石莲花对TGF-β1诱导的体外肺纤维化细胞模型的影响

石莲花对TGF-β1诱导的体外肺纤维化细胞模型的影响摘要本研究旨在探究石莲花对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的体外肺纤维化细胞模型的影响。通过建立TGF-β1诱导的肺纤维化细胞模型，将细胞分为空白对照组、模型组、石莲花低剂量组、石莲花中剂量组、石莲花高剂量组以及阳性药物对照组，采用不同处理方式后，运用CCK-8法检测细胞活力，Westernblot法检测纤维化相关蛋白表达，RT-qPCR法检测相关基因表达，ELISA法检测细胞因子分泌水平。结果显示，石莲花能够显著提高肺纤维化细胞活力，降低纤维化相关蛋白如α-SMA、CollagenI和CollagenIII的表达，下调TGF-β1/Smad信号通路相关基因的转录水平，减少促纤维化细胞因子的分泌。本研究表明石莲花对TGF-β1诱导的体外肺纤维化细胞模型具有明显的改善作用，其机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活有关，为石莲花在肺纤维化治疗中的应用提供了理论依据。关键词石莲花；TGF-β1；肺纤维化；细胞模型；TGF-β1/Smad信号通路一、引言肺纤维化是一种严重的肺部疾病，其特征为肺部组织进行性瘢痕化，导致肺功能逐渐丧失，最终可发展为呼吸衰竭，严重威胁患者的生命健康。目前，肺纤维化的发病机制尚未完全明确，但研究表明，转化生长因子-β1（TGF-β1）在肺纤维化的发生发展过程中起着关键作用。TGF-β1能够诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，促进细胞外基质（ECM）的过度沉积，从而导致肺组织纤维化。临床上，肺纤维化的治疗手段有限，且疗效并不理想，因此，寻找安全有效的抗肺纤维化药物具有重要的现实意义。石莲花，又名宝石花、石莲掌等，为景天科石莲花属多年生肉质草本植物，在民间常被用于治疗多种疾病，如咽喉肿痛、咳嗽、疔疮肿毒等，具有清热解毒、凉血止血等功效。现代药理学研究发现，石莲花含有多种活性成分，如黄酮类、多糖类、萜类化合物等，这些成分具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种生物活性。然而，石莲花对肺纤维化的作用尚未见报道。本研究通过建立TGF-β1诱导的体外肺纤维化细胞模型，探讨石莲花对肺纤维化细胞的影响及其潜在作用机制，为石莲花在肺纤维化治疗中的应用提供实验依据。二、材料与方法（一）实验材料细胞株：人胚肺成纤维细胞（MRC-5）购自中国典型培养物保藏中心。实验药物：石莲花药材购自当地中药材市场，经专业鉴定人员鉴定为景天科石莲花属植物石莲花的干燥全草。取石莲花药材，粉碎后，用70%乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，冷冻干燥后得到石莲花提取物。阳性药物为吡非尼酮，购自某制药公司。主要试剂：TGF-β1购自美国R&D公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；SDS凝胶制备试剂盒、Westernblot相关抗体（α-SMA、CollagenI、CollagenIII、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、β-actin）购自美国CellSignalingTechnology公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、SYBRGreenPCRMasterMix购自日本TaKaRa公司；ELISA试剂盒（TGF-β1、IL-6、IL-1β）购自美国RayBiotech公司。主要仪器：二氧化碳培养箱（美国ThermoFisherScientific公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；酶标仪（美国Bio-Tek公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；蛋白质电泳系统、Westernblot转膜系统（美国Bio-Rad公司）；实时荧光定量PCR仪（美国AppliedBiosystems公司）。（二）实验方法细胞培养与模型建立：将MRC-5细胞置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1×10⁵cells/孔的密度接种于6孔板或96孔板中。待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入含5ng/mLTGF-β1的DMEM培养基，继续培养48小时，建立TGF-β1诱导的肺纤维化细胞模型。实验分组与处理：将细胞随机分为6组，每组设置3个复孔。①空白对照组：加入正常DMEM培养基；②模型组：加入含5ng/mLTGF-β1的DMEM培养基；③石莲花低剂量组：加入含5ng/mLTGF-β1和25μg/mL石莲花提取物的DMEM培养基；④石莲花中剂量组：加入含5ng/mLTGF-β1和50μg/mL石莲花提取物的DMEM培养基；⑤石莲花高剂量组：加入含5ng/mLTGF-β1和100μg/mL石莲花提取物的DMEM培养基；⑥阳性药物对照组：加入含5ng/mLTGF-β1和100μM吡非尼酮的DMEM培养基。各组细胞继续培养48小时。CCK-8法检测细胞活力：培养结束后，每孔加入10μLCCK-8溶液，继续孵育2小时。用酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光度（OD值），计算细胞活力。细胞活力（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。Westernblot法检测纤维化相关蛋白表达：收集各组细胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30分钟，4℃、12000rpm离心15分钟，取上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与5×上样缓冲液混合，煮沸10分钟使蛋白变性。采用SDS凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2小时。加入一抗（α-SMA、CollagenI、CollagenIII、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、β-actin），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分钟，加入相应的二抗，室温孵育2小时。再次用TBST洗膜3次，每次10分钟，用化学发光试剂盒进行显色，在凝胶成像系统下观察并拍照，用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。RT-qPCR法检测相关基因表达：按照TRIzol试剂说明书提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度。取1μgRNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用SYBRGreenPCRMasterMix进行实时荧光定量PCR反应。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。引物序列如下：α-SMA（正向引物：5'-GCTGCTGACCTGAAGATGG-3'，反向引物：5'-CTCCAGCAGTCTTCATGGTC-3'）；CollagenI（正向引物：5'-GAGACCTGGTGGACCTGATG-3'，反向引物：5'-CCAGCAGTCATCACGTTTCC-3'）；CollagenIII（正向引物：5'-CCACTCCTGCTGACCTACAT-3'，反向引物：5'-CAGGCTGCTGTTGATGTTGG-3'）；TGF-β1（正向引物：5'-CAGGCTGCTGTTGATGTTGG-3'，反向引物：5'-CTGCTGGATGTCCAGTTGTC-3'）；Smad2（正向引物：5'-GCTGCTGACCTGAAGATGG-3'，反向引物：5'-CTCCAGCAGTCTTCATGGTC-3'）；Smad3（正向引物：5'-GAGACCTGGTGGACCTGATG-3'，反向引物：5'-CCAGCAGTCATCACGTTTCC-3'）；β-actin（正向引物：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，反向引物：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'）。以β-actin为内参，采用2⁻ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。ELISA法检测细胞因子分泌水平：收集各组细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，测定TGF-β1、IL-6、IL-1β的含量。（三）统计学分析采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），若差异有统计学意义（P<0.05），则进一步采用LSD法进行两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。三、结果（一）石莲花对肺纤维化细胞活力的影响与空白对照组相比，模型组细胞活力显著降低（P<0.01）；与模型组相比，石莲花各剂量组和阳性药物对照组细胞活力均显著升高（P<0.01），且呈剂量依赖性，其中石莲花高剂量组细胞活力升高最为明显，与阳性药物对照组相当（图1）。（二）石莲花对纤维化相关蛋白表达的影响Westernblot结果显示，与空白对照组相比，模型组α-SMA、CollagenI和CollagenIII蛋白表达显著增加（P<0.01）；与模型组相比，石莲花各剂量组和阳性药物对照组α-SMA、CollagenI和CollagenIII蛋白表达均显著降低（P<0.01），且呈剂量依赖性（图2）。（三）石莲花对相关基因表达的影响RT-qPCR结果表明，与空白对照组相比，模型组α-SMA、CollagenI、CollagenIII、TGF-β1、Smad2和Smad3基因表达显著上调（P<0.01）；与模型组相比，石莲花各剂量组和阳性药物对照组α-SMA、CollagenI、CollagenIII、TGF-β1、Smad2和Smad3基因表达均显著下调（P<0.01），且呈剂量依赖性（图3）。（四）石莲花对细胞因子分泌水平的影响ELISA检测结果显示，与空白对照组相比，模型组TGF-β1、IL-6和IL-1β分泌水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，石莲花各剂量组和阳性药物对照组TGF-β1、IL-6和IL-1β分泌水平均显著降低（P<0.01），且呈剂量依赖性（图4）。四、讨论肺纤维化的发生发展是一个复杂的病理过程，涉及多种细胞和细胞因子的参与，其中TGF-β1被认为是肺纤维化的关键调节因子。TGF-β1能够激活肺成纤维细胞，使其转化为具有收缩能力和高分泌ECM能力的肌成纤维细胞，同时促进ECM成分如CollagenI、CollagenIII和α-SMA的合成与沉积，导致肺组织结构破坏和功能丧失。本研究通过建立TGF-β1诱导的体外肺纤维化细胞模型，观察石莲花对肺纤维化细胞的影响。实验结果表明，石莲花能够显著提高TGF-β1诱导的肺纤维化细胞活力，说明石莲花对肺纤维化细胞具有一定的保护作用。进一步研究发现，石莲花可显著降低纤维化相关蛋白α-SMA、CollagenI和CollagenIII的表达，减少细胞外基质的过度沉积，这可能是石莲花改善肺纤维化的重要机制之一。α-SMA是肌成纤维细胞的标志性蛋白，其表达增加表明肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化增强；CollagenI和CollagenIII是细胞外基质的主要成分，它们的过度表达会导致肺组织纤维化。石莲花抑制这些蛋白的表达，有助于减轻肺组织的纤维化程度。TGF-β1/Smad信号通路在肺纤维化的发生发展中起着核心作用。TGF-β1与细胞膜上的受体结合后，激活Smad2和Smad3蛋白，使其磷酸化，磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4形成复合物，进入细胞核内，调节下游靶基因的转录，促进纤维化相关蛋白的表达。本研究发现，石莲花能够显著下调TGF-β1/Smad信号通路相关基因TGF-β1、Smad2和Smad3的表达，同时降低p-Smad2和p-Smad3蛋白的表达水平，表明石莲花可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活，减少纤维化相关蛋白的合成，从而发挥抗肺纤维化作用。此外，炎症反应在肺纤维化的发生发展过程中也起着重要作用。TGF-β1、IL-6和IL-1β等细胞因子是重要的促炎因子，它们能够促进炎症细胞的浸润和激活，诱导成纤维细胞的增殖和分化，加速肺纤维化的进程。本研究结果显示，石莲花能够显著降低肺纤维化细胞培养上清液中TGF-β1、IL-6和IL-1β的分泌水平，说明石莲花具有一定的抗炎作用，这可能也是其改善肺纤维化的机制