生物工程07-酶与酶工程课件

酶和酶工程enzyme酶和人类的关系国际市场酶制剂销售额比例

2001年工业酶制剂的世界市场约为15亿美元用于制药工业与精细化学工业约1.2亿~1.5亿美元世界三大酶制剂公司NovoNordisk（丹麦）GenencorInternational(美国）Cuitor(芬兰）三大公司销售额占世界总额的70%国内酶制剂销售额比例1965无锡酶制剂厂淀粉酶1979糖化酶碱性蛋白酶

中性蛋白酶1993耐高温淀粉酶1998国外大公司纷入1999年投产酶的研究历史1878年,Kuhne提出Enzyme1926年,美国生化学家Sumner第一次从刀豆分离到脲酶结晶,提出酶是蛋白质.1970美国Smith发现限制性内切酶（1979年诺贝尔奖）1969日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。——酶工程诞生1986美国核酶发现获得诺贝尔奖酶工程简介酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展形成的一门新技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。主要包括化学酶工程和生物酶工程。酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。酶的催化高效性通常要高出非生物催化剂催化活性的106~1013倍。2H2O22H2O+O21mol过氧化氢酶5×106molH2O21mol离子铁6×10-4molH2O2酶的定义（一）、什么是酶？酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子。绝大多数的酶都是蛋白质。酶反应与非酶反应活化能的比较

酶促反应非酶促反应反应进程自由能底物ESES*EP产物酶的专一性Specificity又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性

酶的专一性包括

(1)结构专一性绝对专一性相对专一性

(2)立体异构专一性光学异构专一性几何异构专一性酶的结构及催化作用机制

1．结合部位Bindingsite酶分子中与底物结合的部位或区域一、酶分子的结构特点酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。通常将酶催化部位称为酶的活性部位或活性中心。2．催化部位catalyticsite主要包括：亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酶活性中心的必需基团酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基赖氨酸的氨基酪氨酸的酚羟基组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。胰凝乳蛋白酶结构

酶分子中可与其他分子结合，引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。3．调控部位Regulatorysite酶的活性中心酶的活性中心

结合基团活性中心内必需基团催化基团活性中心外必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。

酶分子可根据其化学组成的不同，分为两类：

辅酶与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。

单体酶肽链寡聚酶多酶复合体多酶体系多功能酶酶的分类多功能酶（multifunctionalenzyme）：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，形成由一条多肽链组成却具有多种不同催化功能的酶。酶作用专一性的机制

与酶的高效率催化有关的因素诱导契合学说锁－钥学说E+S====E-S

P+E中间产物学说反应过程中能量的变化反应总能量改变非催化反应活化能酶促反应活化能一般催化剂催化反应的活化能能量反应过程底物产物（自由能）3、多功能催化作用酶的活性中心部位，一般含有多个催化基团，他们对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起协同作用影响酶催化反应速度的因素底物浓度——米氏方程酶浓度温度pH值抑制剂激活剂抑制剂对酶反应速度的影响（1）不可逆抑制抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。举例有机磷化合物

羟基酶解毒------解磷定(PAM)重金属离子及砷化合物

巯基酶解毒------二巯基丙醇(BAL)

有机磷化合物对羟基酶的抑制路易士气失活的酶巯基酶失活的酶酸BAL巯基酶BAL与砷剂结合物（2）、

可逆抑制A、竟争性抑制定义抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。竞争性抑制1.磺胺药对细菌FH2合成酶的抑制3.抗代谢物的抗癌作用(2)非竟争性抑制抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系。非竞争性抑制(3)、反竞争性抑制作用酶与底物结合后抑制剂才能和酶结合反竞争性抑制（1）天然酶的自杀底物

Ackee(Blighia

sapida)植物——未成熟果实的假种皮中含有一种有毒的降糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨酸）（2）治疗用人工合成的酶自杀底物治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀底物疗法。酶抑制剂的应用激活剂对酶反应催化速度的影响（一）、凡能够提高酶活性，加速酶促化学反应的物质都称酶的激活剂（activator)。（二）、激活剂的类型1、无机离子2、有机小分子3、生物大分子酶工程的主要内容化学酶工程：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和减低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶。生物酶工程：用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从而生产性能稳定，具有新的生物活性及催化效率更高的酶。化学酶工程化学修饰酶固定化酶人工模拟酶抗体酶酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。酶分子的修饰方法

(1)酶的金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)(2)酶的大分子修饰

使用聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。非共价修饰共价修饰用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍

(3)酶分子的侧链基团修饰采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基(4)酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法a、胃蛋白酶原的激活

b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活

Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。(5)氨基酸置换修饰酶分子的定点突变1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达6、变异特性分析化学酶工程化学修饰酶固定化酶人工模拟酶抗体酶

酶和细胞固定化固定化酶的定义：

固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使之与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。

酶固定化方法

固定化酶的作用模型及其反应机理以羧甲基纤维素固定葡萄糖淀粉酶水解淀粉生产葡萄糖为例说明。载体的作用：▼保持酶的立体结构▼保护酶的活性中心▼保证酶的连续催化反应酶固定化后的性质变化酶固定化后，原有的某些性状会产生一定变化。1对底物的特异性。注意立体结构（分配效应，空间障碍效应，扩散限制效应）对底物特异性的影响2酶反应最适PH值的改变。酶固定化后，酶蛋白质的电子状态会发生改变，载体表面的电位要受影响。3动力学常数的改变。米氏常数和最大反应速度会改变4酶反应温度的改变5增加酶的稳定性。物理吸附法固定化酶举例载体固定化酶活性炭α－淀粉酶、β－淀粉酶蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶多孔玻璃核糖核酸酶、木瓜蛋白酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶氧化铝葡萄糖氧化酶碳酸钙凝胶亮氨酸氨肽酶纤维素胰蛋白酶、核糖核酸酶麸素Β－淀粉液化酶硅胶磷酸化酶格子型固定化酶及应用凝胶或膜酶聚丙烯酰胺凝胶α、β－淀粉酶葡萄糖氧化酶乳酸脱氢酶淀粉胆碱酯酶琼脂青霉素酰胺酶制备的固定化酶微胶囊固定化酶及其应用微胶囊法固定化酶胶囊制法囊膜的素材应用的酶表面聚合法尼龙乳糖酶羧基脱氢酶聚合脲天门冬酰胺酶液中干燥法聚苯乙烯过氧化氢酶脂肪酶脲酶相分离法火棉胶过氧化氢酶天门冬酰胺酶硝酸纤维素天门冬酰胺酶固定化酶的应用1．固定化酶在工农业生产上的应用乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala氨基酰化酶泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala2．固定化酶在医药治疗上的应用固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物。青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素7-ACAasnucleus青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素7-ACCAor7-ADCAasnucleus酶促合成头孢类抗生素++Esterase

HydrolaseSynthetase3．固定化酶在分析化学中应用酶电极半透膜葡萄糖电极

酶胶层 感应电极

酶电极示意图ß－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氢醌葡萄糖氧化酶氢醌 醌＋2H＋＋2e－Pt铂电极化学酶工程化学修饰酶固定化酶人工模拟酶抗体酶传统的模拟酶是设计合成具有类似酶催化残基官能团的大分子受体，主要包括:1.环糊精酶模型,2.环番酶模型,3.分子印迹酶。β-CD的分子式和结构表达式环糊精仿酶体系CD分子原来：在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结合和催化功能环糊精及其衍生物可以用来模拟转氨酶，氧化还原酶，水解酶，超氧化物歧化酶（SOD）等。环糊精模拟的水解酶印迹酶分子印迹酶1．分子印迹概念：制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程分子印迹酶：通过分子印迹技术产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。蛋白质表面印迹在聚合物涂层的硅石上的示意生物印迹1．生物印迹：指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。2．有机相生物印迹酶非水相生物印迹酶制备示意图化学酶工程化学修饰酶固定化酶人工模拟酶抗体酶抗体酶(abzyme)1、抗体酶研制的原理和途径以酶的过渡态类似物为半抗原，免疫动物产生了具有催化作用的抗体。

1986年Schultz和Lerner以对硝基笨酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。通过的单克隆抗体的筛选，成功的获得了一株MOPC167单抗，可使水解反应提高1.2×104倍抗体酶的催化反应酰基转移反应

磷酸酯水解反应

重排反应氧化还原反应

金属螯和合反应

磷酸酯闭环反应

光诱导反应

a.光聚合反应（二聚作用）

b.光裂解反应生物酶工程克隆酶（从头设计酶）突变酶进化酶杂合酶核酶和脱氧核酶酶的定向进化酶分子的合理设计(rationaldesign)酶分子的定向进化(directedevolution)

1993年,美国科学家ArnoldFH首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。酶的合理设计体外定向进化所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。定向进化的原理定向进化示意图随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素50

0C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！定向进化技术Strategiesforthedevelopmentofeffectiveenzymes随机突变的策略易错PCR技术DNA改组：由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术随机引发重组:1998年,Arnold提出了一种有效的新方法交错延伸技术：由Zhao等提出,是一种简化的DNAshuffling技术DNA改组和外显子改组DNA改组（DNAshuffling）又称有性PCR(sexualPCR)原理。目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。外显子改组（exonshuffling）类似于DNA改组.外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动。DNA改组原理DNAshuffling体外定向进化目标酶所需功能方法结果实施菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择在60-50℃酶半衰期增加200倍耐热脂肪芽孢杆菌β-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性增加32000倍大肠杆菌对硝基苯酯酶有机溶剂中的底物特异性和活性易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性基因理疗交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌β-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特异性增加1000倍大肠杆菌定向进化的应用生物酶工程克隆酶（从头设计酶）突变酶进化酶杂合酶核酶和脱氧核酶杂合酶

杂合酶不同于定向进化酶,它是通过结构域或亚结构域的重组来实现的，例如底物结构域、调节结构域、催化结构域。通过这些相互独立的结构域之间的重组，获得比亲本功能具有更高效率的或者衍生出新功能的子代重组体.生物酶工程克隆酶（从头设计酶）突变酶进化酶杂合酶核酶和脱氧核酶能催化分子内反应(自我剪接型和自我剪切型)或分子间反应ribozyme80年代初期，美国科罗拉多大学ThomasCech和耶鲁大学Sidnery

Altan各自独立发现RNA具有生物催化功能.为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989年诺贝尔化学奖1．自我剪接ribozyme自我剪接ribozyme可分为两类：Ⅰ型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。Ⅱ型IVS：它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+2．自我剪切ribozyme自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。包含剪切与连接两个步骤。3．催化分子间反应的ribozyme如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分子间反应。脱氧核酶

具有酶活性的DNA分子称为脱氧核酶

Carmi等通过体外选择技术合成了一种依赖Ca2+的具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子

酶工程的应用酶在医药方面的应用用酶进行疾病的诊断用酶进行疾病的治疗用酶制造各种药物PKU苯丙酮尿症脑发育受阻，严重脑力呆滞，智商0－50苯丙氨酸代谢途径关系到三种遗传病体检表中有关酶的选项1、通过酶活力变化进行疾病诊断酶疾病与酶活力变化淀粉酶胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降胆碱酯酶肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降酸性磷酸酶前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高碱性磷酸酶佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活力下降醛縮酶急性传染性肝炎、心肌梗塞，血清中酶活力显著升高胃蛋白酶胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降端粒酶癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性山梨醇脱氢酶（SDH）急性肝炎，活力显著提高肌酸磷酸激酶（CK）心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高α－羟基丁酸脱氢酶心肌梗塞、心肌炎，活力增高2、用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断酶测定的物质用途葡萄糖氧化酶葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断糖尿病葡萄糖氧化酶+过氧化物酶葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断糖尿病尿素酶尿素测定血液、尿液中尿素的量诊断肝脏、肾脏病变谷氨酰胺酶谷氨酰胺测定脑脊液中谷氨酰胺的量，诊断肝昏迷、肝硬化胆固醇氧化酶胆固醇测定胆固醇含量，诊断高血脂等DNA聚合酶基因通过基因扩增，基因测序，诊断基因变异、检测癌基因3、酶在疾病治疗方面的应用酶名来源用途蛋白酶胰脏、胃、植物、微生物治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组织，促进创伤愈合，降低血压溶菌酶蛋清、细菌治疗各种细菌性和病毒性疾病链激酶链球菌治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折青霉素酶蜡状芽孢杆菌治疗青霉素引起的变态反应L-天冬酰胺酶大肠杆菌治疗白血病超氧化物歧化酶微生物，植物，动物预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎胶原酶细菌分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡胆碱酯酶细菌治疗皮肤病，支气管炎，气喘弹性蛋白酶胰脏治疗动脉硬化，降血脂核糖核酸酶胰脏抗感染，祛痰，治肝癌溶菌酶栓溶酶类与心血管疾病凝血酶健美生消化酶—帮助肠胃蠕动【产品规格】90片／瓶【食用方法】成人每日3片，随主餐服用【成分(每片含)】1)消化蛋白质：木瓜蛋白酶50毫克、菠萝蛋白酶30毫克；2)消化脂肪：脂肪酶30毫克；3)消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶50毫克；4)消化乳制品：乳糖酶30毫克；5)消化纤维：纤维素酶15毫克。另含：能抑制过多胃酸的葡萄糖酸钙，能缓解反胃薄荷叶和茴香【适用人群】·消化不良者·肠胃疾病患者·大病初愈者消化酶类SOD

美国医学家W·F·安德森等人对腺苷脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。

1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的经过基因修复的白血球溶液输入她左臂的一条静脉血管中。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。谢德尔，19994、酶在药物制造方面的应用

酶主要来源用途青霉素酰化酶微生物制造半合成青霉素和头孢菌素11-β-羟化酶霉菌制造氢化可的松L-酪氨酸转氨酶细菌制造多巴（L-二羟苯丙氨酸）β-酪氨酸酶植物制造多巴α-甘露糖苷酶链霉菌制造高效链霉素核苷磷酸化酶微生物生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷（阿糖腺苷）酰基氨基酸水解酶微