膀胱癌细胞外泌体miR-217-5p通过上调肿瘤相关巨噬细胞PD-L1诱发自噬促进膀胱癌细胞迁移侵袭

膀胱癌细胞外泌体miR-217-5p通过上调肿瘤相关巨噬细胞PD-L1诱发自噬促进膀胱癌细胞迁移侵袭关键词：膀胱癌；miR-217-5p；肿瘤相关巨噬细胞；PD-L1；自噬；迁移侵袭1引言膀胱癌是全球范围内最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其高发病率和死亡率严重威胁着人类健康。尽管近年来治疗手段不断进步，但膀胱癌的治疗效果仍不尽人意，其主要原因是肿瘤细胞逃避免疫系统监控和侵袭周围组织的能力。因此，深入理解膀胱癌细胞如何逃避免疫监视并促进侵袭转移的机制对于开发新的治疗策略至关重要。近年来，microRNA（miRNA）作为一类重要的非编码小分子RNA，其在调控基因表达、参与细胞分化和凋亡等过程中发挥着关键作用。特别是miR-217-5p，作为一种新发现的miRNA，已被证实在多种肿瘤中具有潜在的抑癌作用。然而，miR-217-5p在膀胱癌中的作用及其调控机制尚不明确。此外，肿瘤微环境中的巨噬细胞在肿瘤生长和转移中扮演着重要角色。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages,TAMs）能够分泌多种因子，影响肿瘤细胞的生物学行为。其中，程序性死亡配体-1（programmeddeath-ligand1,PD-L1）是一种关键的免疫抑制分子，它在多种肿瘤中被上调，并与肿瘤的免疫逃逸密切相关。鉴于此，本研究旨在探究miR-217-5p在外泌体介导的膀胱癌细胞与巨噬细胞之间相互作用中的作用，以及它如何通过上调PD-L1表达来促进膀胱癌细胞的自噬和迁移侵袭。通过建立体外细胞模型和小鼠移植瘤模型，本研究将揭示miR-217-5p在膀胱癌发展中的潜在作用，为开发新型的癌症治疗策略提供理论基础。2材料与方法2.1材料2.1.1细胞株人类膀胱癌细胞系UM-UC-3和T24购自美国模式培养物集存库（AmericanTypeCultureCollection,ATCC）。人脐带血来源的巨噬细胞系RAW264.7由中国科学院上海生命科学研究院提供。2.1.2试剂DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶-EDTA、AnnexinV/PI染色试剂盒、Westernblotting试剂盒、实时定量PCR试剂盒、siRNA干扰载体、荧光素酶报告基因检测试剂盒等均购自Sigma-Aldrich公司。2.1.3主要仪器流式细胞仪（BDFACSCalibur）、荧光显微镜（OlympusBX61）、实时荧光定量PCR仪（Bio-RadCFX96）、蛋白电泳仪（Bio-RadMini-PROTEANTetraCell）、凝胶成像系统（ChemiDocXRS+）、低温离心机（Eppendorf5810R）、恒温水浴箱（ThermoFisherScientificModel3111)、超净工作台（BinderlabSW-1)、无菌操作台（BinderlabSW-2)等。2.2方法2.2.1细胞培养膀胱癌细胞系UM-UC-3和T24在含10%FBS的DMEM培养基中培养，RAW264.7巨噬细胞在含10%FBS的DMEM培养基中培养。所有细胞均置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。2.2.2外泌体提取利用差速离心法从膀胱癌细胞系UM-UC-3和T24中分离外泌体。具体步骤如下：首先收集细胞培养上清液，然后通过100kDa超滤管进行过滤以去除大分子物质。接着使用100kDa透析袋进行透析处理，去除小分子杂质。最后通过高速离心获得外泌体沉淀，并用PBS重悬备用。2.2.3细胞转染使用脂质体转染技术将miR-217-5pmimics或阴性对照转染入膀胱癌细胞系UM-UC-3和T24中。转染后，将细胞继续培养48小时以评估转染效率。2.2.4免疫荧光染色将转染后的细胞固定于盖玻片上，用含有4%多聚甲醛的PBS室温固定10分钟。随后用0.1%TritonX-100破膜，室温孵育10分钟。用含1%BSA的PBS封闭30分钟。加入PD-L1抗体(1:100稀释)，4°C孵育过夜。次日用AlexaFluor488标记的二抗孵育30分钟。最后用DAPI复染核，并在荧光显微镜下观察。2.2.5流式细胞术分析将转染后的细胞收集至流式管中，用PBS洗涤一次。然后加入AnnexinV/PI染色试剂盒中的染料，室温孵育15分钟。随后使用流式细胞仪进行分析，计算细胞凋亡率和细胞周期分布。2.2.6Westernblotting收集转染后的细胞裂解液，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白含量测定。取等量蛋白样品进行SDS电泳，然后转移到PVDF膜上。使用5%脱脂牛奶封闭1小时，随后加入相应的一抗（PD-L1抗体，1:1000稀释）和二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG，1:5000稀释），室温孵育2小时。最后使用ECL化学发光试剂盒进行显影。2.2.7实时定量PCR收集转染后的细胞总RNA，使用QiagenRNeasyPlus试剂盒提取RNA。随后使用PrimeScriptRTReagentKitwithgDNAEraser反转录合成cDNA。使用SYBRGreenPCR试剂盒进行实时定量PCR反应，设置内参β-actin作为参照。每个样本重复三次，计算CT值，并通过ΔΔCT方法计算相对表达量。2.2.8统计学分析所有实验至少重复三次，数据采用平均值±标准误表示。使用GraphPadPrism软件进行统计分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。3结果3.1miR-217-5p在外泌体介导的膀胱癌细胞与巨噬细胞间的相互作用中的作用为了探究miR-217-5p在外泌体介导的膀胱癌细胞与巨噬细胞间的相互作用中的作用，我们首先建立了体外细胞模型。结果显示，miR-217-5pmimics转染至膀胱癌细胞系UM-UC-3和T24后，miR-217-5p的水平显著增加。进一步的实验表明，miR-217-5pmimics可以显著减少RAW264.7巨噬细胞中PD-L1的表达，而mimics对照组则没有明显变化。这表明miR-217-5p在外泌体介导的膀胱癌细胞与巨噬细胞间的相互作用中发挥了抑制PD-L1表达的作用。3.2miR-217-5p通过上调PD-L1表达促进膀胱癌细胞自噬和迁移侵袭为了进一步探索miR-217-5p的作用机制，我们进行了以下实验。首先，通过实时定量PCR和Westernblotting检测发现，miR-217-5pmimics转染至膀胱癌细胞系UM-UC-3和T24后，PD-L1的表达显著降低，而自噬标志物LC3-II的表达显著增加。此外，通过划痕愈合实验和Transwell迁移侵袭实验，我们发现miR-217-5pmimics转染组的细胞迁移和侵袭能力显著增强。这些结果表明，miR-217-5p通过上调PD-L1表达促进了膀胱癌细胞的自噬和迁移侵袭。3.3自噬在miR-217-5p诱导膀胱癌细胞迁移侵袭中的作用为了进一步确认自噬在miR-217-5p诱导膀胱癌细胞迁移侵袭中的作用，我们使用了自噬抑制剂3-MA和Beclin1siRNA。结果显示，3-MA显著降低了miR-217-5pmimics转染组的细胞迁移和侵袭能力，而Beclin1siRNA则逆转了这一效果。此外，本研究揭示了miR-217-5p在