污染物的生物效应检测课件

污染物的生物效应检测

第一节生物测试及方式一、生物测试（Bioassay）的定义：指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。生物测试优点：方法简单、无需特殊仪器、能综合反映污染物对生物体的影响。生物测试意义：制定排放标准、环境质量标准以及生态风险评价的重要依据。通过水污染的生物测试可获得以下数据：

1、环境状况对水中生命的适合度

2、各种环境因素如DO、pH、温度、混浊度等对生命的有利以及不利的浓度或强度

3、环境因素对于废物毒性的影响

4、污染物对受测生物的毒性

5、各种水生生物对污染物的相对敏感性

6、废水所应处理的程度

7、允许的污染物排放浓度等。

8、有关水质标准、对废水的要求和排放许可之间的一致性。二、生物测试的方式（一）生物测试的分类短期生物测试（ShortTermBioassays）被测试的生物在短期内暴露于高浓度的污染物下，测定污染物对生物机体的影响。主要测定指标：LC50、EC50、I

C50多数采用静止式。藻类<72h、水虱<48h、鱼类<96h其最长不超过8d

中期生物测试

IntermediateTermBioassays

是介于短期和长期之间的一类生物测试。

时间为8d到90d。可以是静止式和流动式，但在大多数情况下采用流动式。

长期生物测试（LongTermBioassays）

是指在低浓度污染物作用下，暴露时间要尽可能长达受试生物的整个生活史的一类生物测试，又称为全部生活史的生物测试（CompleteLife－cycleBioassays）但有些生物的生活史很长，甚至长达数年，因此，人们选用在整个生活史中的最敏感几个阶段来进行，又称为部分生活史的生物测试（PartialLife－cycleBioassays）。长期生物测试（LongTermBioassays）目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物最大浓度或最大允许毒物浓度（MATC）只能采用流动式，要保证试验的环境条件和自然界的季节变化相符合。（二）受试生物的选择

受试生物必须符合的条件：1、具有敏感性2、易得3、具有生态价值4、易于实验室培养和繁殖5、具有研究基础6、实验毒物能测7、应考虑与人类食物链的联系三、生物测试的标准化标准化的优点（必要条件）：1、准确，高选择，特异性强。2、灵敏，一般用最低检测限来衡量。3、重现性好，一般用精密度（RSD)来衡量，偶然误差小。4、简单、快速、经济、安全。标准化意义十分重大，掌握了标准比核心技术还重要，取得行业的致高点。第二节一般毒性试验一、生物毒性的基本概念毒物（Toxicant）的概念毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达到中毒剂量时才是毒物。中毒（Intoxication）中毒是各种毒性作用的综合表现。毒性（Toxicity）指一种物质引起机体损伤的能力。

效应（Effect）也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产生的生物学改变。效应是对个体而言的，这种改变可用一定的计量单位表示。反应（Response）指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定强度的个体在群体中所占的比例。反应是对群体而言的，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡率等。剂量－效应关系和剂量－反应关系以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表示反应的百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到的曲线，即为剂量－效应关系和剂量－反应关系曲线。不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量反应的相关关系不同，可呈现不同类型的曲线。（见图3－1，3－2，3－3，3－4）剂量－反应关系曲线图剂量10050反应强度（％）图3－1剂量－反应曲线（直线型）剂量10050死亡率（％）图3－2剂量－反应曲线（抛物线型）对数剂量10050死亡率（％）图3－3剂量－反应曲线（S形线型）死亡率（概率单位）对数剂量10050图3－4剂量－反应曲线毒性试验常用参数致死剂量或致死浓度

LethalDose，LethalConcentration绝对致死剂量或致死浓度（LD100、LC100）：表示一群动物全部死亡的最低剂量或浓度。半数致死剂量或浓度（LD50、LC50）：能引起一群动物50%死亡的剂量或浓度。最小致死剂量或浓度（MLD、MLC）：能使一群动物中仅有个别死亡的最高剂量或浓度。最大耐受剂量或浓度（LD0、LC0）：能使一群动物虽然发生严重中毒，但全部存活无一死亡的最高剂量或浓度。最大无作用剂量（MaximumNo－effectLevel）：指化学物在一定时间内，按一定方式与机体接触，按一定的检测方法或观察指标，不能再观察到任何损害作用的最高剂量。最大无作用剂量是评定外来化合物毒性作用的主要依据，并可以其为基础，制订每日容许摄入量（AcceptableDailyIntake,ADI）

最高容许浓度（MaximumAllowableConcentration,MAC）

最小有作用剂量（MinimalEffectLevel）是指使机体发生某种异常变化所需要的最小剂量，即能使机体开始出现毒性反应的最低剂量。

中毒阈剂量（ThresholdLevel）

因为最小作用剂量一般都是略高于最大无作用剂量，故亦称为中毒阈剂量。毒物单位与分级哺乳动物

mg/kgml/kg水环境浓度

mg/Lug/L

二、急性毒性试验（AcuteToxicityTest）急性毒性试验（AcuteToxicityTest）研究化学物质大剂量一次染毒或24小时内多次染毒动物所引起的毒性的试验。其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。急性毒性试验类型哺乳动物急性毒性试验水生生物急性毒性试验蚯蚓急性毒性试验哺乳动物急性毒性试验（1）哺乳动物急性毒性试验方法如下：按试验要求选择受试生物常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先观察几天后标记编号并随机分组。预备试验和确定剂量组选用少量动物进行预备试验，找出引起动物90％（或全部）死亡的剂量（即最高剂量组剂量）和引起动物10％死亡（或不死亡）的剂量（即最低剂量组剂量）。在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按等比级数插入若干个中间剂量（一般4～6组），从而确定正式试验的剂量组。染毒方式和受试物的配制一般用灌胃法和人工熏气法。受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液，然后依次稀释到所需浓度动物急性毒性试验（2）观察指标中毒症状：一般观察24～48小时，最好观察到绝大多数动物出现典型中毒症状。动物死亡数目和死亡时间病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖，分析死亡原因，看是技术事故还是中毒引起的死亡。确定半数致死量（LD50）试验结果LD50值越小，毒性越大。急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒性，而不能全面反映其毒性。由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的毒性也不一致，故表示LD50应注释明动物种类和染毒方式。三、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验

（一）亚慢性毒性试验是在相当于动物生命周期的1/30—1/20时间内使动物每日或反复多次接触受试物的毒性试验。（二）慢性毒性试验是指以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触，观察其对试验动物所产生的生物学效应的试验。四、蓄积毒性试验（一）基本概念低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次的与机体持续接触，经过一定时间后使机体出现明显的中毒表现，既为蓄积毒性作用（CumulativeToxicityAction)。原因：由于外来化合物进入机体的速度大于机体消除的速度，而使外来化合物在体内的量不断积累，达到了使机体引起毒性作用的阈剂量所致。（二）试验方法

1.蓄积系数法（CumulativeCoefficientMethod）蓄积系数K＝是分次给受试物后引起50%受试物出现某种毒效应的总剂量与一次给受试物后引起50%受试物出现同一毒效应的剂量的比值。比值越小，表示蓄积作用越？2.20天蓄积实验法

3.受试生物半衰期测定法生物半衰期是指一种外来化合物在体内消除到原有浓度的一半所需要的时间。生物半减期T＝

图2LPIC的流程图

2.6低压泵3注射阀5混合器7反应试剂8反应盘管9流通池10检测器11计算机浓度信号————————————||||||Mg2+Mg2+

第三节生物的分子和细胞水平检测

一、加合物的测定（一）DNA－加合物的测定

DNA－加合物是化学物经生物转化后的亲电活性产物与DNA链特异位点上的共价结合物。加合物的位点

多在N－7鸟嘌呤，O－6鸟嘌呤，

N－1－或N－3－腺嘌呤。NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤guanine（G）NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）（二）蛋白加合物的测定

各种蛋白质亦可作为大分子形成化学物质加合物。血红蛋白（Hb)在一定程度上可以代替DNA用于检测加合物，虽然化合物与Hb的加合并不致癌，但由于Hb也具有亲核中心，可与亲电物质反应形成稳定的Hb－加合物，因而Hb－加合物可间接反映连接于DNA的加合物。（二）蛋白加合物的测定

退色光度法：蛋白质分子与染料分子结合，吸光度降低，降低强度与浓度成正比。非共振瑞利散射法：蛋白质分子与有机大分子（染料、表面活性剂）或纳米材料结合，产生非共振瑞利散射现象，以次进行定性和定量检测。二、一般代谢酶的活性测定乙酰胆碱酯酶腺三磷酶三、解毒系统酶类诱导作用的检测混合功能氧化酶的诱导作用谷胱甘肽硫转移酶四、抗氧化防御系统检测过氧化氢酶谷胱甘肽过氧化酶第四节生物致突变、致畸和

致癌效应检测

基本概念突变（Mutation）基因突变（GeneMutation）和染色体畸变（ChromosomeMutation）致突变作用（Mutagenesis）和致突变物（Mutagen）致突变试验的目的致突变试验的目的是为了检查受试物对机体遗传过程有无影响的方法。鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法

Ames试验原理同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种突变叫做回复突变。注释1：营养缺陷型突变型菌株注释2：野生型微生物突变率＝诱发回复突变菌落数/自发回复突变的菌落数（对照）当突变率大于2.0时，为阳性结果。为使受试物在体外测试中受到活体类似的代谢活化作用，在实验中采用了将哺乳动物的肝细胞微粒体及受氢系统一并加入培养基中，进一步提高了实验方法的灵敏度。微核试验微核是由染色体或染色单体的无着丝点核膜受损伤后而失去整个染色体，在分裂后期，形成一个或几个规则的圆形或椭圆形小体，其嗜染性与细胞核相似，比主核小，故称微核。测定方法简便、快速、可靠，化学致突变实验常用方法。

致畸效应

概念畸形（Malformation）畸胎（Terate）致畸作用（Teratogenesis）、致畸物（Teratogen）致畸作用的毒理学特点胚胎与致畸物接触时因胚胎处于不同的发育阶段而呈现不同的敏感性。种属差异较为明显。

化学致畸作用机理突变引起胚胎发育异常；对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制；母体正常代谢过程被破坏；细胞分裂过程的障碍

致畸试验目的检测环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形。一般试验动物要求其对化学物质的代谢过程与人相似，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经济实用，如家兔、大鼠、小鼠等。致畸作用的评价注意与自然变异区分注意种属差异注意试验的阈剂量与人类实际可能摄入量之间的差别致癌效应概念化学致癌作用（ChemicalCarcinogenesis）化学致癌物（ChemicalCarcinogen）致癌试验致癌试验是检验受试物及其代谢产物是否具有致癌效应或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验法。短期筛检方法长期动物诱癌试验第五节微宇宙法

微宇宙（Microcosm）是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物圈水平上的生物效应的一种方法，又称模型生态系统法（ModelEcosystem）可分为自然微宇宙和人工微宇宙或分为水生微宇宙和陆生微宇宙。

标准化水生微宇宙

StandardizedAquaticMicrocosm，SAM用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生态系统的影响。试验时间64