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文档简介
Empower软件峰纯度计算©2018
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CONFIDENTIAL1Fucheng_li@概览©2018
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CONFIDENTIAL2PDA检测器工作原理Empower软件测定峰纯度原理概览©2018
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CONFIDENTIAL3PDA检测器工作原理Empower软件测定峰纯度原理PDA检测器工作原理上图为PDA的光路图（示意图）。高强度氘灯发射的复合光进入流通池后，被流通池后面的光栅进行分光，然后把各个单色光分散到512个二极管上达到检测的光强的目的。©2018
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CONFIDENTIAL4PDA检测器光路及每个配件的作用©2018
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CONFIDENTIAL5PDA检测器光路及每个配件的作用©2018
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CONFIDENTIAL6PDA检测器工作原理©2018
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CONFIDENTIAL7PDA检测器通过测量投射到光电二极管阵列的光量来确定流通池中样品的吸光度。该阵列由排成一排的512
个光电二极管组成。每个光电二极管都充当
一个电容器，保持有固定的电荷数。投射到光电二极管的光使二极管放电。放电的强度取决于投射到光电二极管的光量。检测器测量每个光电二极管再充电所需的电流。在二极管曝光时间间隔内，所产生的电流与通过流通池的光量成正比。PDA检测器工作原理©2018
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CONFIDENTIAL8PDA检测器对每个二极管进行再充电，同时读取二极管的再充电电流，每次读取一个。一个二极管两次电流读取间的时间间隔即为曝光时间（5到500
ms）。如果曝光时间设置为50
ms，则检测器可执行以下功能：对二极管1
进行再充电，并读取二极管1
再充电所需的电流。对二极管2
进行再充电，并读取二极管2
再充电所需的电流。依次对所有剩余的510个光电二极管进行再充电，并读取再充电所需的电流。对所有二极管进行再充电并读取数据后，等待大约45
ms，再开始进行二极管1
的再充电和读取顺序。PDA检测器在做全扫时与质谱检测器做全扫比较类似，二极管曝光一次，完成一次数据的记录。概览©2018
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CONFIDENTIAL9PDA检测器工作原理Empower软件测定峰纯度原理PDA检测器的三维（3D）图©2018
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CONFIDENTIAL10PDA检测器的三维（3D）图色谱图UV
光谱时间波长
响应©2018
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CONFIDENTIAL11PDA检测器的三维（3D）图PDA
在每一个数据点实 时采集光谱图，取决于 采集速率；顶点的光谱是用于比较 的参考光谱；峰纯度算法对峰内所有 的光谱与顶点光谱进行 对比分析。AbsorbanceSpectra
per
Run
Time200.00240.00320.00280.00nmAbsorbance200.00240.00320.00280.00nmAbsorbance200.00240.00320.00280.00nmAbsorbance©2018
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CONFIDENTIAL12溶剂信息©2018
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CONFIDENTIAL13样品和流动相（溶剂，包括使用的甲醇、乙腈、缓冲盐）均会产生紫外吸收。溶剂UV截止波长（nm）溶剂UV截止波长（nm）水180正己烷197甲醇205环己烷200正丙醇205三氯甲烷265乙腈190氯仿245四氢呋喃212苯280丙酮330甲苯285乙酸甲酯260二氯甲烷232乙酸乙酯260四氯乙烯280硝基甲烷3801,2-二氯乙烷225溶剂信息©2018
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CONFIDENTIAL14流动相—水的影响Poor
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QualityBlankGradientBlank-Milli-Q
water©2018
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CONFIDENTIAL15Blank-
DIwater100%
H2O
to
100%
ACN不干净的水也会造成较大的背景吸收。240
280
200nm2000.40.81.21.62.0甲醇乙腈254nm1
AU0.0
0.0240
280nm0.40.81.21.62.02.40.1%
磷酸1%
乙酸1
AU254nm流动相—有机相及添加剂的影响©2018
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CONFIDENTIAL16甲醇及乙腈的紫外吸收也不相同，如甲醇在210nm有一个最大的吸收峰。磷酸的截止波长也比乙酸更低，不同的浓度的添加剂造成的吸收也不一样。所以我们在PDA观察到的光谱是流动相与样品的光谱加合。化合物及溶剂光谱2AbsorbanceWavelength1903500化合物流动相观察到的光谱化合物及流动相均有吸收，在低波长区域，由于两个物质吸收的叠加，光谱的吸收已经饱和（红圈所示位置）。©2018
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CONFIDENTIAL17Absorbance190210230250nm2702902.01.51.00.5©2018
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CONFIDENTIAL18浓度对光谱的影响在光谱没饱和的情况下，待测的浓度也会影响到光谱的形状。以本图（苯甲酸）为例，195nm和227nm的吸光度在最低浓度时，吸光度之比约为2:1；在最高浓度点时，吸光度之比约为1:1。苯甲酸的紫外吸收光谱形状与其浓度有关。在PDA光谱进行光谱匹配判断阳性与否的情况下，如果浓度太高，可能会由于光谱的失真造成比对的失败。采集数据形成光谱本图为2998
PDA
检测器设置3D扫描实验参数设置的地方。对2998系列的PDA，扫描范围为190 nm到800 nm。最小的分辨率为1.2
nm，这个分辨率为数字分辨率（即每个二极管能够实现的最小波长数据的纪录）。©2018
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CONFIDENTIAL19几种不同的分辨率定义©2018
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CONFIDENTIAL20二极管分辨率：每个二极管的分辨率，亦称数字分辨率—检测器的波长范围是190到800nm
而二极管矩阵中有512个二极管。因此,610nm除以512
大约等于1.2
nm/每个二极管光学分辨率：—狭缝宽度决定光学分辨率，2998的光学分辨率是1.2nm，光学分辨率影响光谱分辨率光谱分辨率：—光谱分辨率是指在采集光谱数据时数据点之间的波长间隔（nm），2998的光谱分辨率最高是1.2
nm。二极管分辨率和光谱分辨率比较类似。光学分辨率及数字分辨率高分辨率的光学单元应是：一束光照在一个光电二极管上光学分辨率及数字分辨率相同但是带来的问题是：光通量下降导致噪音加大光学分辨率和噪音是一对矛盾狭缝©2018
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CONFIDENTIAL21光电二极管1nm
的二极管及1nm分辨率光学分辨率及数字分辨率加大光通量增加狭缝宽度牺牲分辨率通过狭缝的光要照到彼此相邻的光电二极管上，三个相邻光电二极管的光谱信息是一样的如左图所示，虽然数字分辨率是1nm，实际的光学分辨率只有3nm狭缝光电二极管1
nm的二极管及3
nm的分辨率©2018
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CONFIDENTIAL22“苯”的不同分辨率光谱图230.00250.00nm270.00Absorbance230.00250.00nm270.00Absorbance230.0250.0
270.0
230.00nm250.00nm©2018
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CONFIDENTIAL23270.00Absorbance2.4
nm4.8
nm3.6
nm1.2nm该分辨率为PDA仪器方法“通用”界面的“分离度”。光谱分辨率的意义©2018
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CONFIDENTIAL24以一个190
到400
nm全扫光谱为例，如果光谱分辨率为1.2
nm，则这张光谱共会采集175个点[(400-190)/1.2=175]。由光谱形成矢量
A1Spectrum
Aa©2018
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CONFIDENTIAL25AUnm
1
2A1A2A以光谱的a点为例，它的横坐标为波长（代表方向），纵坐标为吸收强度（代表强度）。以原点（0,0）为起点，做一线段，方向从原点到A1。有大小有方向的量即为矢量。200.00240.00
280.00
320.00nmEthylPabaAbsorbance由光谱形成矢量波长=方向吸光度=大小V1V2可以使用平行四边形法则对矢量进行合成。
Empower在计算纯度角值时会对光谱进行合成，如果光谱范围为190到400nm，分辨率为1.2nm，则会有175个点需要进行合成。©2018
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CONFIDENTIAL26多点合成合矢量How
do
I
calculate
avectorin
175
dimensions
???答案：这个活不是人干的，电脑加线性算法搞定。©2018
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CONFIDENTIAL27矢量的差异—光谱匹配角AUnmSpectrum
AVector
AndimensionsVector
BndimensionsnmSpectrum
BAU©2018
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CONFIDENTIAL28矢量的差异—光谱匹配角nm通过比较两个矢量A&
B的角度（
，光谱匹配角）差异，来比较两个矢量的异同AU
BA如果A
&B完全不同，则
=90°如果A
&
B完全相同，则
=0°©2018
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CONFIDENTIAL29在计算纯度角时，计算的就是顶点光谱与其他点光谱的比较光谱匹配角的作用
More
Brelative
to
A
ABAAAB
B
cannot
be
detectedBLarger
spectraldifferencesBDetection
ofimpurity
B
while
analyzing
A光谱的差异越大（图2）、要比较的两个化合物的浓度越大（图3），则光谱匹配角就越容易测量。如果一个样品的浓度大，一个浓度小，则光谱匹配角相对比较难测定（图4）。1.2.3.4.©2018
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CONFIDENTIAL30光谱匹配角（60度）AbsorbanceWavelength结构不同，则其光谱差异也较大；较大的光谱差异将导致较大的光谱匹配角的差异。EthylparabenEthyl-p-aminobenzoic
acid©2018
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CONFIDENTIAL31光谱匹配角（10度）TheophyllineDyphyllineAbsorbanceSimilar
spectrafrom
compoundswith
similarchemicalstructure230.00
250.00
270.00
290.00
310.00Wavelength
(nm)结构相似，则其光谱也比较相似。光谱匹配角的差异也会比较小。©2018
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CONFIDENTIAL32光谱匹配角（0.5度）AbsorbanceMethylparabenEthylparabenWavelength如果只差个亚甲基（-CH2-），则光谱的差异更小。©2018
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CONFIDENTIAL33PDA光谱用来干嘛©2018
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CONFIDENTIAL34峰纯度/峰一致性分析峰鉴定/谱库匹配峰纯度分析200.00240.00320.00280.00nmAbsorbanceBaseAbsorbance210.0
250.0
290.0nmApex210.0250.0
290.0nmInflectionAbsorbance使用峰顶点光谱作为参比光谱（参比矢量）；色谱峰其他各个点的光谱（测试矢量）与参比光谱进行比较，得到各个点与顶点的光谱匹配角；各个光谱匹配角的加权平均值即为这个色谱峰的纯度角（Peak
Purity）；纯度角值<纯度阈值，则表明色谱峰没有共流出。©2018
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CONFIDENTIAL35峰纯度分析—纯度角值与纯度阈值纯度角=0.1°纯度阈值=0.23°纯度角=4.7°纯度阈值=5.1°纯度角<纯度阈值，峰纯度过关。当积分位置发生变化，将峰前面光谱噪音比较大的部分也考虑进去，则峰纯度值和阈值均会增大。©2018
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CONFIDENTIAL36峰纯度分析©2018
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CONFIDENTIAL37所谓“峰纯度”指的是色谱峰的光谱一致性（光谱相似性）；如果峰纯度测试合格，不是说绝对没有共流出，只能说明峰纯的可能性大：在做峰纯度测试时，希望杂质满足以下要求：待测的杂质在所选光谱区域内必须有明显的吸收；待测的杂质要有足够的量被PDA检测器所检测到；与主峰（API或被强降解的峰）的光谱要有明显的差异。光谱角的影响因素由于检测器噪音和光学测量的误差的原因，即使一个样品连续扎三针，它们的光谱（以顶点光谱为计）也不可能完全一致，体现在光谱匹配角上也有一定的角度差异。因此，需要去计算这个本底误差作为阈值来比较两个是否真的存在明显的差异。在
Empower里用阈值角（溶剂角与噪音角的加合）来表征这个误差。©2018
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CONFIDENTIAL38峰纯度中的溶剂角与噪音角nmAUBABA不确定的区域上述两个光谱在信噪比存在明显差异，光谱A的噪音明显大于光谱B，因此将其转变为矢量后，其匹配角出现一定的角度差异（理论上角度应该为0）。因此Empower的阈值角由两项组成，一项为恒定项；一项为变化项，该变化项反比于光谱的峰高（与样品浓度成反比，在一定范围内，样品的浓度越大，则其光谱的信噪比就越好，如光谱B）。©2018
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CONFIDENTIAL39峰纯度中的溶剂角与噪音角©2018
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CONFIDENTIAL40阈值角中随峰高反比变化的部分，主要是检测器噪音对光谱一致性的影响。样品浓度减小，则其与高浓度样品的光谱差异也会增加（如上页）；在计算噪音角时，需要找到一段没有色谱峰很平滑的基线作为噪音区间。
Empower峰纯度算法将使用这段噪音区间的光谱（将其转变为矢量）与色谱峰的顶点光谱（同样将其转变为矢量）进行比较，这个即所谓的噪音角（Noise
Angle）。这个值反比于（光谱的）峰高。纯度阈值恒定的部分为溶剂角（Solvent
Angle），这个值为溶剂效应与光学测定误差的综合体现。这个值可以手动测定。峰纯度测定参数设置©2018
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CONFIDENTIAL41“通用”界面的分离度需设定为1.2nm（将光谱分辨率调到最大），这样能保证分辨出相似光谱的细小差别；波长范围：在选择波长时应包含待测物与杂质都有吸收的区域。这样将有助于最大化峰纯度角（最大化的将待测物和杂质的光谱区别开）；避免选择待测物与杂质都没吸收的区域；全扫范围选择太宽增加噪音角、数据存贮空间及数据处理时间，并且无助于增大纯度角（降低了测定杂质的敏感性）；波长范围必须10倍于分辨率；尽量避免使用190到210
nm；这个波长范围会引入较大的噪音并对纯度角测定产生影响；流动相也会有吸收造成对测定影响。峰纯度测定参数设置©2018
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CONFIDENTIAL42采样速率—从峰起点到峰终点需要有12张光谱图；—色谱峰的最大峰高需要小于1.0
AU（吸收度过大后会对光谱准确性有影响，可能会造成光谱的“平头”）；优化积分参数—合理的积分参数对峰纯度测定很重要，峰型过于拖尾也会影响峰纯度的测定；峰纯度算法—如何设置处理方法©2018
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CONFIDENTIAL43噪音区间的选择；光谱比较的波长范围；优化积分参数；峰纯度角度值算法选择；峰纯度计算对应数据扫描的波长范围为210到400
nm©2018
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CONFIDENTIAL44噪音区间的选择由3D数据的最大值图来确认噪音区间：V0
?无峰的一段基线常被用于计算噪音角，这段基线至少需要12张光谱，如果采样速率是20Hz，则只需要1秒宽的基线足矣。由于在死体积或死时间（V0或t0）前一般没有东西被洗脱，所以可以选这段基线，其他地方的基线存在包埋峰的风险。©2018
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CONFIDENTIAL45噪音选择区间(0-0.120
min)V0
?V0
?可能的溶剂峰？©2018
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CONFIDENTIAL46噪音区间的选择噪音区间的选择©2018
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CONFIDENTIAL47噪音区间的光谱噪音光谱形状上像一个峰，且表现出很强的末端吸收，吸光度已达到0.046AU，在这段时间可能有化合物洗脱。因此需要修改噪音区间。可以用噪音光谱来判断噪音区间选择是否恰当，在此显示的噪音光谱为这段噪音区间内各个点的
光谱的平均值；先点击“不选所有光谱”；再点击“显示噪音光谱”；噪音光谱与化学因素有关。在噪音光谱中应只包括随机的噪音而不应出现明显的吸收峰，并且也不可以有因为共流出物质引起的紫外吸收峰；噪音光谱的最大值应与光学测定误差数量及接近；不选所有光谱显示噪音光谱1.2.察看光谱©2018
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CONFIDENTIAL48噪音区间的光谱新的噪音时间段(0-0.10
min)可能的共流出峰把噪音区间选小一些，避开0.11min左右的那个小峰。©2018
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CONFIDENTIAL49噪音区间的光谱只有噪音的噪音光谱。最大吸收值为0.0003AU，相较于之前选择的噪音区间最大吸收值（0.046），下降100多倍，这样的噪音选择较好。©2018
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CONFIDENTIAL50光谱比较的波长范围1.2.3.4.Empower默认的光谱比较范围是190到800nm，需设定为实际的扫描范围，以这个图谱为例，应该设定为
210
到400nm。©2018
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CONFIDENTIAL51优化积分参数在这个图中，峰2的峰纯度不过关，原因是积分参数设定不当，比如这个例子把积分类型改为“峰谷到峰谷”积分即可。©2018
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CONFIDENTIAL52优化积分参数常见需要调整的积分参数包括积分类型、检测阈值（Apextrack）或阈值（传统积分），目的为让色谱峰积的更对称。©2018
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CONFIDENTIAL53峰纯度角度值算法选择活动峰区域：一般选择为100%，该参数设定进行峰纯度测试的范围，取值范围为
0~100%，其中100%代表从峰起点到峰终点整个范围内的点均用于纯度测试；若设定为50%，则前50%为从峰起点到峰顶点一半的位置，后50%为峰顶点到峰终点一半的位置。©2018
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CONFIDENTIAL54峰纯度角度值算法选择©2018
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CONFIDENTIAL55自动阈值：Empower软件自动计算噪音角（基于指定的噪音区间）及溶剂角（由峰的吸光度确定），并将其的加合值作为纯度阈值用于峰纯度的计算；噪音+溶剂：自己填入溶剂角（下面会讲如何计算），软件会自动计算噪音角并加上输入的溶剂角作为阈值判定峰纯度；噪音：仅使用噪音角作为判断依据，忽略溶剂对实验结果的影响；溶剂：
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