红薯康王5号的茎尖脱毒研究

摘要［目的］研究红薯康王5号的组培脱毒方法及脱毒检测技术。［方法］以红薯康王5号植株为材料，使用不同培养基对红薯康王5号茎尖培养，筛选出最佳诱导分化培养基，培养后获得脱毒红薯康王5号植株。通过指示植物检测法，对组培红薯不定芽叶进行病毒检测。［结果］表面消毒效果最佳的方法是通过用自来水冲洗20分钟，在75%的乙醇中处理30s，用0.1%的升汞浸泡10分钟后，再用无菌水冲洗8次的消毒方式，它能取得较好的灭菌效果并降低污染率；最佳诱导愈伤分化培养基是MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.2mg/L萘乙酸（NAA）+0.5mg/L苄氨基嘌呤（6-BA），愈伤诱导率可达92.3%；最佳诱导不定芽分化的培养基是MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.2mg/L萘乙酸（NAA）+0.5mg/L苄氨基嘌呤（6-BA）+0.25mg/L赤霉素（GA3），不定芽诱导率可达92.3%；最佳诱导不定根分化的培养基是MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.4mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)，不定根诱导率可达84.6%；病毒检测结果表明组培红薯不定芽脱毒率为80%，脱毒效果符合预期。［结论］为红薯康王5号脱毒苗工厂化生产提供理论依据和技术支撑。关键词：红薯；茎尖；脱毒；病毒检测；指示植物检测法Abstract[Objective]TostudythemethodanddetectiontechnologyofIpomoeabatatasLamKangwangNo.5.[Method]UsingtheIpomoeabatatasLamKangwang5plantasthematerial,thebestinduceddifferentiationmediumwasselected,andthevirus-freeIpomoeabatatasLamKangwang5plantwasobtained.TheleavesofIpomoeabatatasLamweredetectedbyindicatorplantdetection.[Results]Thebestmethodforsurfacedisinfectionisbywashingwithtapwaterfor20minutes,Wastreatedin75%ethanolfor30s,After10minutesofimmersionin0.1%litersofmercury,Thenrinsing8timeswithsterilewater,Itcanachieveabettersterilizationeffectandreducethepollutionrate;ThebestinducedcallusdifferentiationmediumwasMSbasicmedium+30g/Lsucrose+6.0g/Lagar+0.2mg/Lnaphthaleneaceticacid(NAA)+0.5mg/Lbenzysinopurine(6-BA),Calliinductionratecanreach92.3%;TheculturemediumforoptimalinductionofbuddingdifferentiationwasMSbasicmedium+30g/Lsucrose+6.0g/Lagar+0.2mg/Lnaphthaleneaceticacid(NAA)+0.5mg/Lbenzysamoprine(6-BA)+0.25mg/Lgibberellin(GA3),Theinductionrateofadventitiousbudcanreach92.3%;ThebestmediumtoinduceadventitiousrootdifferentiationwasMSbasicmedium+30g/Lsucrose+6.0g/Lagar+0.1mg/Lnaphthaleneaceticacid(NAA)+0.4mg/Lbenzysinopurine(6-BA);Thevirustestresultsshowedthatthedetoxificationrateofhistculturesweetpotatowas80%,Thedetoxificationeffectwasinlinewithexpectations.[Conclusion]ProvidetheoreticalbasisandtechnicalsupportforthefactoryproductionofIpomoeabatatasLamKangwangNo.5virus-freeseedlings.Keywords:IpomoeabatatasLam;stemtip;detoxification;virusdetection;indicatorplantdetectionmethod目录TOC\o"1-3"\h\u1664摘要 ③10110注：染菌率=染菌数/接种总数×100%3.2不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导的影响在MS培养基中加入生长调节剂制成诱导愈伤分化的培养基，而愈伤分化培养基的成分及其浓度是影响诱导率的关键，浓度过高过低会延迟甚至无法出现愈伤组织，导致诱导率降低REF_Ref8289\r\h[20,REF_Ref8308\r\h21]。为了避免这种状况，需选出最合适的培养基，在添加不同浓度萘乙酸(NAA)、苄氨基嘌呤(6-BA)的培养基上进行红薯茎尖组培脱毒，达到预期的结果。由表1可知，激素浓度配比为0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.5mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)的培养基愈伤诱导率最高，诱导率为92.3%，激素浓度配比为0.3mg/L萘乙酸(NAA)+0.6mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)的培养基愈伤诱导率最低，诱导率为80%。表6：不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导的影响培养基接种总数（株）愈伤诱导数（株）愈伤诱导率（%）M-1121083.3M-2131292.3M-310880.0注：愈伤诱导率=愈伤诱导数/接种总数×100%由图1可知，M-1、M-2、M-3培养基处理均可诱导出愈伤，其中M-1和M-2培养基中形成的愈伤组织是属于松脆型的愈伤组织。愈伤组织块比较大，有多个大细胞团，且易分散成多个单细胞。单个细胞之间具有较大的细胞间隙，细胞排列疏松无序。这种愈伤组织块后续容易处理，是最适合培养成不定芽的材料。相反，M-3培养基产生紧密型的愈伤组织，愈伤组织块较小且没有较大的细胞间隙，细胞之间通过果胶质紧密的连接，而不易分散。图1：不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导的影响A0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.4mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比接种进去的茎尖离体组织B0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.5mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比接种进去的茎尖离体组织C0.3mg/L萘乙酸(NAA)+0.6mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比接种进去的茎尖离体组织D0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.4mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比诱导形成的愈伤组织E0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.5mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比诱导形成的愈伤组织F0.3mg/L萘乙酸(NAA)+0.6mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比诱导形成的愈伤组织3.3不同激素浓度配比对红薯不定芽分化的影响将生长调节剂加入MS培养基中，制成诱导不定芽分化的培养基。不定芽分化培养基的组成成分及激素浓度配比对诱导不定芽的形成具有重要影响。浓度过低会出现愈伤组织无法分化成芽，浓度过高会出现黄花现象，导致诱导率降低。结果表明，M-4、M-5、M-6培养基处理均可诱导出不定芽，其中M-5即0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.5mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)的激素配比是诱导出不定芽的最佳培养基。表7：不同激素浓度配比对红薯不定芽分化的影响培养基接种总数（株）芽诱导数（株）芽诱导率（%）M-410880M-5131292.3M-612975注：芽诱导率=芽诱导数/接种总数×100%由图2可知，在M-4和M-5培养下形成的不定芽生长状态最好，其中M-5培养形成的不定芽数量多且芽大，并且其叶片舒展，叶色及芽点颜色较深。而M-6培养形成的不定芽生长状态较差，其不定芽数量少且芽小，叶色及芽点颜色也很浅。图2：不同激素浓度配比对红薯不定芽分化的影响A0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.4mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比接种的愈伤组织B0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.5mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比接种的愈伤组织C0.3mg/L萘乙酸(NAA)+0.6mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比接种的愈伤组织D0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.4mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比诱导形成的不定芽E0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.5mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比诱导形成的不定芽F0.3mg/L萘乙酸(NAA)+0.6mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)激素配比诱导形成的不定芽3.4不同激素浓度配比对红薯不定根分化的影响在MS培养基中加入生长调节剂制成不定根分化的培养基，而不定根分化培养基的成分及其浓度是影响诱导率的关键，浓度过高过低会延迟甚至无法出现不定根，为了避免这种状况，需选出最合适的培养基。结果表明，M-7、M-8、M-9培养基处理均可诱导出不定根，其中M-8即0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.4mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)的培养基激素浓度配比是诱导出不定根形成的最佳培养基。表8：不同激素浓度配比对红薯不定根分化的影响培养基接种总数（株）根诱导数（株）根诱导率（%）M-712975M-8131184.6M-9121083注：根诱导率=根诱导数/接种总数×100%由图3可知，在M-8和M-9培养下的形成不定根是生长速度最快，而且有大量根毛生成。其中M-8形成不定根的根毛数量最多，根茎较粗而且颜色也较深。而M-7形成不定根的根毛数量少，根茎细且颜色很浅。图3：不同激素浓度配比对红薯不定根分化的影响A0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.1mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比接种的不定芽B0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.4mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比接种的不定芽C0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.7mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比接种的不定芽D0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.1mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比诱导形成的不定根E0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.4mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比诱导形成的不定根F0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.7mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)激素配比诱导形成的不定根3.5脱毒检测结果把不定芽组织液用人工接种的方法接种到干净且无枯斑，无褪绿点或花叶等症的指示植物紫薯苗叶片上。2-6d后，观察指示植物紫薯苗。发现有2片叶子出现枯斑，褪绿点或花叶等症，如A所示。其余涂抹不定芽组织液的8片叶片没有出现病症，如B所示。由表9知，脱毒率为80%。表9：脱毒后芽诱导率待检数(片)未感染数(片)脱毒率(%)10880感染数(片)2注：脱毒率=未感染叶片数/待检总叶片数×100%如图4中A所示，2片叶子出现枯斑，褪绿点或花叶等症，断定这两片叶子存在病毒。其余涂抹不定芽组织液的8片叶片没有出现病症，如B所示，表明无病毒存在，即脱毒成功。图4：脱毒成功与未脱毒成功检测对比结果图A表示指示植物出现圆形枯斑的叶片，即脱毒未成功B表示指示植物未出现圆形枯斑的叶片，即脱毒成功4讨论及结论4.1讨论有研究表明，甘薯茎尖分生组织的再生效果受萘乙酸(NAA)、苄氨基嘌呤(6-BA)等激素的影响较大REF_Ref8916\r\h[22-REF_Ref21517\r\h23]。阮先乐等通过对甘薯品种豫薯12的茎尖分生组织的研究，发现诱导豫薯12再生的最佳培养基是MS+0.3mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.01mg/L萘乙酸(NAA)，此时茎尖萌芽率为80.4%REF_Ref10177\r\h[24]。许泳清等研究发现，福薯604茎尖组培成苗的最佳培养基为MS+1.2mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.1mg/LNAA+0.1mg/L赤霉素(GA3)，其茎尖组培苗萌芽率为93.3%REF_Ref10660\r\h[25]。邱鹏飞等以烟薯26号和烟紫薯3号为试验材料，发现烟薯26号和烟紫薯3号较适宜的茎尖诱导培养基为MS+1.5mg/L(NAA)REF_Ref11362\r\h[26]。这些研究结果表明，在不同比例的激素浓度和不同红薯品种下，茎尖诱导率和生长速度存在较大差异。另一方面，查阅文献并对比后发现，本研究中得到的愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和不定根诱导率都高于前人的大部分研究，说明本研究设计的激素浓度比例比较适合于红薯康王5号茎尖的组织培养。茎尖分生组织培养是脱毒最主要的一种方法。朱红彩等研究发现，剥离的茎尖越小，所带病毒越少，获得无病毒植株的概率就越大，但诱导成活的难度大REF_Ref8926\r\h[27]。如果剥离的茎尖越大，所带病毒越会增多，获得无病毒植物的概率就很小，不能实现脱毒。所以，在切取茎尖时，要注意大小适宜，且必须靠近它的生长点，才能保证有高的成活率和较低的污染率。本实验采用茎尖组织培养的方法对红薯康王5号进行脱毒，并用指示植物检测法进行脱毒后的病毒检测。检测后得出脱毒率达到了80%，整体实验结果符合预期。在实验中，两种或者两种以上的脱毒方法更能保证脱毒的有效性，同理两种或者两种以上的脱毒检测技术也能保证脱毒结果的准确性。所以在之后的红薯脱毒研究中，将会结合其他脱毒方法和更加先进且易操作的脱毒检测技术进行病毒检测。从而逐步提高红薯康王5号植株的脱毒率，研究更加适宜红薯康王5号的高效脱毒技术。为红薯康王5号品种的高效脱毒及生产应用提供参考依据。4.2结论本研究通过设计不同表面消毒方式，不同质量浓度的萘乙酸(NAA)、苄氨基嘌呤(6-BA)和赤霉素（GA3）的比例，研究适合诱导红薯康王5号形成愈伤组织、不定芽和不定根的培养基激素浓度配比方案。从而使红薯康王5号能快速有效脱毒，并利用指示植物检测法去检测脱毒效果。本研究结果表明，表面消毒效果最佳的方法是通过用自来水冲洗20分钟，在75%的乙醇中处理30s，用0.1%的升汞浸泡10分钟后，再用无菌水冲洗8次的消毒方式，用于红薯康王5号消毒处理，染菌率为10%；在各激素配比差异不大的情况下，萘乙酸(NAA)、苄氨基嘌呤(6-BA)和赤霉素(GA3)激素处理下培养的红薯康王5号愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和不定根诱导率均高于75%，其中MS+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.5mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)，愈伤诱导率最高，可达92.3%；MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.5mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3)处理后，芽诱导率最高，诱导率为92.3%；MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.1mg/L萘乙酸(NAA)+0.4mg/L苄氨基嘌呤(6-BA)处理后，根诱导率最高，诱导率为84.6%；此外，用指示植物检测法检测其脱毒效果，检测结果显示，脱毒率为80%。本研究的目的是建立适合红薯康王5号的有效脱毒技术方法，为红薯康王5号健康脱毒种苗的培育和绿色高效生产提供科学的技术支持。攻读学位期间的研究成果2021年11月参与项目“珍稀濒危药用植物太白贝母种子生理生化的研究”。获得由教育部高等学校大学生物学课程教学指导委员会，教育部高等学校生物科学类专业教学指导委员会举办的“第六届全国大学生生命科学竞赛省级三等奖”。参考文献张桢,周志疆,赵敏蓉等.鲜食红薯脱毒苗高效、快速繁殖的关键技术浅析[J].现代农业研究,2021,27(12):117-118.陈益华,钟志凌,贺正金等.甘薯脱毒苗的快速繁殖与生产技术[J].长江蔬菜,2009（14）:9-11张振臣.河南省甘薯脱毒技术研究现状及展望[J].河南农业科学,2009(09):64-66+74.郑世英,耿建芬,贾海慧等.紫薯济薯18号脱毒苗的芽诱导及快繁技术研究[J].现代农业科技,2017(15):24+26.刘振伟.植物脱毒技术[J].中国果菜,2005(01):23-24.宋宗淼.甘薯病毒的2种指示植物检测法[J].安徽农业,2000(01):23.迟惠荣,毛碧增.植物病毒检测及脱毒方法的研究进展[J].生物技术通报,2017,33(08):26-33.陶源,吴兴泉.植物病毒检测方法的研究进展[J].分子植物育种,2017,15(07):2901-2906.周淑芹,朱光新.电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