CN112789684B 用于预测对pd1轴导向疗法的应答的方法和系统 （文塔纳医疗系统公司）

2021.03.26PCT/US2019/0537742019.09.30WO2020/072348EN2020.04.09multipleximmunofluorescence用于预测对PD-1轴导向疗法的应答的方法过开发并用于鉴定可能对PD-1轴导向疗法有应21.一种就肿瘤样品对PD-1轴导向疗法有应答的可能性进行评分的方法，所述方法包(xxiii)所述ROI中PD-L1+/CD68+细胞的数量与所述ROI中CD68+细胞的总数量之间的(xxiv)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+/CD8–细胞的总数量之(c)将评分函数应用于包括所述一个或多个特征度量的特征向量以生成指示肿瘤将对(xxiii)间质ROI中PD-L1+/CD68+细胞的数量与间质ROI中CD68+细胞的总数量之间的(xxiv)间质ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与间质ROI中CD3+/CD8–细胞的总数量之3.根据权利要求1所述的方法，其中所述特征向量还包括选自由以下项组成的组的一(vi)所述ROI中在上皮细胞的10μm内的CD8+细胞的数量(vii)所述ROI中在上皮细胞的30μm内的CD8+细胞的数量(vii3(xxi)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+/CD8–细胞的总数量之(xxiv)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+/CD8–细胞的总数量之4.根据权利要求3所述的方法，其中所述ROI选自由以下项组成的组：肿瘤ROI、间质(xxiii)所述ROI中PD-L1+/CD68+细胞的数量与所述ROI中CD68+细胞的总数量之间的(xxiv)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+/CD8–细胞的总数量之+/CD68+细胞的数量与所述EM–ROI中CD68+细胞的所述EM–ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述EM–ROI中CD3+/CD8–细胞的总数量之所述EM–ROI中PD-L1+/CD3+细胞的数量与所述EM–ROI中CD3+细胞的总数征向量包括选自由以下项组成的组的一个或(xxii)所述EM+ROI或肿瘤ROI中PD-L1+/CD8+细胞的数量与所述EM+ROI或肿瘤ROI中CD8+(xxiii)所述ROI中PD-L1+/CD68+细胞的数量与所述ROI中CD68+细胞的总数量之间的(xxiv)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+CD8–细胞的总数量之4(xxv)所述EM+ROI或肿瘤ROI中CD3+/CD8–细胞的数量与所述EM+ROI或肿瘤ROI中CD3+细8.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROI来源于的数字图像，其中所述形态学染色的切片和多重亲和组织化学染色的肿瘤切片为连续切9.根据权利要求8所述的方法，其中所述ROI由使用者10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述评分函数来源于选自由以下项11.根据权利要求10所述的方法，其中所述评分函数为拟合至所选特征度量以预测对根据权利要求1至11中任一项所述的方法基于所述评分是高于还是低于所述预定的截止值，选择待接受所述PD13.根据权利要求12所述的用途，其中所述PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体指令当由所述处理器执行时使所述处理器进行包括根据权利要求1至11中任一项所述的方仪或显微镜适于捕获所述肿瘤样品的切片的数字图像并将所述图像传送所述自动苏木精和曙红染色器编程为对由所述自动载玻片染色器染色的所述切片的一个519.根据权利要求15至18中任一项所述的系统，其中所述系统进一步包括用于跟踪样21.一种用于存储计算机可执行指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述计算机可执行指令由处理器执行以进行操作，所述操作包括根据权利要求1至11中任一项所述的方6[0002]本文是根据专利合作条约的国际申请，要求2018年10月1日提交的美国临时专利申请号62/739,828和2018年10月9日提交的美国临时专利申请号62/742,934的优先权，将[0006]通过在肿瘤细胞上和在肿瘤微环境中上调程序性死亡1(PD-1)途径及其配体程序[0007]PD-L1是用于选择待接受PD-1轴定向疗法的患者的最广泛使用的预测性生物标志[0011]本公开总体上涉及鉴定和使用新生物标志物预测实体瘤对PD-1轴导向疗法的应7重染色的组织切片的该数字图像提取多个特征；(c)将特征选择函数应用于所提取的多个成多个预测对检查点抑制剂疗法的应答的候选模型，并测试每个候选模型与应答的一致的函数和基于Relief的函数)和/或嵌入特征选择函数(例如弹性网络/最小绝对收缩函数成的组：象限判别分析(QDA)、线性判别分析(LDA)、支持向量机(SVM)和人工神经网络应用于包括(c)的一个或多个所提取的特征的特征向量以生成评分，其中该评分指示肿瘤8ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据疗法的应答的所述前10个最重要的特征中的至少LAG3(第2组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的表4右栏中的至少一个特征。在某一确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的表4右栏的特征中的至中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量、PD-L1+细胞的20μm半径内的9有应答的可能性；(e)比较该评分与预定的截止值；以及(f)基于(e)的比较选择待接受该切片的数字图像，其中该形态学染色的切片和多重亲和组织化学染色的样品为连续切片。性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据疗法的应答的所述前10个最重要的特征中的至少LAG3(第2组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的表4右栏中的至少一个特征。在某一确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量、PD-L1+细胞的20μm半特征的特征向量以生成评分，其中该评分指示肿瘤将对该PD-1轴导向疗法有应答的可能包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个测患者对PD-1轴导向疗法的应答的所述前10个最重要的特征中的至少PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的质中PD-L1+CD3+细胞的分数。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的表4右栏中的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一细胞的20μm半径内的PD-1低强度CD8+细胞的平均值#、CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均值#、和CD8+细胞上的Lag3+强度的最大述特征包括以下项中的每一项：上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞包括(b)的一个或多个特征的特征向量，其中所述评分函数的输出值是预测患者对PD-1轴对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要特征ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的所述前10个最重要特征的至品的至少第二连续切片的数字图像中自动显示该ROI，其中该第二连续切片用第1组染色。包括(b)的一个或多个特征的特征向量，其中所述评分函数的输出值是预测患者对PD-1轴多个特征是确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要特征之一的至少所述扫描仪或显微镜适于捕获该组织样品的切片的数字图像并将该图像传送至计算机设[0024]图4A示出了在本文公开的图像分析系统上实现的示例性工作流程，其中在执行[0025]图4B示出了在本文公开的图像分析系统上实现的示例性工作流程，其中在执行[0030]图9是用第1组染色的样品的IHC图像，该样品来自显示对PD-1轴导向疗法治疗完[0033]图12示出了使用ReliefF特征选择函数针对第2组的前15个特征的排名。特征如下：(1)PD-L1+/CD8+细胞的20μCD8+细胞的PD-L1强度的最大值；(3)在panCK–区域中PD-1+/PD-L1-/Lag3+/CD8+细胞与CD8+[0034]图13示出了使用随机森林特征选择函数针对第2组的前15个特征的排名。特征如CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比；(6)panCK–区域中PD-L1+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的[0035]图14A含有说明以下的图表：PD-L1+细胞的10μm半径内的空间方差#PD-1+细胞的+细胞(F1)、PD-L1+细胞的20色点)、PD-L1+细胞的20μm内的PD-1低细胞(白色点)、和PD-L1+细胞的10μm内的PD-1+细胞图形重构，显示了无应答者中PD-L1+细胞的20μm内的PD-L1+细胞和PD-1低细胞之间的空间[0039]图16A是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于panCK-阴性区域中Lag3+/CD8+细胞的数量与CD8[0040]图16B是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于panCK-阴性区域中Lag3-/CD8+细胞与CD[0041]图16C是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于Lag3+/panCK–细胞的数量除以[0042]图16D是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基[0043]图16E是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基[0044]图16F是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基[0045]图16G是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基[0046]图16H是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基[0047]图16I是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基[0048]图16J是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基[0049]图16K是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基[0050]图16L是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基[0051]图16M是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基理解的相同意义。参见，例如，Lackie,DICTIONARYOFCELLANDMOLECULARBIOLOGY,Elsevier(第4版2007)；Sambrook等人,MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL,Cold(例如能够结合一级抗体的二级抗体)、三级检测试剂(例如能够结合二级抗体的三级抗该可检测信号指示沉积在样品上的可检测部分的存在(即定性分析)和/或浓度(即定量分光分子的额外的实例可见于MolecularProbesHandbook—AGuidetoFluorescentProbesandLabelingTechnologies,MolecularProbes,Eugene,OR,ThermoFisher距离上生物标志物阳性像素的数量等)、表达一种或多种生物标志物的细胞之间的平均值下对生物标志物或其他结构进行微观检测。实例包括免疫组化(IHC)、显色原位杂交[0064]免疫逃逸生物标志物：肿瘤细胞表达的生物标志物可帮助肿瘤避免T细胞介导的及利用包含全部或部分或其组合的人免疫球蛋白基因座的转实施例中，特异性检测试剂与无关靶标的结合程度为该抗体与抗原结合的小于约10例A/LDL受体的支架；Amgen,ThousandOaks,CA)、dAb(基于VH或VL抗体结构域的支架；GlaxoSmithKlinePLC,Cambridge,UK)、DARPin(基于锚蛋白重复序列蛋白的支架；MolecularPartnersAG,Zürich,DevelopmentofNovelProteinScaffoldsasAlternativestoWholeAntibodiesforImagingandTherapy:StatusonDiscoveryResearchandClinicalValidation,CurrentPharmaceutical和CD3-ζ链(及其亚型和变体)的示例性序列分别可见于Uniprot登录号P09693(用于本文在序列的经典氨基酸序列)、P07766(用于本文在SEQIDNO:3中公开的序列的经典氨基酸序ζ-同源二聚体内的结构(例如表位)结合的任何生物标志物特异性药剂。变体)的示例性序列分别可见于Uniprot登录号P01732(用于本文在SEQIDNO:5中公开的序列的经典氨基酸序列)和P10966(用于本文在SEQIDNO:6中公开的序列的经典氨基酸序的功能的天然变体的任何CD8-α链多肽；具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的任何CD8-β链多肽；包括具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的任何CD8-α链多肽和/或具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的任何CD8-β链白存在于各种不同的血细胞和肌细胞的细胞质颗粒中，经常用作巨噬细胞谱系细胞(包括和变体)的示例性序列可见于Uniprot登录号P34810(用于本文在SEQIDNO:7中公开的序生物标志物特异性药剂涵盖与人CD68多肽(例如在SEQIDNO:7的多肽)内的结构(例如表的细胞角蛋白以特异性地染色组织样品中的上皮组织的任何生物标志物特异性试剂或生包括抗体混合物，该抗体混合物含有选自由以下项组成的组的两个或更多个抗体克隆：2、M351501-2和M351529-2)。AE1、AE3、和5D3的混合物可商购自BioCare(目录号CM162、[0085]PD-1：程序性死亡-1(PD-1)是2号染色体上PDCD1基因编码的CD28受体家族的成物标志物特异性药剂涵盖与人PD-1多肽(例如在SEQIDNO:8的多肽)内的结构(例如表位)一些实施例中，人PD-L1蛋白质生物标志物特异性药剂涵盖与人PD-L1多肽(例如在SEQIDNO:9的多肽)内的结构(例如表位)特异性结合的任何生物标志物特异性药剂。蛋白(Ig)超家族的成员。用于人LAG3蛋白质(及其亚型和变体)的示例性序列可见于Uniprot登录号P18627(用于本文在SEQIDNO:10中公开的序列的经典氨基酸序列)。在一些实施例中，人LAG3蛋白质生物标志物特异性药剂涵盖与人LAG3多肽(例如在SEQIDNO:10的多肽)内的结构(例如表位)特异性结合的任何生物标志物特异性[0089]图1是示出导出本文公开的评分函数的示例性方法的流程图。本方法和系统的评比各组测试截止值107。然后选择显示出组之间所需间隔的评分函数和截止值组合以包括[0091]通常在从具有肿瘤并且已知对PD-1轴导向疗法有应答的受试者的队列中获得的[0092]获得的样品101通常是以与组织化学染色相容的方式处理的组织样品，包括例如志物是一组PanCK生物标志物特异性试[0097]生物标志物特异性试剂通过介导紧邻生物标志物特异性试剂的可检测部分的沉传导缀合物或酶反应性染料发生反应，以实现染料的原位生成和/或染料在组织样品上的[0102]非限制性实例中，标记缀合物的特异性检测试剂可以是二级检测试剂(例如与一性试剂的酶然后可用于多种方案中以沉积可检性磷酸酶的酶与水溶性金属离子和该酶的氧化还原无活性底物结合使用。在一些实施例2005/003777和美国专利申请公开号2004/0265922；它们各自通过引用以其全文并入本和罗丹明110(罗丹明)。在其他实例中，潜在的反应性部分与特异性结合对的一个成员缀[0107](1)与潜在的反应性部分连接的生物素或生物素衍生物(例如脱硫生物素)、和连接至染料或者与显色底物具有反应性或与染料具有反应性的生物素结合实体(例如亲和[0108](2)连接至潜在反应性部分的半抗原，以及连接至染料或与显色底物具有反应性[0109]具体包括在表1中列出的生物标志物特异性试剂和检测试剂组合的非限制性实如本领域普通技术人员将理解的，每种生物标志物特异性试剂的检测方案可以是相同的，[0118]可商购的检测试剂或包括适用于本发明方法的检测试剂的试剂盒的非限制性实例包括：VENTANAultraView检测系统(与酶缀合的二级抗体，所述酶包括HRP和AP)；VENTANAiVIEW检测系统(生物素化的抗物种二级抗体和链霉亲和素缀合的酶)；VENTANAOptiView检测系统(OptiView)(与半抗原三级抗体)；VENTANA扩增试剂盒(未缀合的二级抗体，该未缀合的二级抗体可与前述VENTANA检测系统中的任何一种一起使用，以扩增沉积在一级抗体结合位点处的酶的数以实现额外的酶分子的沉积。然后使用可检测部分孵育样品以实现染料沉积)；VENTANA团和染料试剂盒，上述产品中的每种均可从VentanaMedicalSystems,Inc.(Tucson,例的酶比抗体的紧凑型聚合物的二级抗体)；以及DAKOEnVisionTM+系统(与二级抗体缀合剂和酶组合的组合，这些组合不会导致不同抗体或检测试剂之间的脱靶交叉反应性(称为个一级抗体可以包括不同的半抗原或表位标签，并且选择二级抗体以特异性结合半抗原或生物标志物特异性试剂附近沉积不同的酶。在US8,603,765中示出了此类排列的实例。此类排列具有潜在的优点，即能够使每组生物标志物特异性试剂和相关的特异性结合试剂同时存在于样品上和/或用生物标志物特异性试剂和检测试剂的混合物进行染色，从而减少[0122]完成不同生物标志物差异标记的另一种方法是依次对每种生物标志物进行样品至第一生物标志物特异性试剂和其他检测试剂与该切片反应，导致第一可检测实体的沉从样品洗脱抗体(称为“热杀方法”)，例如Stack等人在以下公开的那些,Multiplexedimmunohistochemistry,imaging,andquantitation:Areview,withanassessmentofTyramidesignalamplification,multispectralimagingandmultiplexanalysis,[0128]在某些实施例中，还期望对生物标志物染色的切片102的系列切片进行形态学染的实例包括来自Roche的VENTANASYMPHONY(单个载玻片染色器)和VENTANAHE600(单个载玻片染色器)系列H&E染色器；来自AgilentTechnologies的CoverStainer(批量染色器)；来自LeicaBiosystemsNusslochGmbH的LeicaST4020SmallLinearStainer(批[0130]在某一实施例中，在生物标志物染色的样品104的数字图像中识别与生物标志物的组相关的一个或多个对象。对象的数量和/或不同对象与另一个对象之间的关系用于定[0134]在一些实施例中，还在生物标志物染色的样品104的数字图像中识别一个或多个将ROI缩小到形态学区域的圆周内的定义距离，或通过识别ROI中具有某些特征(例如某些例如边缘的任何点的定义距离内的所有点、边缘的任何点的定义距离内地一侧的所有点、缘区域的中心点为中心的定义半径的圆内的的数字图像上手动描绘一个或多个形态学区域(例如肿瘤区域和/或浸润前沿)。图像中所描绘的一个或多个区域然后可以用作用于特征计算的ROI或用作用于计算RO[0144](b)计算机系统应用模式识别功能来识别具有轮廓区域的形态学特征的样品的额[0146](a)用户通过在样品的H&E图像中描绘肿瘤区域和浸润前沿的[0148](c)计算机系统应用模式识别功能来识别样品的额外的区域，这些区域具有通过ROI中的特定细胞的比)、落入更小的ROI落入更大的ROI的更大的ROI总对象的分数(例如，低”细胞是在所有测试样品中在所有测量的PD-1+细胞的染色强度最低的三分之一的PD-1+最高的三分之一的PD-1+细胞。对相关性对这些特征进行排名。示例性特征选择函数包括集合特征选择函数(包括例如随机森林函数)、过滤方法函数(包括例如基于互信息的函数(mRMR)/基于相关系数的函数和基于Relief的函数)和/或嵌入特征选择函数(例如弹性网络/最小绝对收缩函数或选择算[0166]候选模型是通过将队列中每个成员的所选的特征度量和结果数据输入建模函数用于预测治疗后进展性疾病相对于治疗后稳定性疾病相对于对疗法的部分或完全应答的用于预测患者在治疗后将患有进展性疾病或稳定性疾病的可能性相对于患者对疗法具有全应答的患者。在某一实施例中，分层截止值区分(a)可能在治疗后患有进展性疾病的患测试样品的图像以计算测试样品的评分。图2是示出使用上文所述的评分函数为测试样品物染色的图像中标注与评分函数相关的一个或多个ROI以及在相关特征度量的计算中使用权衡是否要施用PD-1轴导向疗法的决策的其他临床变量进行[0172]评分系统包括图像分析系统300。图像分析系统300可以包括一个或多个计算设行本文所述的技术和/或操作的任何其他一种或多种类型的一种或多种电子设备。在一些300可以包括经由一个或多个局域网和/或诸如因特网之类的广域网彼此通信地耦合的一器314可以包括任意类型的易失性或非易失性存储器的任意组合，例如随机存取存储器以包括图3中为简洁起见未示出的额外的引擎和模块(例如，输入设备、网络和通信模块现。可用于实现如本文公开的模块的示例性可商购的软件包包括VENTANAVIRTUOSO；DefiniensTISSUESTUDIO、DEVELOPERXD、和IMAGEMINER；和VisopharmBIOTOPIX、别器的作用是识别并标记图像中的相关对象和其他特征，这些对象和特征随后将用于评分。对象识别器310可以从每个图像中提取(或为每个图像生成)表征图像中各个对象以及生物标志物，对象识别器310提取的特征可包括足以将样品中的对象分类为所关注生物标志物-阳性对象或所关注生物标志物-阴性标志物的特征或特征向量和/或通过对象的生物的对象类型而被不同地加权的情况下，由对象识别器310提取的特征可以包括与确定与生疫细胞等)将对象分类。在不考虑与对象的关联而对生物标志物表达的程度进行评分的情[0182]图像分析系统300还可以将图像传递到ROI生成器311。ROI生成器311用于从计算[0183]在一个实施例中，可通过用户界面模块312访问ROI生成器311。在用户界面模块112的图形用户界面上显示生物标志物染色的样品的图像(或生物标志物染色的样品的形态学染色的连续切片)，并且用户在被视为ROI的图中标注一个或多个区域。在该实例中，可以在用户界面模块312中标注浸润前沿或肿瘤区域的边缘，并且ROI生成器311使用该边生物标志物染色的连续切片的图像中，从而将来自H&E图像的组织结构与连续切片中的相(这可以最小化计算时间)，或者它仍可以在整个图像上实现(这可以允许在不重新运行对进行分析并呈现给用户。[0204]各种扫描仪(荧光和明视野)的详细概述可见于Farahani等人,Wholeslideimaginginpathology:advantages,limitations,andemergingperspectives,过引用以其整体并入本文。可商购的载玻片扫描仪的实例包括：3DHistechPANNORAMICVS120‑SL；OmnyxVL4、和VL120；PerkinElmerLAMINA；PhilipsULT[0205]可以将由扫描平台325生成的图像传送到图像分析系统300或图像分析系统300可可以获得生物样品的图像，其中样品可能已经被固定在载玻片上并被组织化学染色平台[0206]图像采集系统320还可以包括自动组织化学染色平台323，例如自动IHC/ISH载玻片染色器。自动IHC/ISH载玻片染色器通常至少包括：染色方案中使用的各种试剂的储液(或与执行此类辅助步骤的单独系统兼容)，包括：载玻片烘烤(用于将样品粘附到载玻片AutomatedImmunohistochemistry,ArchPatholLabMed.，第138卷，第1578–1582页(2014)(其全文以引用方式并入本文)描述了自动其各种特征，包括intelliPATH(BiocareMedical)、WAVE(CelerusDiagnostics)、DAKOOMNIS和DAKOAUTOSTAINERLINK48(AgilentTechnologies)、BENCHMARK(Ventana品的载玻片表面上(例如在DAKOAUTOSTAINERLink48(AgilentTechnologies)和品上的惰性流体层覆盖或分配(例如在VENTANABenchMark和DISCOVERY染色器上实现)；(3)毛细间隙染色，其中将载玻片表面放置在另一个表面(可能是另一个载玻片或盖板)附近，以形成一个狭窄的间隙，通过毛细作用力吸出并保持液体试剂与样品接触(例如DAKO相对平移以在孵育期间搅动试剂以实现试剂混合(诸如，在DAKOOMNIS染色器上实现的染的横向尺寸足以在载玻片上的液体中沿通常从第二间隙延伸到第一间隙的方向生成横向运动。参见WO2011-139978A1。最近建议使用喷墨技术将试剂沉积在载玻片上。参见WO何全自动或半自动系统整合到组织化学染色平台32玻片染色器直接将试剂应用到每个载玻片上，并且没有两个载玻片共享相同等份的试剂。可商购的H&E染色器的实例包括来自Roche的VENTANASYMPHONY(单个载玻片染色器)和VENTANAHE600(单个载玻片染色器)系列H&E染色器；来自AgilentTechnologies的CoverStainer(批量染色器)；来自LeicaBiosystemsNusslochGmbH的LeicaST4020SmallLinearStainer(批量染色器)、LeicaST5020Multistainer(批量染色器)、和LeicaST5010AutostainerXL系列(批量染色器)H&E染色器。H&E染色平台324通常用于需要生物标志物染色切片的形态学染色的连续切片的工[0208]评分系统可以进一步包括实验室信息系统(LIS)330。LIS330通常会进行选自以下的一项或多项功能：对样品以及在从样品衍生的载玻片和图像上进行的记录和跟踪过字母数字代码等)；和读取所述样品或载玻片上的标签和/或在LIS330与免疫环境评分系步骤从LIS330的数据库发送到图像分析系统，和/或通过图像分析系统300对图像进行的图像处理步骤记录在LIS330的数据库中。在本方法和系统中有用的可商购的LIS系统包[0210]I.使用5PlexIHC和全载玻片图像分析对关于患者错配修复状态和抗PD-1治疗结学(IHC)通过检测多个生物标志物及其在单个载玻片上的共表达，从而能够表征肿瘤微环中上调程序性死亡1(PD-1)途径及其配体程序性死亡配体1(PD-L1)可以使癌症逃避免疫监[0215]本研究可获得60个具有用于自动分析的可接受的图像和组织质量的治疗(抗PD-1531[0222]酪胺信号扩增的一般概念由US6,593,100描述。染色步骤与由Zhang的联合来生成panCK掩膜。然后在掩膜上进行后处理，以补偿通过以下方式浸润的淋巴细[0227](a)半径为10个像素的圆盘状结构元件(每像素的分辨率为0.325μms)进行形态学前沿远离肿瘤的距离为0.5mm的区域自动生是PD-L1+的CD3+细胞的分数；是PD-L1+的CD8邻的PD-L1+/panCK+的距离的描述性统计；CD8+细胞与其最近的毗邻的PD-L1+/CD3+的距离[0242]对特征进行ReliefF特征选择，以确定每个特征在根据抗PD-1治疗结果对病例进[0250]过去已经显示错配修复(MMR)缺陷以预测对抗PD-1治疗的应答。进行了一项仅针对错配修复缺陷病例的分析，目的是鉴定多重(Mpx)IHC数据是否可以识别出哪些MMR缺陷病的患者。表11显示了使用上皮和间质MpxIHC数据可以达到将PD+SD结果与PR+CR区分的21[0257]II.通过自动多重IHC定量图像分析探索PD-1/PD-L1的空间相互作用以预测胃肠生物标志物肿瘤突变负荷和错配修复(MMR)状态的当前临床实践是不充分的。对于研究和的空间排列和相互作用会影响患者的预后、存活以及对治疗的应答。多重免疫组织化学(IHC)组织染色可基于特定的肿瘤和免疫分子特征提供详细的[0261]本研究可获得50个具有用于自动分析的可接受的图像和组织质量的治疗(抗PD-134[0269]用ZeissAXIOZ1扫描仪扫描整个载玻片，病理学家在其上标注肿瘤区域。HaloLearningToolbox用于(a)从Halo输出的csv文件中的空间位置重建每种细胞类型的图；[0273]表15中的每个特征均针对每个图像进行了分析，并通过ReliefF和随机森林进行[0281]来自ReliefF和随机森林每一者排名的前15个特征的排名分别在图12和图13中说1[0287]图14A–14C示出了：(a)PD-L1+细胞的10μm半径内的空间方差#PD-1+细胞的预测[0288]图15示出了无应答者的示例性IHC图像，以及显示PD-L1+细胞的位置(灰色点)、[0290]有46例患者的子集的总存活(OS)数据可用。对表14中的每个变量进行了存活分panCK–细胞的数量除以panCK-阴性面积，(d)panCK阴性区域中Lag3阳性细胞的数量，(e)PD-1中/CD8+细胞的最大数量，以及(m)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的最大数量。对于每个特征指标，使用特征量度分布的中位数作为截止值，将队列分为两组。Kaplan-Meier存活曲线在图16A–[0298]在数字病理学系统中，病理学家或专业观察员会在查看软件中打开H&E载玻片的[0302]2.相同的低至中分辨率图像覆盖有轮廓[0305]5.每个高分辨率FOV都覆盖有标[0310]3.描述性统计数据描述了每个所关注的形态区域中不同表型的细胞的空间分布[0313]Barrera等人，Computer-extractedfeaturesrelatingtospatialarrangementoftumorinfiltratinglymphocytestopredictresponsetonivolumabinnon-smallcelllungcancer(NSCLC).ASCOAnnualMeeting2018:Abstract#:12115.[0315]Le等人，Mismatch-repairdeficiencypredictsresponseofsolidtumors[0316]Li&Tian,Developmentofsmall-moleculPD-1/PD-L1asanewtherapeuticstrategyfortumourimmunotherapy,J.ofDrugTargeting,DOI:10.1080/1061186X.2018.1440400[0317]NordicImmunohistochemicalQualityControl,CK-Panrun47(2016),参考/downloads/assessmen[0318]Topalian,SuzanneL.等人。"Safety,activity,andimmunecorrelatesofanti–PD-1antibodyincancer."NewEnglandJournalofMedicine366.26(2012):2443-2454.cancerusingcomputerextractednuclearfeaturesfromdigitalH&Eimages.,ScientificReports7.1(2017):13543.[0320]Woodcock-Mitchell等人。Immunolocalizationofkeratinpolypeptidesin[0321]Yi等人，BiomarkersforpredictingefficacyofPD-1/PD-L1inhibitors,[0322]Zhang等人。"Automated5-plexfluorescentimmunohistochemistrywithtyramidesignalamplificationusingantibodiesfromthesamespecies."[0323]Zhang等人。"Anautomated5-plexfluorescentimmunohistochemistryenabledcharacterizationofPD-L1expressionandtumorinfiltratingimmunecellsinlungandbladdercancerspecimens."CancerResearch2016,76