用MDCK细胞生产灭活流感病毒疫苗

对于瘤性和成瘤性细胞作为细胞基质的担忧1，瘤性和成瘤性细胞可以形成肿瘤，有可能转化受体人群形成肿瘤。解决方法：通过去除完整细胞来解决。2，外源因子，可以诱导瘤性和成瘤性表型的外源因子可能存在于细胞中，瘤性和成瘤性细胞有更好的支持病毒生长的能力，所以可能存在外源物质。解决方法：（1）通过限制瘤性和成瘤性细胞的使用，（2）.扩大对致瘤性物质和其他相关物质的检测。3，在瘤性和成瘤性细胞中存在的DNA可能是致瘤性或有感染性的物质。解决方法：（1）.在动物体内对细胞基质DNA的致瘤性进行检测，（2）.降低细胞残留DNA的含量，（3）.降低功能性（分子大小和其他性质）残留DNA的含量。4，病毒宿主和病毒细胞的相互作用，疫苗病毒包装的细胞DNA或者细胞成分是致瘤的。解决方法：（1）.证明最终的疫苗制品中不包含具有转化性质的DNA，（2）.这对于细胞质中的RNA病毒（如流感病毒）不是问题，（3）.通过灭活病毒方法制造疫苗。5，用瘤性或者成瘤性细胞生产疫苗可能存在永生化和成瘤性相关的其他机制（致瘤性蛋白、RNA或其他可以诱导后天遗传改变的因子）对受体人群造成风险。解决方法：（1）.科学界的共识是这种其他机制存在的可能性不大，（2）.使用弱成瘤性的细胞作为基质。6，以前使用的成瘤性实验还不能充分确定成瘤性表型和使用成瘤性细胞的相关风险。

用MDCK细胞生产灭活流感病毒疫苗-VRBPACmeeting2005-11-6流感的疾病影响：流感病毒每年冬季流行，约10-20％的世界人口被感染，在美国，2500万到5000万人被感染，导致2万人死亡和11万人住院，造成约120亿美元的健康负担。世界范围的流感大流行有三次，1918-1919年西班牙流感流行导致2000万-4000万人死亡，1957年亚洲和1968年香港的流感流行导致150万人死亡。流感疫苗需求：在美国常规免疫需要1.8亿人口的流感疫苗而且还在增加，目前鸡胚生产流感疫苗不能满足需求，也不能对变化的疫苗需求进行灵活应对。流感大流行时期世界需要快速生产65亿流感疫苗，美国需要3亿流感疫苗。鸡胚生产疫苗的缺点：（1）.鸡胚生产疫苗需要6个月以上的时间，每剂疫苗需要一个鸡蛋，（2）.鸡胚生产疫苗限制了灵活性和可靠性，（3）.鸡胚可能被禽流感杀死，（4）.鸡胚限制了应对流感流行需求的灵活性。细胞培养途径生产流感病毒的优点：（1）.可以快速生产流感疫苗满足短缺和大流行时期的需求，（2）.防止鸡胚生产相关的安全风险，（3）.为对鸡胚过敏人群提供选择。连续传代细胞系可以解决鸡胚生产程序的限制，包括（1）.可以使用随时可以获得的原材料，（2）.允许大规模、灵活生产疫苗，（3）.无动物源成分生产疫苗，（4）.已经用于30个美国治疗产品和灭活脊灰生产。MDCK连续传代细胞生产流感疫苗原理：MDCK细胞内在特点包括（1）.广泛和高度许可多种流感毒株的感染，（2）.限制存在于细胞种子的非流感病毒的生长。选择性特点包括（1）.可以悬浮培养，允许大规模、高产量、大体积生产疫苗，（2）.可以适应在非动物源性培养基中生长。连续传代细胞相对于原代细胞和二倍体细胞的好处：（1）.减少外源因子风险，（2）.增加细胞特性。连续传代细胞潜在的担忧：致瘤性和成瘤性。这种担忧主要来自三个方面：（1）.细胞本身，（2）.残留DNA，（3）.外源物质。连续传代细胞系的风险管理：根据规定的安全使用细胞的潜在风险评价检测规范进行MDCK细胞的安全评价，指导原则包括：1.CBER关于成瘤性和非成瘤性细胞系风险评价规范，2.ICH指导原则，3.CHMP指导原则。chiron已经根据相关规范与相关管理部门磋商进行了MDCK细胞的风险评价检测。chiron证明MDCK细胞可以作为细胞基质的检测内容包括：（1）细胞，证明移除了完整细胞，证明细胞没有转化致瘤的能力；（2）DNA，证明没有致瘤性，证明可接受的DNA被移除或者灭活；（3）外源物质，证明没有内在的感染性和致瘤性物质，证明移除或灭活潜在的物质。成瘤性研究实验显示10个MDCK细胞就可以导致裸鼠形成肿瘤，所以移除完整细胞对于用MDCK细胞生产疫苗是非常重要的。表1：成瘤性实验数据组别动物数量形成肿瘤动物数量101MDCK细胞243103MDCK细胞253105MDCK细胞2410107MDCK细胞2411去除完整细胞的程序包括：大部分细胞已经在流感病毒生长时裂解，通过离心、过滤和化学灭活或化学裂解等多种方法进行细胞去除，层析纯化过程也可以移除细胞。通过多种程序移除细胞，数据列出了每种程序的细胞移除效果，计算出累计细胞移除为10-41，在1剂疫苗中含有1个细胞的概率为10-34，这意味着疫苗中含有MDCK细胞的概率几乎为0。

表2.病毒生产操作和细胞移除率通过与CBER沟通设计在龋齿类动物的成瘤性和致瘤性研究，高达107的MDCK完整细胞不会导致成年裸鼠形成鼠肿瘤，说明MDCK细胞没有致瘤性，从5*106-107的MDCK细胞在裸鼠、仓鼠、小鼠中没有致瘤性。大于2800倍疫苗剂量的纯化细胞DNA在裸鼠、仓鼠、小鼠中没有致瘤性。WHO推荐的连续传代细胞的DNA含量是＜10ng/剂，β-丙内酯处理后DNA会降解为小于200bp的片段，而具有致瘤性的DNA主要是大于1000bp的基因片段。通过PCR的方法检测未发现犬的致瘤性基因。表2：成瘤性和致瘤性研究的动物实验结果检测材料（动物）成瘤性致瘤性完整细胞（裸鼠）是（犬瘤）否N=104裂解细胞（裸鼠、仓鼠、小鼠）N/A否N=139细胞DNA（裸鼠、仓鼠、小鼠）N/A否N=224对MDCK细胞外源性物质的检测包括外源病毒的检测，对原始细胞库、主细胞库、工作细胞库和最终产品细胞进行外源病毒检测，检测内容包括电子显微镜、指示细胞系的体外感染、体内实验、对反转录病毒的反转录酶检测。对于特异和非特异人类和动物（犬、牛、猪、马、鼠）病毒的检测，所有检测结果均为阴性，对多瘤病毒和疱疹病毒的PCR检测也为阴性，对潜伏病毒检测的操作规程还在研究中。由于在操作过程中（病毒种子、环境等因素）可能引入病毒，因此需要移除潜在的污染病毒，多种步骤需要设计来增加另外的安全性，包括β-丙内酯灭活、裂解、超速离心、吸附等步骤。这些操作对双链DNA病毒、双链RNA病毒和单链RNA病毒的累计病毒移除均超过9.9log10。表3：生产操作对病毒的移除实验生产操作单纯疱疹病毒（双链DNA病毒）呼肠弧病毒（单链RNA病毒）鼠反转录病毒（单链RNA病毒）β-丙内酯灭活4.5log102.3log10≥4.5log10裂解、超速离心、吸附≥5.5log10≥7.6log10≥7.6log10结合操作病毒移除≥10log10≥9.9log10≥12.1log10总结：MDCK细胞系：（1）.完整MDCK细胞具有成瘤性，（2）.完整细胞、细胞裂解物和细胞DNA不具有致瘤性，（3