《农产品质量安全与检测》课件-项目5：食品添加剂与违法添加物检测

防腐剂测定-苯甲酸、山梨酸测定农产品质量安全与检测学习目标01了解苯甲酸和山梨酸液相色谱法的检测原理02掌握苯甲酸和山梨酸液相色谱法的检测方法03了解苯甲酸和山梨酸气相色谱法的检测原理04掌握苯甲酸和山梨酸气相色谱法的检测方法液相色谱法PART

01液相色谱法原理样品经水提取，高脂肪样品经正已烷脱脂、高蛋白样品经蛋白沉淀剂沉采用液相色谱分离、紫外检测器检测，用外标法定量。液相色谱法试剂参考GB5009.28-2016，除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水，标准物质需经国家认证并授予标准物质证书。注意：苯甲酸和山梨酸的标准储备液在4℃下保存期为6个月；混合标准中间液在4℃下保存期为3个月；混合标准工作液则临用现配。液相色谱法方法液体样品取多个预包装的样品直接混合；非均匀的液态、半固态样品用组织匀浆机匀浆；固体样品用研磨机充分粉碎并搅拌均匀。取其中的200g装入玻璃容器中，密封，液体试样于4℃条件下保存，其他试样于-18℃条件下保存。01试样制备准确称取约2g（精确至0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加水约25ml、涡旋混匀，50℃水浴超声20min，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液2mL和乙酸锌溶液2mL，混匀，8000r/min离心5min，将水相转移至50ml容量瓶中，于残渣中加水20ml，涡旋混匀后超声5min，8000r/min离心5min，将水相转移到同一个50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过0.22pm滤膜，待液相色谱测定。02试样提取液相色谱法当存在干扰峰或需要辅助定性时，可以采用加入甲酸的流动相来测定，如流动相V甲醇+V甲酸-乙酸铵=8+92仪器分离检测参考条件色谱柱：C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5mm，或等效色谱柱。流动相：甲醇+乙酸铵溶液（5十95）。流速：1mL/min。检测波长230nm。进样量：10μL。液相色谱法将混合标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线制作将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸、山梨酸的质量浓度。试样溶液的测定液相色谱法5.计算X=(ρ×V)/(m×1000）

式中：X—试样中苯甲酸、山梨酸的含量，g/kg；ρ—由标准曲线得出的试样液中待测物质的质量浓度，mg/L；V-试样定容体积，mL；m—试样质量，g；1000-单位换算系数。结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%；取样量为2g，定容至50mL时，苯甲酸、山梨酸的检出限均为0.005g/kg，定量限均为0.01g/kg。气相色谱法PART

02气相色谱法原理将试样经盐酸酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸，采用气相色谱-氢火焰离子化检测器进行分离测定，用外标法定量。气相色谱法仪器气相色谱仪：带氢火焰离子化检测器（FID）分析天平：感量为0.001g和0.0001g涡旋振荡器离心机：转速>8000r/min匀浆机氮吹仪气相色谱法试剂参考标准GB5009.28-2016，所用标准物质与水的标准同液相色谱法。同液相色谱法1、试样制备气相色谱法方法准确称取约2.5g（精确至0.001g）试样于50mL离心管中，加0.5g氯化钠、0.5mL（1：1）的盐酸溶液和0.5mL乙醇，用15ml和10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，8000r/min离心3min。每次均将上层乙醚提取液通过无水硫酸钠滤入25ml容量瓶中。加乙醚清洗无水硫酸钠层并收集至约25ml，最后用乙醚定容，混匀。准确吸取5ml乙醚提取液于5mL具塞刻度试管中，35℃氮吹至干，加入2ml正已烷-乙酸乙酯（1：1)混合液溶解残渣，待气相色谱测定。2、试样提取气相色谱法仪器分离检测参考条件色谱柱：聚乙二醇毛细管气相色谱柱，内径为320um，长30m，膜厚度为0.25μm，或等效色谱柱。氮气，流速为3mL/min载气400L/min空气40L/min氢气250℃进样口温度250℃检测器温度初始温度80℃，保持2min，以15℃/min的速率升温至250℃，保持5min升温程序2μL进样量10：1分流比气相色谱法标准曲线制作将混合标准系列工作溶液分别注入气相色谱仪中，以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。试样溶液的测定将试样溶液注人气相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸、山梨酸的质量浓度。X=(ρ×V×25)/(m×5×1000）注意：结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%；取样量为2.5g，定容至2mL时，苯甲酸、山梨酸的检出限均为0.005g/kg，定量限均为0.01g/kg。

式中：X—试样中苯甲酸、山梨酸的含量，g/kg；ρ—由标准曲线得出的试样液中待测物的质量浓度，mg/L；V-加入2ml正已烷-乙酸乙酯（1：1）混合液的体积，mL；25—试样乙醚提取液的总体积，mL；m—试样质量，g；5—测定时吸取乙醚提取液的体积，mL；1000-单位换算系数。气相色谱法5.计算护色剂测定-亚硝酸盐测定农产品质量安全与检测学习目标01了解亚硝酸盐的离子色谱法检测原理02掌握亚硝酸盐的离子色谱法检测方法03了解亚硝酸盐分光光度法的检测原理04掌握亚硝酸盐分光光度法的检测方法离子色谱法PART

01离子色谱法原理试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，用阴离子交换柱分离，用电导检测器或紫外检测器检测。以保留时间定性用外标法定量。离子色谱法仪器01离子色谱仪：配电导检测器及抑制器或紫外检测器，高容量阴离子交换柱，50μL定量环。02食物粉碎机03超声波清洗器04

分析天平：感量为0.1mg和1mg05离心机：转速>10000r/min，配50mL离心管060.22μm水性滤膜针头滤器07净化柱：包括C18柱、Ag柱和Na柱或等效柱08注射器：1.0mL和2.5mL离子色谱法试剂参考GB5009.33-2016，除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水，标准物质需经国家认证并授予标准物质证书。离子色谱法检测方法试样预处理：将不同性状的农产品通过均质、粉碎、搅拌、研磨等方法制备成均匀且具有代表性的样品。提取：称取样品，通过超声提取、离心分离、过滤等步骤将样品中的亚硝酸盐提取成澄清待测液。经0.22μm滤膜过滤和C18固相萃取柱的富集，提高待测组分的浓度。注意：

C18固相萃取柱在使用前需用甲醇或水进行活化，活化时间约30min。离子色谱法仪器分离检测参考条件：

色谱柱。氢氧化物选择性，可兼容梯度洗脱的二乙烯基苯-乙基苯乙烯共聚物基质烧醇基季铵盐功能团的高容量阴离子交换柱，4mmX250mm（带保护柱4mmX50mm），或性能相当的离子色谱柱。淋洗液。氢氧化钾溶液，浓度为6~70mmol/L；洗脱梯度为6mmol/L30min，70mmol/L5min，6mmol/L5min：流速为1.0mL/min。抑制器。检测器：电导检测器，检测池温度为35℃；或紫外检测器，检测波长为226nm。进样体积：50μL（可根据试样中被测离子的含量进行调整）。离子色谱法测定将标准系列工作液分别注入离子色谱仪中，得到各浓度标准工作液色谱图，测定相应的峰高或峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰高或面积为纵坐标，绘制标准曲线。将空白和试样溶液注人离子色谱仪中，得到空白和试样溶液的峰或峰面积，根据标准曲线得到待测液中亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度。利用离子色谱法亚硝酸盐的检出限为0.2mg/kg。分光光度法PART

02分光光度法原理亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。仪器天平（感量为0.1mg和1mg），组织捣碎机，超声波清洗器，恒温干燥箱，分光光度计。分光光度法试剂参考GB5009.33-2016，除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水，标准物质需经国家认证并授予标准物质证书。注意：亚硝酸钠标准使用液需在临用前配制。分光光度法方法试样预处理：将不同性状的农产品通过均质、粉碎、搅拌、研磨等方法制备成均匀且具有代表性的样品；提取：称取样品，通过超声提取、离心分离、过滤等步骤将样品中的亚硝酸盐提取成澄清液。分光光度法亚硝酸盐的测定：吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠），分别置于50mL带塞比色管中。向标准管与试样管中分别加2mL对氨基苯磺酸溶液（4g/L），混匀，静置3~5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液（2g/L），加水至刻度，混匀，静置15min，用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白试验。X=(m2×1000）/[m3×(V1/V0)×1000]

式中：X—试样中亚硝酸盐的含量，mg/kg；m2—测定用样液中亚硝酸钠的质量，μg；V1-测定用样液体积，mL；V0-试样处理液总体积，mL；m3—试样质量，g；5—测定时吸取乙醚提取液的体积，mL；1000-单位换算系数。分光光度法5.亚硝酸盐含量计算注意：结果保留两位有效数字。违法添加物测定--原料乳与乳制品中三聚氰胺检测农产品质量安全与检测三聚氰胺别名包括密胺、蛋白精、三胺、蜜胺、氰尿酰胺等。长期摄入可能引起肾结石、膀胱结石，严重时导致肾衰竭。三聚氰胺分子中含有大量氮元素，不法商家利用其提高食品检测中的蛋白质含量，因为食品工业中常通过凯氏定氮法间接测定蛋白质含量。重点学习高效液相色谱法测定三聚氰胺，具有灵敏度高、准确度好的特点。三聚氰胺三聚氰胺检测参照（GB/T22388-2008）第一法高效液相色谱法及全国职业院校技能大赛“食品安全与质量检测”项目操作规程。Contents原理01试剂与材料02仪器和设备03样品处理与测定04原理PART

01原理试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。提取方法试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，将三聚氰胺从样品中分离出来。净化过程经阳离子交换固相萃取柱净化，去除杂质，提高检测的准确性。测定方式用高效液相色谱测定，通过色谱分离进行检测。定量方法采用外标法定量，根据标准曲线确定样品中三聚氰胺的含量。试剂与材料PART

02甲醇01乙腈02氨水03三氯乙酸04柠檬酸05辛烷磺酸钠06试剂与材料1.试剂试剂与材料2.主要材料（1）阳离子交换固相萃取柱混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，填料质量为60

mg，体积为3mL。（2）微孔滤膜0.2μm，有机相（3）一次性注射器（4）样品瓶（5）具塞塑料离心管（6）移液枪枪头试剂与材料3.试剂配制甲醇水溶液：准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用。三氯乙酸溶液（1%）：准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。氨化甲醇溶液（5%）：准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，调节pH至3.0后，定容至1L备用。三聚氰胺标准品：CAS108-78-01，纯度大于99.0%三聚氰胺标准储备液：准确称取100mg（精确到0.1mg）三聚氰胺标准品于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。仪器和设备PART

03高效液相色谱仪0103分析天平04超声波水浴仪器和设备配有紫外检测器或二极管阵列检测器，用于色谱分离和检测。02离心机转速不低于8000r/min，用于样品的离心分离。感量为0.0001g和0.01g，确保称量的准确性。用于样品的超声提取。仪器和设备（5）涡旋混合器（6）固相萃取装置（7）氮吹仪（8）移液枪样品处理与测定PART

04样品处理与测定1.样品处理液态样品提取液态奶等称取2g试样，加三氯乙酸溶液和乙腈提取，离心过滤定容。固态样品提取奶酪等称取2g试样，加海砂研磨，清洗后同液态样品提取操作。净化操作待净化液过固相萃取柱，洗涤后洗脱，吹干定容过滤待测。样品处理与测定2.操作步骤2.1样品称量称取2g（精确至0.01g）乳品试样于50mL具塞塑料离心管中，并及时填写样品称量记录单。2.2样品提取在上述离心管中用移液枪加入标液100μL，准确移入15.00mL三氯乙酸溶液和5.00mL乙腈，涡旋混匀后超声提取5min后以≥7000r/min速度离心5min，移取4.00mL上清液并加入2mL水充分混匀后作为待净化液。样品处理与测定依次用3mL甲醇、5mL水活化固相萃取柱，转移待净化液至固相萃取柱，依次用3mL水和3mL甲醇淋洗，抽至近干后用6.00mL氨化甲醇溶液洗脱，洗脱液于50℃下用氮吹近干。向残留物中准确加入2.00mL流动相，涡旋混匀1min，用0.22μm针式滤膜过滤后，分别移至液相进样瓶中，做好标记，供HPLC色谱测定。2.3样品净化样品处理与测定3.样品上机检测参数条件--液相色谱法测定仪器高效液相色谱仪，配有紫外检测器或二极管阵列检测器。色谱柱色谱柱：C₈柱，250mm×4.6mm[内径]，5μm，或相当者。C18柱，250mm×4.6mm[内径]，5μm，或相当者。流动相C₈柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（85+15，体积比），混匀。C18柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（90+10，体积比），混匀。流速1.0mL/min波长240nm柱温40℃进样量20μL样品处理与测定4.标准曲线绘制三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80μg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品HPLC色谱图参见图A.1样品处理与测定5.高效液相色谱分析由自动进样器或手动进样器分别吸取20μL标准混合液和净化后的样品溶液注入色谱仪中，以保留时间定性，以样品溶液峰面积与标准溶液峰面积比较定量。样品处理与测定6.结果计算式中：X———试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A———样液中三聚氰胺的峰面积；c———标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为