在一起，以提供具有所述一种或多种活化的多糖与所述载体蛋白的预定比率的冻干球混合[0048]在所述方法的特定实施方式中，所述升华干燥方法选自冻干和辐射能真空(REV)第一冻干球组合物和所述第二冻干球组合物分别具有约3％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一冻干球组合物和所述第二冻干球组合物分别具有约2％或更低的[0050]在特定实施方式中，所述第一水溶液和[0051]在特定实施方式中，所述第一水溶液包含浓度为约6至9mg/mL的所述多糖和所述[0053]在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(d)中的所述重[0057]在特定实施方式中，所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的载体蛋白赖氨酸损失[0065]本发明还提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包[0067](i)两种或更多种第一水溶液，每种第一水溶液包含特定肺炎链球菌血清型的活[0070](c)在生产冻干球的升华干燥方法中分别干燥所述两种或更多种第一水溶液和所述两种或更多种第二水溶液以生产两种或更多种第一冻干球组合物和两种或更多种第二[0071](d)独立地将一定量的第一冻干球组合物与一定量的第二冻干球组合物组合，以[0074](g)将两种或更多种所述多种缀合物溶液组合，以生产包含两种或更多种缀合物[0075]在所述方法的特定实施方式中，所述升华干燥方法选自冻干和辐射能真空(REV)第一冻干球组合物和所述第二冻干球组合物分别具有约3％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一冻干球组合物和所述第二冻干球组合物分别具有约2％或更低的[0077]在特定实施方式中，所述第一水溶液和[0078]在特定实施方式中，所述第一水溶液包含浓度为约6至9mg/mL的所述多糖和所述[0080]在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(e)中的所述重[0084]在特定实施方式中，所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的载体蛋白赖氨酸损失物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖[0093](a)提供23种载体蛋白冻干球组合物和23种活化的多糖冻干球组合物，每种所述活化的多糖冻干球组合物包含来自选自种活化的多糖冻干球组合物均不包含来自相同的肺炎链球菌[0094](b)分别将所述23种载体蛋白冻干球组合物的每一种与所述23种活化的多糖冻干[0095](c)分别用有机溶剂重构每种所述23种冻干球混合物并混合，以生产多种重构的[0098]本发明还包括一种制备针对肺炎链球菌血清型多糖[0099](a)提供15种载体蛋白冻干球组合物和15种活化的多糖冻干球组合物，每种所述活化的多糖冻干球组合物包含来自选自和33F的肺炎链球菌血清型的干燥的活化多糖，其中所述15种活化的多糖冻干球组合物均[0100](b)分别将所述15种载体蛋白冻干球组合物的每一种与所述15种活化的多糖冻干[0101](c)分别用有机溶剂重构每种所述15种冻干球混合物并混合，以生产多种重构的[0103](e)将所述15种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清的所述多价肺炎球菌缀合物物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖[0105](a)提供13种载体蛋白冻干球组合物和13种活化的多糖冻干球组合物，每种所述活化的多糖冻干球组合物包含来自选自[0106](b)分别将所述13种载体蛋白冻干球组合物的每一种与所述13种活化的多糖冻干[0107](c)分别用有机溶剂重构每种所述13种冻干球混合物并混合，以生产多种重构的[0109](e)将所述13种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清的所述多价肺炎球菌缀合物疫苗。物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖[0111](a)提供10种载体蛋白冻干球组合物和10种活化的多糖冻干球组合物，其中每种所述活化的多糖冻干球组合物包含来自选自[0112](b)分别将所述10种载体蛋白冻干球组合物的每一种与所述10种活化的多糖冻干[0113](c)分别用有机溶剂重构每种所述10种冻干球混合物并混合，以生产多种重构的[0115](e)将所述10种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清第一冻干球组合物和所述第二冻干球组合物分别具有约3％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一冻干球组合物和所述第二冻干球组合物分别具有约2％或更低的冻包含所述载体蛋白的每种水溶液和包含所别包含约4％至6％的蔗糖和所述水性载体蛋白溶液分别包含约4％至[0119]在特定实施方式中，所述多糖水溶液分别包含浓度为约6至9mg/mL的所述多糖和所述载体蛋白水溶液分别包含浓度为约6至12mg/mL的所述载体蛋白。在特定实施方式中，所述多糖水溶液分别包含浓度为约6或9mg/mL的所述多糖和所述载体蛋白水溶液分别包含[0121]在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(c)中的所述重[0125]在特定实施方式中，所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的载体蛋白赖氨酸损失合物且不具有来自不同血清型的其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的方法或工艺，其中使用各种升华方法对肺炎球菌多糖和载体蛋白进行离散(或单独)冻冻干导致产生具有较少游离多糖(低于18％)的缀合物组合物，而如美国专利申请公开号上减少或消除了当通过将一种溶液添加到另一溶液或将干燥的物质溶解到溶液中而将两循环参数的能力，便于处理以及具有以所需溶液规格生产单个多糖和载体蛋白制剂的能[0146]图1显示了制备载体蛋白多糖缀合物的一般流程图，其中如本文所教导的那样以以外的所有血清型均经过0.45微米过滤。除血清型19A以外的所有血清型被均质化以降低[0148]然后，可以使用乙酸钠缓冲液将渗滤液1调节至血清型特异性温度(4–22℃之间)元的范围从约0.1至0.5摩尔偏高碘酸钠。选择偏高碘酸钠的血清型特异性的加入量[0151]使用5kDa切向流超滤膜，用2mM磷酸盐缓产最终含水量为6％或更低的干燥载体蛋白的冻干球。用于生产冻干球的升华干燥方法可化钠溶液的摩尔浓度基于缀合过程中约0.5％溶液总水含量的目标量。使缀合溶液在血清加至缀合溶液中。硼氢化钠溶液的摩尔浓度基于添加硼氢化钠后缀合溶液中约1.0％总水慢添加至含150mM氯化钠的溶液(含0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠)中而在稀物多糖与载体蛋白的比率和缀合物分子量来评估超滤膜，在2_8℃下使用高达约10个渗滤体积的150mM氯化钠或含25mM磷酸钾的150mM氯化率(UV_MALS_RI)确定来自超滤步骤3的渗滤液3中的多糖浓度。对于包含来自某些血清型[0160]在超滤步骤4中，可以将来自超滤步骤3的渗浓度，并使用300kDa切向流超滤膜，在2_8℃下使用20个渗滤体积的含10mML组氨酸的[0161]可以通过0.22微米过滤器对来自超滤步骤4的渗滤液4进行过滤以产生第二滤可以通过HPSECUV_MALS_RI确定第二滤液的多糖浓度。如果第二滤液的多糖浓度大于滤液的多糖浓度大于1.0g/L，则可以使用另外的在150mM氯化钠中的10mML组氨酸，准步骤(包括离心、沉淀和超滤)纯化各种多糖长的白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)菌株C7(β197)的培养物中分离得到CRM197使用PFENEXEXPRESSIONTECHNOLOGY(PfenexInc.,SanDiego,CA)制备荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)中的专利申请公开号WO93/17712和WO94/03208)、百日咳蛋白(参见国际专利申请公开号WO申请公开号WO91/01146)、包含多个来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工等，2004,InfectImmun72:4884_7)、铁摄取蛋白(参见国际专利申请公开号WO01/GeneticallyEngineeredToxins,Ed:Frankel,MaecelDekkerInc,1992中描述的其他突Phe530和/或Lys534的突变以及在美国专利号5,917,017或美国专利号6,455,673中描述Agriculture,Food,andBiologicalEngineering.MarcelDekker,IncorXu&Sunada,ChemPharmBull(Tokyo)55(11)[0179]市售氰基硼氢化钠试剂批次中游离氰化物水平的变化可SIAB、或SIA、或SBAP)反应后获得的硫醚键偶联至载体。在国际专利申请公开号WO93/白反应以形成氨基甲酸酯键。该化学反应包括还原碳水化合物的端基末端以形成伯羟基，[0186]培养肺炎球菌的方法是本领域熟知的。参见，例如，Chase,1967,Methodsof[0187]代表存在的每种肺炎链球菌血清型的细胞库是从MerckCultureCollection(Rahway,NJ)的冷冻小瓶(vial)中获得的。将解冻的种子培养物转移至含有适合于肺炎链其目标浓度约为4g/L。然后，将溶液进行0.45微米过滤以降低生物负荷。通过HPSECUV_MALS_RI确定过滤的Ps溶液的Ps[0197]通过基于每摩尔PnPs重复单元(RU)的高碘酸盐摩尔数向溶液中添加100mM偏高碘替10kDaNMWCO膜，通过保留酸水解产生的较低分子量Ps来提高Ps回收率。然后浓缩该溶[0202]使用5kDaNMWCO切向流超滤膜，用10倍渗滤体积通过如此前所述(参见国际专利申请公开号WO2012/173876)在荧光假单胞菌中表达获得WFI中新鲜配制的30％w/v蔗糖溶液将UF2_FRPs溶液稀释至Ps浓度为6.0mg/蔗糖溶液将UF2_FRPs溶液稀释至Ps浓度为6.[0208]使用血清型特异性蔗糖和磷酸盐浓度(表3)。按照如下所示，将稀释的CRM197和[0211]该实施例显示了用于生产多糖(Ps)和CRM197(Pr；CRM)冻干球的冻干机条件的开[0213]将改良的BiomekFX移液机器人(Cryomek)用于将溶液的50μL等分试样分配到[0214]初步(preliminary)干燥循环(Lyo1)耗时18小时，如表4.1中所示。通过KarlFisher滴定法确定的冻干球的残留水分含量如表4[0227]将改良的BiomekFX移液机器人(Cryomek)用于将溶液的50μL等分试样分配到[0228]检测了两个不同MVD循环，以干燥小珠。对于这两个循环，压力均保持在50至(Ps:Pr)比率和最终Ps浓度的方式组合在一起，以提供一种溶解在上述无水DMSO中的冻干期间约0.5％溶液总水含量的目标值。使溶液在血清型特异性温度下反应持续血清型特异[0235]