光电化学生物传感器研究现状

目录TOC\o"1-5"\h\u第一章绪论 21.1前言： 21.2光电化学传感器的相关研究 21.2.1光电化学生物传感器概述 21.2.2光电化学生物传感器研究现状 31.2.2.1半导体量子点 51.2.2.2半导体复合物 51.2.2.3半导体-贵金属复合材料 61.2.2.4半导体-石墨烯复合材料 61.2.3DNA纳米技术信号放大技术 61.3超顺磁Fe3O4的性能、制备及应用 81.4光电化学传感发展前景与展望 9第二章实验部分 102.1实验仪器 102.2实验主要试剂与材料 112.3CdTe量子点合成 122.4链置换反应体系的构建 122.5生物探针的制备 122.5.1Fe3O4@SiO2的制备 122.5.2Fe3O4@SiO2@HP1的制备 122.6光电化学传感器的构建 13第三部分实验结果与讨论 143.1Fe3O4@SiO2和CdTe的合成与表征 143.1.1透射电子显微镜表征 143.1.2X-射线衍射仪（XRD）表征 143.1.3X-射线光电子能谱仪（XPS）表征 153.1.4紫外线光谱表征和荧光光谱表征 163.2光电化学传感器的检测及传感机制 163.2.1光电化学传感器机理分析 163.2.2反应体系熵增过程 173.2.3光电流信号测试 183.2.4光电化学性能分析 183.2.5重现性、稳定性和特异性考察 193.2.6光电化学生物传感器的应用 20第一章绪论1.1前言随着科技的不断进步，一些新兴技术开始不断地被广泛关注。研究学者开始尝试不同领域技术的交叉结合以期望获得性能更好的检测传感器。光电化学生物传感器就是光化学与电化学相已经生物分析技术相结合的一种新型传感器。光电化学生物传感器因其操作简便、灵敏度高、成本低廉等多中优势引起了众多科学家的关注。是由生物材料作为敏感元件，电极作为转换原件，以电势或电流为特征检测信号。结合光电化学检测技术的优点，利用不同的生物识别原件构建不同体系的光电化学生物传感器检测不同的目标物，已经成为了重要的研究内容。目前对于光电化学生物传感器的研究主要集中在丰富光电子材料的种类、传感策略的巧妙构建、提高检测效果及临床应用发展。此外生物传感器的应用领域也十分广阔，在国民经济的各个部门如食品、化工、生物医学及病原微生物探究[1]等都有所涉及。过去对于生物传感器的研究主要在其准确性上，鉴于我们前期所做的工作将对今后的生物传感器的性能提升和运用等具有现实运用意义的问题进行系统的分析和综述。1.2光电化学传感器的相关研究1.2.1光电化学生物传感器概述光电化学反应是指光电活性物质在光照的作用下发生电子激发或电荷转移的光电转换过程。在50年代中期，在实验中已有人了解到当光照半导体电极而且光量子的能量大于半导体的带隙时，可以产生较大的光电流且远大于金属受光照产生光电子发射所能获得的电流。光电化学分析法也因其操作简单、成本低廉、灵敏度高、易于微型化和集成化等特点受到了业界人士的广泛关注。光电化学(Photoelectrochemical,PEC)生物传感,规避了传统检测分析方法设备昂贵，操作要求严苛等缺点[2]，是一种结合了光电化学分析技术及生物传感技术而发展的新型检测方法[3]，是一种通过生物识别元件和信号转换器输出的光电信号,记录生物事件的检测装置，如图1-1所示：图1-1：生物传感器的检测原理图生物传感器主要由生物感应元件和信号传导器两部分组成。生物感应元件主要是光电活性材料，光电活性材料的作用是在一定的波长光激发下产生光电流的物质[4]，具有光电转换特性，能够实时监测分析体系中的电流信号[5]。常用的光电活性材料包括无机半导体纳米材料[6]、有机小分子及聚合物、贵金属纳米粒子。生物传感器的主要功能是对被测物质进行选择性作用，即识别被测物质。信号传感器将生物元素和被测物质之间相互作用的物理和化学效应转换为可以输出的电信号。光化学生物传感器具有成本低、灵敏度高、特异性强、仪器操作简单、背景信号检测低等优点，在免疫检测和生物技术等重要领域具有广泛应用前景[7]。1.2.2光电化学生物传感器研究现状光电化学是一种新兴的、先进的分析方法，结合其优点，设置不同类型的生物识别元件可以制造出识别酶，DNA等其他物质的光电化学生物传感器。目前广泛运用的光电化学生物传感器检测方法有以下几种：一：光电化学免疫检测法：这是基于光电化学分析和免疫反应的结合的一种生物传感器，利用了抗原与抗体之间的高特异性结合能够导致相关信号发生改变这一原理，即利用抗原或抗体作为生物识别元件，达到检测相关物质的一种方法。如下图1-2所示图1-2：光电化学免疫传感检测原理图光电化学免疫传感器主要用于分析一些复杂的生物样本，如血液、尿液等，在临床检测运用较为广泛。根据标记与否，我们可将光电化学免疫传感器分为标记免疫分析和非标记免疫分析两大类[8]。标记免疫分析是通过对其抗原或抗体用酶、荧光物质等标记物做上标记，通过光学、电化学发光等方法对，在反应中跟踪并放大抗原或抗体的浓度变化，从而实现对目标物的高度检测。张等[9]在工作中首次涉及标记技术在PEC免疫传感中的运用，在一抗和抗原在电极表面形成免疫复合物后，并且通过夹心反应标记二抗-金纳米粒子-GOx生物复合物，形成三明治结构的免疫复合物，实现生物信号的放大，得到光电免疫传感器在50pg/mL~100ng/mL的范围内对突触核蛋白(α-synuclein)进行检测,检测限为34pg/mL。标记免疫分析法检测灵敏度高，但过程复杂、耗时长、稍显繁琐。未标记免疫检测是通过抗原或抗体反应过程中的物理和化学变化来计算目标物质的浓度。Cosnier的非标记免疫分析中，钌联吡啶配合物上被衍生连接了吡咯和生物素,然后利用吡咯的电聚合作用实现了光电物质在电极表面的固定该方法很好地实现了霍乱毒素抗体的免疫测定,检测限可以达到0.5μg/mL[10]。虽然操作简单，但检测的精准度不高，分析测定时间较长。二、光化学酶检测法：酶作为催化剂加入检测系统的方法。该检测器具有较高的特异性，酶的引入使光电流信号得到有效放大，灵敏度高。该方法常用的模式有两种，一是利用酶的催化反应将底物或产物作为电子供体或受体；另一种模式则基于酶催化反应中酶与光电活性材料两者间的直接或间接电荷转移来产生光电流[11]。前一种可以用于酶活性、葡萄糖的检测；后一种可以用于不同类型细胞的分辨。戴等利用生物酶诱导的生物催化沉淀反应，修饰酶催化沉淀反应产生的电子受体捕获三明治结构二级抗原上的发光电子，提高电流强度，实现白细胞介素的灵敏检测[3],其原理图如图1-3所示。图1-3：白细胞介素的检测原理图光电化学酶检测法可以解决某些物质特异性高的问题，但其运用的范围有一定的局限性，只能针对一些特定的分子开发一些传感体系。此外，一些酶在催化反应过程的时候，还需要一些酶分子的辅助，这就使得操作过程十分的繁琐，增加了检测体系的复杂程度。三：光电化学核酸检测法；核酸对医疗的诊断、疗效的评估和动态的检测有着至关重要的作用[12]。核酸是高分子化合物，其自身的结构性质具有可修饰的特点，最为常见的是脱氧核酸。核酸具有特定的碱基配对原则，可以通过链杂交反应实现对核酸链的特异性检测；而部分经筛选的出来的寡核苷酸可以作为适配体，能够与对应的配体完成强特异性，高亲和力的结合，从而完成对某个特定生物分子的检测。基于这一检测原理，也可以构建相应的体系，在其中用嵌入或做标记的方式，加入信号分子，让光电流发生变化，从而达到放大电信号的效果。李等通过G碱基被氧化前后引起的光电流变化实现了目标DNA的检测。Willner课题组[13]就通过将适配体标记具有光电活性的CdS量子点，实现了识别反应前后光电流信号从无到有，从而实现了对可卡因的特异性检测。洪等[14]通过构建适配体-核苷酸嵌合体靶向癌细胞用于沉默半乳糖凝集素-1的基因治疗研究，评估了该嵌合体在细胞内的基因沉默效果。利用核苷酸的反应，通过改变核酸链的长度、碱基的排列顺序也可以实现对检测信号的放大。1.2.2.1半导体量子点半导体量子点，简称为量子点，有时也叫纳米晶，是一种具有具有尺寸依赖性的半导体纳米晶。量子点独特的性质则是其自身的量子效应，当颗粒尺寸进入纳米量级时，够展现出许多不同于宏观材料的物理化学性质[15]。而且其具有良好的光稳定性，宽的激发谱和窄的、可调谐的发射谱，正是因为这些独特的光化学特性，量子点引起了人们的广泛关注。此外，量子点是一种是一种高效的多光子吸收器，可用于三维多光子显微镜和成像。如今，生物结合量子点已被广泛的运用于细胞标记，组织成像等领域。近几年来，许多研究人员还积极探究利用量子点对小分子或离子进行化学传感，证明了量子点的广泛适用性。1.2.2.2半导体复合物半导体复合物是由一类化合物构成的半导体材料，能够极大改善半导体的性能。满足能交错匹配的半导体复合，可以促进系统电荷分离、延长载流子寿命和扩大半导体的光谱响应范围[16]。半导体复合物的异质结可以分为同型异质结和异型异质结，其中同型异质结主要通过能级差发生载流子转移，而异型异质结既可以通过能极差发生载流子转移也可以通过P-N节内的内建电场使载流子发生转移。1.2.2.3半导体-贵金属复合材料贵金属复合材料是由两种或两种以上不同类型的相容性材料用物理方法合成的具有多相结构的贵金属材料。按照非贵金属相的形态和分布，可以分为：贵金属层状复合材料、弥散强化贵金属复合材料、颗粒增强责金属复合材料和贵金属纤维复合材料四类。其制备方法主要有水相合成和有机相合成两种，因其具有独特的物理化学性能，如导电、导热性好，抗氧化、抗腐蚀等，在药物合成，光催化，电催化，等领域应用前景广阔。1.2.2.4半导体-石墨烯复合材料石墨烯是由SP2杂化的碳六元环组成，是一类具有独特性质的新型碳纳米材料[17]，其在科学界能够熠熠生辉离不开他的超薄性、坚固性、超强的电子传播速度及其良好的光学、磁学、力学和热学性质。石墨烯具有巨大的比表面积和优异的电子传输性能，为了制备性质更为优良的半导体材料，石墨烯复合材料应运而生。其制备方法主要有两种:非原位复合和原位生长。张等[18]以石墨烯量子点为电致化学发光试剂构建基于双重放大策略的microRNA传感器，用于实样检测癌细胞内microRNA检测，拓宽了该microRNA的应用范围。石墨烯复合材料具有优异的光催化性能[19]、独特的结构和性质，因此被广泛地运用于光催化、生物传感、锂离子电池等。1.2.3DNA纳米技术信号放大技术DNA纳米技术是一种多学科交叉的研究领域，主要是利用DNA纳米尺寸级别、刚性结构、编码性强[20]、结构灵活[21]等特点来构造各种纳米材料。DNA纳米技术信号放大技术就是基于这一原理的产生的一种DNA扩增放大技术。DNA纳米技术信号放大技术主要包括DNA等温扩增技术、DNA自组装放大技术和DNA循环放大等。一、DNA等温扩增技术是一类技术方法的总称。其中聚合酶链式反应（PCR）是最广泛的一种高效率的体外核酸扩增技术[22]，是通过重复的热循环实现DNA数量的指数型增长。其基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。操作方法简单、快速、高效、灵敏度高[23]，但是这种方法成本高，不利于大规模的使用。DNA等温扩增技术中最典型的是滚环扩增技术（PCA），是模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程。以环状DNA为模板,通过一个与部分环状模块互补的短的DNA引物，在酶的催化下将dNTPs转变为单链DNA，此单链DNA包括成百上千个重复模块互补片段。2000年Notomi等人提出了环介导等温扩增（LAMP），能在等温条件下短时间内进行核酸扩增，是一种特异、灵敏、简单、迅速的基于扩增方法。还有一种常用的方法是链置换反应扩增技术（SDA），这是一种基于酶促反应的DNA体外扩增技术。随着科技的进步，这些技术也正一步一步的趋向完善。二、DNA自组装是基于碱基互补配对原则，通过设计DNA链的碱基序列，以形成具有固定尺寸、形貌且稳定的新型纳米结构的过程[24]，如图1-4所示。图1-4：链置换反应图DNA纳米结构通过自组装技术，可用于电化学生物传感器的生物信号放大，从而提高传感器的灵敏度。Zhao等人[25]基于原位形成的dNA-SA网状结构构建了一种生物传感体系，用于检测DNAp53，具有高灵敏度。Zhang等[26]报道了一种过氧化氢酶（CAT）功能化的DNA-PtNPs网状结构的电化学适体传感器，用于检测血小板源性生长因子。目前，研究人员在DNA自组装技术这个领域已经建立了诸多二维、三维的复杂纳米结构[27]，并将其用于电化学生物传感器的生物信号放大。三、目标物循环放大策略可以将目标物重复多次利用，达到提高检测灵敏度的目的[28]。DNA循环放大分为有酶和无酶两种。酶辅助的DNA循环是通过酶的作用，将目标物或与目标物有关的物质释放出来参与下一轮的过程，实现单个目标物或与目标物有关的物质多次循环利用，从而实现信号放大。研究者们基于酶的高效性也建立各种传感器用于检测痕量目标物。Ren等[29]、Wang等[30]都基于这一原理设计了电化学传感器分别对目标物实现了高灵敏的检测。但是由于酶大多数属于蛋白质，容易受到外界因素的影响，如PH、温度等，且成本高，易失活，适用范围并不广。因此，无酶的DNA循环放大受到了众多研究者的关注，这样就克服了酶的缺点。其中最具代表性的一种就是DNA发夹结构催化自组装（CHA）。这就需要我们设计两个发夹结构DNA，当目标物DNA不存在时，这两个DNA发夹不能相互作用打开，当目标物DNA存在时，目标物会打开其中一个DNA发夹，被打开的DNA发夹能够打开另外一个DNA发夹，在此过程中，两个DNA发夹的互补碱基对数大于目标物DNA与被打开的DNA发夹的互补碱基对数，因此目标物DNA不会被置换下来，参与下一轮的过程。Liu等[31]、Gao等[32]就基于这一原理分别构建了一种无酶超灵敏的核酸分析方法，实现了对目标物的超灵敏检测。1.3超顺磁Fe3O4的性能、制备及应用磁性纳米粒子具备独特的性质，如量子尺寸效应、表面与界面效应和小尺寸效应和特有的磁性[33]等，在许多领域发挥着重要的应用价值,主要运用在生物医学和生物科技领域[34]。四氧化三铁磁流体是开发最早，至今使用最广泛的磁流体之一。超顺磁Fe3O4具有制备简单、无毒、尺寸小、流动性强、可控性强、易分离等特点，运用前景广阔。制备Fe3O4的方法有共沉淀法、水热法、微乳液法[35]、高温热分解法等。共沉淀法是目前研究最为成熟的一种磁性纳米粒子的制备方法[36]，是通过磁场环境或者是高速离心机将沉淀分离出来，操作简单，反应环境温和，成本低且容易大量制备，但是制备过程中容易受到水解平衡影响，会造成粒子形状不规整。Cheng等人[37]就利用共沉淀法将氢氧化四甲铵作为碱和保护剂，制备出了9nm左右的Fe3O4纳米颗粒。水热法是利用液-固反应来获得磁粒子，反应温度高，有利于Fe3O4性能的提高，也可以通过控制反应时间、温度、底物浓度的大小控制Fe3O4粒子大小。Li等[38]探究了一种能够合成不同种类纳米颗粒的方法，此法就是水热法。微乳液法是通过铁盐溶液在表面活性剂与有机溶剂自发形成的微水相中反应得到磁性Fe3O4纳米颗粒的方法[39]。此种方法可以制得粒子直径小、形状规整的纳米粒子，但是产率低，成本高。通过调节表面活性剂的用量和微水相内核的大小可以制备出不同粒径的Fe3O4的纳米颗粒[40]。高温热分解法是通过利用一些沸点比较高的有机试剂，并通过加热分解制得磁性纳米粒子。Kovalenko等人[41]以十八烯和二苯醚或二十四碳烷的混合液作为溶剂，以油酸钠、油酸钾、油酸和油酸二丁作为颗粒表面稳定剂，高温分解油酸铁制备Fe3O4纳米颗粒。这种方法相比于沉淀法在粒子尺寸可调、结晶度、粒子形貌等方面优势出众,所以要想获得高质量的晶体就可以采用高温热分解法，但是方法相对复杂一些，成本也较高。纳米科技的迅速发展使得超顺磁Fe3O4纳米粒子在众多领域得到了广泛的应用。李等人[42]利用超顺磁Fe3O4具有选择性好的特点，制备了Fe3O4@SiO2@TiO2磁性-光学双功能信标用于新型PEC传感器。该传感器可选择性捕获复杂生物样品中的孕酮，进行磁分离和清洁，并在纯磷酸盐缓冲液中检测到溶液（PBS），该磁分离策略有效的从修饰的电极表面取出来复杂的共存物种，大大的提高了PEC传感器的选择性，如图1-5所示。图1-5：适体的Fe3O4@SiO2@TiO2捕获DNA的孕酮的示意图超顺磁四氧化三铁目前是个医疗疾病诊断、治疗的重要工具，在基因靶向给药、细胞分离、自动化DNA提取、热疗和磁共振[43-45]等方面作用显著，为生物医学提供了新的平台和机遇。该材料的制备与功能化已经成为了一个研究热点，在数据存储和环境治理等领域也有潜在价值[46]。1.4光电化学传感发展前景与展望光电化学传感在检测和分析生物分子方面因其高灵敏度和独特的信号放大机制引起了众多学者的关注，具有广阔的运用前景,并被广泛应用于蛋白、糖类、重金属离子、核酸、微生物等样品检测的研究[47]。目前，光电化学传感仍然处于一个起步阶段，想要进一步的发展还需要我们克服诸多的困难和挑战[48]。首先，新型光电活性材料的制备与应用是光电化学传感发展的重要基础，光电活性材料的结构性质决定了光电化学传感器的分析性能和应用范围[49]。随着纳米技术和科学材料的发展，为光电化学传感的进一步发展提供了机会。制备出稳定性好、生物相容性强的光电信标材料可以大大的提高传感器的分析性能和灵敏度。其次是新型光电化学传感体系的建立与运用。目前我们已经利用光电化学传感体系建立了多种检测模式，但是仍有一些潜在的传感原理等待我们去发掘和探索。另外我们还要注意检测系统的微型化、阵列化，尽可能的提高系统的检测速度和自动化程度同时降低检测成本。相信随着光电活性材料、传感体系和检测模式的不断革新，光电化学传感将在未来的环境、食品和医学等诸多领域发挥重要作用。实验部分设计了一个新型的基于核酸-适体结合复合物驱动的三维DNA纳米机器信号探针的超灵敏检测microRNA-181a的光电化学生物传感器。2.1实验仪器实验主要仪器见表2-1。表2-1实验主要仪器仪器名称型号生产厂家回流控温装置自组装pH计PHS-3C上海仪电科学仪器股份有限公司超声波清洗器KQ-5013昆山市超声仪器有限公司超导量子干涉仪MPMS(SQUID)美国量子设计公司台式冷冻离心机TDL-16C上海安亭科学仪器厂电子分析天平JJ224BC常熟市双杰测试仪器厂电化学工作站CHI660D上海华辰仪器有限公司X射线衍射仪BrukerD8德国布鲁克公司透射电子显微镜JEOL-2100F日本日立公司荧光光谱仪CX-9800（T）无锡创想分析仪器有限公司2.2实验主要试剂与材料实验所用主要化学用品及材料见表2-2，生物材料见表2-3。表2-2化学试剂及材料试剂化学式规格生产厂家氯化镉CdCl2∙2.5H2OAR国药试剂集团硼氢化钠NaBH4AR国药试剂集团碲粉Te5N国药试剂集团3-巯基丙酸C3H502SAR国药试剂集团2-丙醇C3H8OAR国药试剂集团氯化钠NaClAR国药试剂集团氯化钾KClAR国药试剂集团乙醇C2H5OHAR国药试剂集团氯化镁MgCl2AR国药试剂集团氯化锌ZnCl2AR国药试剂集团三氯化铁（六水）FeCl3∙6H2OAR国药试剂集团盐酸HCLAR国药试剂集团氨水NH3·H2OAR国药试剂集团表2-3生物材料一览表材料名称碱基序列S15'-ACTCACCGACAGCGTTGAATGTTAGCCGTAAGTTAGTTGGAGAGCTAGG-3'microRNA-181a5'-AACATTCAACGCTGTCGGTGAGT-3'Fuel5'-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCTAACATTCAACGCTGTCG-3'S25'-CTTTCCTACACCTACGTCTCCAACTAACTTACGG-3'S35'-CCACATACATCATATTCTAACATTCAACGCTGTCG-3'HP15'-CGTAGGTGTAGGAAAGACAAAGTTCTTTCCTA-3'HP25'-TCTTTCCGAGGAAGTAGGAAAGAACTTT-3'2.3CdTe量子点合成利用Cd2+和NaHTe溶液得反应制备胶体CdTe水溶液。首先称取137.5mg的CdCl2溶在20ml水中加入130μL巯基丙酸，用2molL-1NaOH调节PH至8.5。将所得溶液放置于一个三口烧瓶中，通氮气30分钟。再称取50mgNaBH4溶于2mL水中，通氮气3分钟，加入80mg碲粉，反应至溶液呈浅粉色，取1mL上清液加入三口烧瓶中，99℃回流6小时，最后洗涤，离心，存于纯水中。2.4链置换反应体系的构建利用三条链制成底物，接着引入microRNA与底物作用，超声4小时，替换掉底物中的一条链，接着加入F（Fuel）链，超声4小时，得到产物链（output）。microRNA也会掉落，参与下一次的循环。2.5生物探针的制备2.5.1Fe3O4@SiO2的制备首先，将NaOH（50mmol）溶解在20mLDEG溶液中，在N2保护下120°C加热混合溶液1h，形成均匀的NaOH/DEG溶液冷却、密封，在烘箱中60°C保温备用。其次，将PAA（12mmol）、FeCl3（1.2mmol）和DEG（51mL）的混合溶液在N2保护下搅拌均匀，220°C加热1h，然后，取5.4mL制备好的NaOH/DEG溶液迅速注入上述混合溶液中，继续加热1h，待反应结束后，自然冷却至室温，用乙醇和水的混合溶液洗涤数次，制得约90nm的Fe3O4磁铁矿簇，分散在9mL的纯水中备用。将上述9mLFe3O4悬浮液在60mL乙醇中分散均匀，加入3mL氨水，室温下剧烈搅拌15min，然后将180μL的TEOS快速注入上述混合物中，反应30min，制得Fe3O4@SiO2微球，用乙醇和水洗涤数次，然后分散在15mL的乙醇（99%）中备用2.5.2Fe3O4@SiO2@HP1的制备将一锅Fe3O4分散在30ml无水乙醇加入50μLAPTES，氮气保护控温合流80℃3h。反应后，醇洗4遍，水洗两遍（8000转3min），取500μL加入缓冲溶液稀释定容十倍成5ml，取1mL。200μL0.1MEDC和200μL0.1MNHS加入至1.5ml缓冲溶液中,加入HP1（50μL，5μM)，后活化3h，加入1mL稀释过的Fe3O4@SiO2室温摇床震荡4h，磁吸30min，用吸管吸取上清液，加入缓冲溶液250μL。2.6光电化学传感器的构建取50μLFe3O4@SiO2@HP1溶液加入到链置换体系的溶液中，再加50μL的缓冲溶液，在4oC下，震荡，反应过夜。然后磁吸，洗涤备用。定容到2.5μM20μL，加入100μL的稀释了40倍的CdTe溶液；在室温条件下，在玻璃瓶中将100μL2μMHP2加入到5μL、3.5nMAu纳米颗粒溶液中，摇床搅拌过夜；在4℃下，取25μL的HP2溶液加入到HP1溶液中，震荡，反应静置过夜，然后磁吸。将磁球磁吸出来，取清夜，测光电流，具体如图2-1所示。图2-1：对microRNA-181a的光电化学传感器的构建实验结果与讨论3.1Fe3O4@SiO2和CdTe的合成与表征3.1.1透射电子显微镜表征图为Fe3O4纳米簇（A）、Fe3O4@SiO2（B）、CdTe（C）、CdTe的晶格（D）形貌的HRTEM图像。图A为Fe3O4胶体纳米团簇，平均直径为90nm，由尺寸约为10nm的纳米晶体组成。图B为Fe3O4@SiO2核-壳结构，材料尺寸增加到了约170nm，同时可以明显看出Fe3O4胶体纳米团簇表面有了一层光滑的SiO2壳层。图C为CdTe的显微镜表征图，呈颗粒状，尺寸均一，分布均匀。图D为CdTe的晶格，为0.362nm，与之前的报道吻合。图3-1：（A)Fe3O4纳米簇电镜图（B）Fe3O4@SiO2电镜图（C）CdTe电镜图（D）CdTe的晶格电镜图3.1.2X-射线衍射仪（XRD）表征对纳米合成材料Fe3O4、Fe3O4@SiO2和CdTe进行XRD图谱表征（图）。如图所示，曲线a在22.15°,30.10°,35.05°,43.05°,53.40°,56.95°,62.50°和74.9°处的衍射峰分别对应于标准卡片（JCPDS19-0629）上Fe3O4的111,220,311,400,422,511和440对应的晶面特征峰。曲线b的峰位置几乎与曲线a相同，但是因为表面覆了SiO2壳层稍有减弱。曲线c为CdTe的XRD谱图，在26.7°，43.8°和51.6°的衍射峰分别对应于标准卡片上的111，220和331对应的晶面特征峰，与之前的文章的结果一致。图3-2：Fe3O4（曲线a）、Fe3O4@SiO2（曲线b）和CdTe（曲线c）的HRTEM图像3.1.3X-射线光电子能谱仪（XPS）表征用XPS光谱进一步确定Fe3O4@SiO2的元素组成和价态。在测试前先用电子束逐层蚀刻样品。在XPS的全扫描图谱中（图A），可以明显观察到Fe2p,O1s和Si2p元素的存在位置。为了获得上述3个元素的详细信息，还显示了放大图（图B-D）。如B图所示，Fe2p的两个峰分别出现在710.7eV（Fe2p3/2）和723.9eV（Fe2p1/2）处，这两个峰可以分别认为是Fe(III)和Fe(II)。O1s的峰值为530.5eV（图C），这与Fe3O4中的O组成一致，即表明复合材料中存在Fe3O4。Si2p在103.1eV处和O1s在532.4eV处的XPS光谱又可以证明SiO2壳层的成功包覆（图C和D）。图3-3：Fe3O4@SiO2微球的XPS谱图，（A）XPS测试，（B）、（C）、（D）分别对应于Fe2p、O1s、Si2p的XPS高分辨谱图3.1.4紫外线光谱表征和荧光光谱表征图A、B分别为Au和CdTe的紫外-可见光谱图和荧光光谱图。图A中黑色的曲线为Au的紫外可见吸收曲线，红色曲线为量子点CdTe的紫外吸收可见曲线。这两条曲线的吸收峰范围一致，都在530nm~560nm，说明它们有相同的吸收峰。图B为荧光光谱图，红色曲线为量子点CdTe的荧光强度曲线，黑色曲线为加入了金胶溶液之后的量子点CdTe的荧光强度曲线，可以明显的看出荧光强度减弱了很多，从而证明了Au纳米颗粒可以猝灭量子点CdTe。图3-4：（A）Au和CdTe的紫外线光谱表征图（B）CdTe和加了Au的CdTe的荧光光谱图3.2光电化学传感器的检测及传感机制3.2.1光电化学传感器机理分析如图所示，在室温下对Fe3O4@SiO2（a）、Fe3O4@SiO2@HP1（b）、Fe3O4@SiO2@HP1@output（c）和Fe3O4@SiO2@HP1@output@HP2@Au（d）进行了电化学阻抗的测试。图中的Nyquist半圆对应于电子转移电阻（Rct）。曲线a对应于Rct为1600Ohm的Fe3O4@SiO2颗粒。与a相比，曲线b的Rct增加到了2800Ohm，表明发夹DNAHP1已经成功的与Fe3O4@SiO2结合。当将生物大分子DNA的阴离子聚合物组装在功能化的Fe3O4@SiO2@HP1上面，会阻止带负电的氧化还原探针扩散到电极上，从而导致Rct增大（曲线c）。因为金属离子导电性强，所以当Au纳米颗粒结合成功后，曲线d的Rct减小到3100Ohm。、图3-5：Fe3O4@SiO2（曲线a）、Fe3O4@SiO2@HP1（曲线b）、Fe3O4@SiO2@HP1@output（曲线c）和Fe3O4@SiO2@HP1@output@HP2@Au（曲线d）不同材料修饰的玻碳电极，在2.5mMK4Fe(CN)6,K3Fe(CN)6溶液中的电化学阻抗图。3.2.2反应体系熵增过程为了确认熵驱动系统的高效运行，我们引入相应的热力学理论来校准反应中吉布斯自由能的变化（图）。如公式1所示，参数ΔH，ΔS和T分别是系统焓，熵的变化和热力学温度。(1)由于在整个DNA行走过程中没有任何DNA酶的参与，所以体系中碱基对的数量保持不变，因此可以确定ΔH≈0。所以释放的分子的熵增加以热力学方式驱动反应，并且该驱动力始终为TΔS。然后，可以根据方程式2中的吉布斯自由能变化来校准所有组分的最终浓度。(2)在此，Q和ΔG0X分别被称为标准条件下的反应熵和相应物种的自由能。这些物种在含有0.1molL-1Na+，0.05molL-1Mg2+的Tris-HCl缓冲溶液中于25°C下反应。c0=1molL-1。参数Q可用公式3表示。ΔG0X可以通过免费的NUPACK软件获得，并由此得到公式4。(3)(4)然后，可以根据等式2和4可以计算得出，当反应条件达到平衡状态时Q值为1.31，其中ΔG=0。根据图的方程显示，设投入的反应物初始浓度均为1μmolL-1，U的最终浓度为xμmolL-1。然后可以根据公式3给出以下方程式。结果，通过计算得出x的值在999.1至999.2之间，表明在不考虑反应时间的情况下，反应体系的转化率大于99.9%图3-6：链置换反应方程以及对应的热力学参数3.2.3光电流信号测试光电流是光辐射场对放电气体作用引起放电参数变化的一种效应，其检测方法操作简单且灵敏度高。下面的两幅图就是基于这一原理所得到的光电流检测图，图A是在没有目标RNA存在的情况下，得到的光电流检测曲线。可以清楚的看出在没有目标RNA存在的情况下，光电流信号为0，所以此次实验的展开是基于一个零背景的情况下。图B是加入了目标RNA的情况下，此时的microRNA-181a的浓度为10fmolL-1，光电流信号为37.82nA。有了目标RNA存在，就能释放出产物打开发夹DNAHP1，从而结合更多的Au纳米颗粒，这样磁吸之后上清液里Au纳米颗粒量减少，光电流信号显著增加。图3-7：（A）在无microRNA181-a下的光电流测试图（B）在10fmolL-1microRNA181-a下的光电流测试图3.2.4光电化学性能分析基于光电化学传感器的独特传感机制，制作的PEC传感器为临床血清中的miRNA-181a分析提供了一种定量方法。将相同体积的不同浓度的microR