细菌学教学课件 第五章 细菌的基因表达

第五章细菌的基因表达

一、细菌基因与基因工程概念二、基因工程相关的酶学三、基因工程的载体四、细菌功能基因的结构五、基因的转录六、基因的翻译七、原核基因表达系统一、细菌基因与基因工程概念

1.1基因是什么？“能够表达出一个有功能的多肽链或功能RNA分子的核酸序列”。1.2基因工程（geneengineering)将不同的生物基因（供体）在体外人工剪切，组合并与载体（质粒，噬菌体，病毒）DNA连接，然后，引入原先没有这类基因的细胞（受体）内进行扩增，使转入基因在细胞内高效表达即合成该基因所编码的蛋白质或多肽。二、基因工程相关的酶学1、核酸限制性内切酶（restrictionendonuclease)2、连接酶（ligase)3、聚合酶（polymerase)4、DNA和RNA修饰酶5、核酸酶2.1核酸限制性内切酶

（restrictionendonuclease)

2.1.1核酸限制性内切酶：一类能够识别和切割某种特定核苷酸序列且能产生具有二重对称特异序列（回文序列,palindromicsequence))2.1.2命名与表示：

细菌属名第一

细菌种名前两

菌株

个字母（大写斜）

个字母（小写斜）例如：流感嗜血杆菌

HaemophilusinfluenzaRd(株）

HindI,HindII,HindIII方向5’3’BamHIGGATCCEcoRIGAATTCSmaICCCGGG++2.1.3影响限制性核酸内切酶的活性*DNA纯度*DNA甲基化程度*底物DNA的分子结构*反应温度*反应系统组成2.1.4限制性核酸内切酶应用*DNA重组*构建新质粒*DNA物理图谱*DNA分子杂交*制备DNA放射性探针*DNA序列分析

2.2DNA连接酶(ligase)DNA连接酶：催化具有5’-磷酰基与3’-羟基末端彼此相邻的二条链形成磷酸二酯键的酶。*大肠杆菌DNA连接酶**T4DNA连接酶T4噬菌体DNA编码；Mg2+和ATP为辅助因子粘端连接低浓度平端连接高浓度2.3聚合酶（polymerase)聚合酶：以DNA或RNA为模板，催化DNA及RNA的体外合成。*大肠杆菌DNA聚合酶I

用于缺刻平移（nicktranslation)*Klenow聚合酶用于平末端补齐；cDNA的第二链；Sanger法测序分析＊T4噬菌体DNA多聚酶

用于DNA片段末端标记＊经修饰的T７噬菌体DNA聚合酶

用于双脱氧终止法测序

*TaqDNA聚合酶

用于DNA序列分析聚合酶链反应（PCR)*逆转录酶（reversetranscriptase)

原核、真核生物mRNA转录成cDNA三、基因工程的载体基因工程载体类型：

*质粒载体*噬菌体载体*嵌合质粒载体*噬菌体质粒载体3.1质粒载体3.1.1质粒：指染色体之外的，能进行复制和遗传的双链环状DNA分子。＊表示符号：pBR322,pUC19,pSC101＊严谨型，低拷贝，１－２个质粒＊松弛型，高拷贝，１０－１００个质粒3.1.2质粒的复制质粒半保留复制模式严谨型质粒复制：依赖蛋白质合成与DNA聚合酶III松弛型质粒复制：不依赖蛋白质合成，利用DNA聚合酶I＊复制方向：单向或／和双向3.1.3质粒的不相容性＊不相容性：指某种质粒在寄主细胞存在时，将阻止其它类质粒进入细胞寄居。＊同一不相容群的质粒不能在同一寄主中寄居。（如质粒pBR322与pUC19都具有PMB1复制子）＊非同一不相容群的质粒，可以在同一寄主中寄居。（如质粒pBR322与pSC101分别具有PMB1和PSC101复制子）3.1.4质粒的转移性1、接合转移(conjugation)2、转化(transformation)*感受态转化(competentcellT.)*原生质体转化(protoplastT.)*电击转化(electroporationT.)3.1.5质粒中的选择标记1、氨苄青霉素抗性（Ampr)2、四环素抗性（Tetr)3、氯霉素抗性（Cmr)3.1.6理想质粒载体的特征１、复制启始区２、合适的酶切位点３、筛选标记４、分子量较小5、核糖体结合位点3.2噬菌体载体四、细菌功能基因的结构4.1启动子4.2编码区4.3终止子4.1启动子启动子(promoter)：指与DNA依赖的RNA聚合酶相结合的一段DNA序列，约20～300个碱基长度。功能：是转录出目的基因mRNA。结构：具有保守区，如Pribnow序列，

-35序列（Sextama）和CAP-cAMP（分解代谢物激活蛋白）结合位点强启动子和弱启动子组成型和调控型转录终止子：类型：1）在Rho因子的作用下使mRNA的转录终止。2）根据DNA模板中的对称序列形成的“发卡”结构，使新生的mRNA终止转录。质粒载体上的启动子上、下游终止子的生物功用。4.2终止子(Terminator)4.3核糖体结合位点（RibosomalBindingSite）核糖体结合位点：指紧靠启动子下游，从转录起始点延伸几十个碱基长度的一段序列，翻译起始密码ATG位于中心，与rRNA16S亚基3’端互补的核心部分称为SD序列（Shine-DalgarnoSequence）SD序列：富含嘌呤，位于翻译起始密码ATG的上游约5～13个碱基。典型序列UAAGGAGG和AAGGA4.3信号肽的结构大肠杆菌表达系统中常用的信号肽序列：（1）大肠杆菌phoA，ompA，ompT，ompF，lamB的信号肽（2）欧文氏菌的pelB信号肽（3）粪肥单胞菌Cex信号肽（4）金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽（5）枯草芽孢内葡聚糖酶信号肽（6）人生长激素信号肽4.4细胞外分泌（1）利用大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达。如：溶血素基因（2）与能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达，使目的蛋白渗透到细胞外。如：大肠杆菌ompA的前导肽细菌素释放因子（3）培养基中加入甘氨酸，以提高外膜通透性。4.5芽孢杆菌中基因表达的特点1、形成芽孢：可根据芽孢形成的不同时期表达不同的蛋白2、多Sigma因子：RNA聚合酶的功能需要因子，而芽孢杆菌存在众多的因子，如A(43，55），B(37)，D

，E

，H

，gp38

和gp33～34

芽孢杆菌中存在双启动子基因或操纵子，有的是重叠的，有的是非重叠的。五、基因转录转录周期起始延伸终止六、基因的翻译原核生物

翻译总过程（上）多核糖体（下）七、原核基因表达系统1、大肠杆菌表达系统2、芽孢杆菌表达系统3、乳酸菌基因表达系统4、链霉菌基因表达系统7.1大肠杆菌表达系统（GeneExpressionsysteminE.coli）7.1.1大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌。其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。7.1.2

大肠杆菌表达系统的特点：（1）遗传背景清楚（2）目的基因表达水平高（3）培养周期短（20分钟）（4）抗感染能力强7.1.3

大肠杆菌表达系统研究的发展趋势完善现有的表达系统；重组蛋白质的正确折叠；构象形成；蛋白质的分泌；菌体表面表达技术及其应用；重组蛋白质修饰加工。7.2芽胞杆菌表达系统（GeneExpressionsysteminBacillus）7.2.1特点枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，严格生长在有氧条件下。枯草芽孢杆菌遗传学相当先进，很多噬菌体和质粒适合用作克隆载体。芽孢杆菌可大量产生几种商品酶，如

-淀粉酶，蛋白酶及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等，发酵技术发达。具有单层细胞膜组成较简单的细胞外壳。易于分离纯化分泌蛋白7.2.2枯草杆菌宿主菌株

由于大肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆菌无效（1）选择可转化的菌株*168菌株及突变体：营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插入（2）选择转化的方法感受态转化：原生质体转化：电转化：甘氨酸添加培养感受态其它方法，如转导、结合转移7.2.3可作为宿主的其它菌种：嗜碱芽孢杆菌Bacillusabcalophilus

蛋白酶淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefacilus

-淀粉酶短芽孢杆菌Bacillusbrevis蛋白酶地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis

淀粉酶，抗真菌肽巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium

淀粉酶短小芽孢杆菌Bacilluspumilus

蛋白酶球形芽孢杆菌Bacillussphaericus

灭蚊毒素蛋白嗜热芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus

高温

-淀粉酶苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis

杀虫晶体蛋白耐碱的芽孢杆菌Bacillusalcalophilic

碱性蛋白酶炭疽芽孢杆菌Bacillusanthracis

7.3乳酸菌基因表达系统（GeneExpressionsysteminLacticAcidBacteria）

7.3.1特点：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运动。菌体常排列成链。在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵，而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO２等物质的称为异型乳酸发酵。有微好氧菌和专性厌氧菌。7.3.2LacticAcidBacteriaGenera:StreptococcusLeuconostocPediococcusLactobacillusEnterococcusLactococcusAlltheabovegeneragrowinchains.Manyareusedforthefoodindustry.7.2.4枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势（1）表达真核基因蛋白酶水解——缺陷型、抑制剂（2）表达商业用酶克隆基因的整合（3）表达杀虫晶体蛋白提高杀虫毒力，减少杀虫时间，增加广谱（4）利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加强在医药领域多个方面的应用

7.3.3研究进展（1）食品发酵方面的应用（2）乳酸菌菌种鉴定REA（RestrictionEndonucleaseAnalysis）16SrRNA（PCR）SDS（3）抗微生物和食品腐败（4）细胞表面层和外多糖利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管电泳鉴定技术。（5）蛋白质降解、多肽降解和脂降解（6）分子遗传学基因克隆表达调控染色体分析

InsulinGeneinsertedintoPlasmid

RecombinantDNAAbsorbedbyBacteria

BacteriaProducesInsulin

InsulinReadytobeAdministeredtoDiabeticPatients

（7）益生菌（PROBIOTICS）LactobacillusandBifidobacterium食品级载体不但是GRAS微生物，而且不依靠抗生素抗性作为选择标记，因而更为安全，在食品、医药方面具有广泛的应用潜力。乳酸菌的食品级高效诱导分泌表达NICE系统是可控制的蛋白质生产的最理想的系统。7.4链霉菌基因表达系统（GeneExpressionsysteminStreptomyces

）

7.4.1特点大多数来自于土壤能形成孢子的革兰氏阳性菌有复杂的形态（以无中隔分枝菌丝方式生长）和生理生命周期产生多种次级代谢产物基因组是大肠杆菌的两倍，

GC含量高，平均为74%7.4.2链霉菌的载体（1）高拷贝载体

pIJ10140-800拷贝硫链丝菌素（tsr），新霉素（neo），酪氨酸酶（mel）（2）低拷贝载体

pIJ9201-2拷贝广泛宿主能插入大于30kb的片段（3）穿梭载体pHJL210（SCP2*/pBR322）（4）柯斯载体（cosmid）构建基因文库（5）接合转移载体

pBR322/pIJ101/RK2（IncP）（转移功能）（6）噬菌体载体

C31衍生的，如KC304，KC505（7）表达载体利用PtipA启动子构建的表达载体

pIJ6021（8）分泌载体利用S.longisporus分泌的枯草杆菌素抑制剂subtilisin（SSI）分泌和抑制丝氨酸蛋白酶特性构建如pIJ702（9）其他载体（A）大容量载体细菌人工染色体BAC

利用F因子复制起始点/par元件，1-2拷贝，克隆100-300kb的片段（B）整合型载体利用pSAM2整合元件构建的pPM927（C）高表达载体整合高表达载体pCJR24，是利用天蓝色链霉菌A3中的激活调节基因actII-ORF4与actI基因启动子构建的7.4.3链霉菌基因转移的方法（1）原生质体转化转化率不高,制备过程中影响因素多,系统对外源DNA的限制