CN113122592B 一种淀粉或其衍生物的酶法催化利用方法 （中国科学院天津工业生物技术研究所）

本发明公开了一种淀粉或其衍生物的酶法通过体外多酶分子机器将底物高效转化为高附210000U/mL；阝-葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-10000U/mL；聚磷酸(5b)加入磷酸葡萄糖异构酶(EC5.3.1.9)，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶(EC(5c)加入磷酸葡萄糖异构酶(EC5.3.1.9)，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(EC314.根据权利要求13所述的方法，所述反应的反应体系中，所述缓冲液的pH为4.0-兰酶(EC3.2.1.41)中的任意和/或，所述淀粉去分支酶的用量为以反应体系的总体积计，去分支酶的浓度为0.1-4化酶(glycogenphosphorylase,ECZhangYH.2016.One-PotBiosynthesisofHigh-Concentrationalpha-Glucose1-PhosphatefromStarchbySequentialAdditionofThreeHyperthermophilicEnzymes.JAgricFoodChem64(8):1777-83.)。提高转化率的方法包括在反应后期偶联[0004]本发明提供了一种淀粉和/或淀粉衍生物的利用方法，所述方法包括如下反应步[0010]在一个实施方案中，所述方法包括建立以淀粉和/或淀粉衍生物为底物的多酶反5应体系的总体积计，所述底物的浓度为1-800g/L，例如20-200g/L；聚磷酸盐的浓度为1-者[0021](5e)加入焦磷酸盐，以及磷酸葡萄糖异构酶(Phosphoglucoseisomerase，EC6支酶的用量为以反应体系的总体积计，去分支酶的浓度为0.1-10000U/mL，例如1-1000U/[0030]作为一个具体实施方案，本发明提供一种体外多酶催化淀粉和/或淀粉衍生物制葡萄糖磷酸变位酶(阝-phosphoglucomutase，EC5.4.2.6)，聚磷酸葡萄糖激酶萄糖激酶的用量为2U/mL，肌醇1-磷酸合成酶的用量为2U/mL，肌醇单磷酸酶的用量为2U/7[0035]上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，无机磷，镁盐。无机磷的浓度为5-[0036]作为一个具体实施方案，本发明提供一种体外多酶催化淀粉和/或淀粉衍生物制(polyphosphateglucokinase，EC2.7.1.63)，磷酸葡萄糖异构酶(Phosphoglucoseisomerase，EC5.3.1.9)，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶(tagatose6-phosphate4-萄糖异构酶的用量为0.1-10000U/mL，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶的用量为0.1-10000U/[0042]上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，无机磷，镁盐。无机磷的浓度为5-[0043]作为一个具体实施方案，本发明提供一种体外多酶催化淀粉和/或淀粉衍生物制葡萄糖磷酸变位酶(阝-phosphoglucomutase，EC5.4.2.6)，聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase，EC2.7.1.63)，磷酸葡萄糖异构酶(Phosphoglucose8[0049]上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，无机磷，镁盐。无机磷的浓度为5-[0050]作为一个具体实施方案，本发明提供一种体外多酶催化淀粉和/或淀粉衍生物制葡萄糖磷酸变位酶(阝-phosphoglucomutase，EC5.4.2.6)，聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase，EC2.7.1.63)，磷酸葡萄糖异构酶(Phosphoglucose[0053]本发明所述磷酸葡萄糖异构酶和甘露糖6-磷酸异构酶可被同时具有磷酸葡萄糖异构酶和甘露糖6-磷酸异构酶活性的双功能酶(phosphoglucose/phosphomannose糖6-磷酸磷酸酶的用量为0.1-10000U/[0057]上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，无机磷，镁盐。无机磷的浓度为5-9[0058]作为一个具体实施方案，本发明提供一种体外多酶催化淀粉和/或淀粉衍生物制(polyphosphateglucokinase，EC2.7.1.63)，磷酸葡萄糖异构酶(Phosphoglucoseisomerase，EC5.3.1.9)和焦磷酸依赖型磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，EC[0063]上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液、无机磷、镁盐。无机磷的浓度为5-Bacillussp.RK-1、Lactobacillusacidophilus、Paenibacillussp.SH-55、不限于Pyrococcussp.strainST04、PyrococcushorikoshiiOT3、Thermococcus括但不限于Thermobifidafusca、Corynebacteriumglutamicum、Propionibacterium造获得的具有同等功能的突变酶。所述磷酸葡萄糖异构酶的来源包括但不限于Thermusthermophilus、Pyrococcusfuriosus、Clostridiumthermocellum等。优选为来源于Thermusthermophilus的磷程改造获得的具有同等功能的突变酶。所述肌醇1-磷酸合成酶的来源包括但不限于优选为来源于Archaeoglobusfulgidus的肌醇1得的具有同等功能的突变酶。所述肌醇单磷酸酶的来源包括但不限于ThermotogamaritimaMSB8、Escherichiacoli、Mycobacteriumsmegmatis等。优选为来源于ThermotogamaritimaMSB8的肌醇单[0071]本发明所述塔格糖6-磷酸4-差向异构酶(tagatose6-phosphate4-epimerase，构酶的来源包括但不限于AgrobacteriumtumefaciensC58、Dictyoglomusthermophilum、Thermoanaerobacterindiensis等。优选为来源于Thermoanaerobacter[0072]本发明所述阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(D-allulose6-phosphate3-3-差向异构酶的来源包括但不限于Escherichiacoli、ThermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumDSM571等。优选为来源于ThermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumDSM571[0073]本发明所述甘露糖6-磷酸异构酶(mannose6-phosphateisomerase，EC优选为来源于Thermusthermophilu[0074]本发明所述磷酸葡萄糖异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶双功能酶(phosphoglucose/能的突变酶。所述磷酸葡萄糖异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶双功能酶的来源包括但不限于可以为任意一种具有将果糖6-磷酸和焦磷酸生成果糖1,6-二磷酸和无机磷功能的酶所替果糖激酶的来源包括但不限于Thermotogamaritima、Dictyoglomusthermophilum、酶、甘露糖6-磷酸专一性磷酸酶中的一种。当以阿洛酮糖6-磷酸为底物时，优选来源于Acidothermuscellulolyticus、Escherichiacoli、Clostridiumthermocellum、BacteroidesfragilisNCTC9343的阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶，其蛋白编号一一对应为白编号一一对应为TM0651(KEGG)、PP_1764(KEGG)、PSPPH_2719。更优选为蛋白编号为TM0651(KEGG)对应的甘露糖6-磷酸磷酸酶。当以塔格糖6-磷酸为底物时，优选来源于amylase，EC3.2.1.2)降解淀粉至麦芽糖；随后麦芽糖在麦芽糖磷酸化酶(maltose葡萄糖6-磷酸，而葡萄糖在聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase，EC[0081]图4为酶法催化淀粉制备阿洛酮糖催化路径图；A6PE，D-allulose6-phosphate3-epimerase，D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶；A6PP，allulose6-phosphate还原端开始，以麦芽糖为单位依次水解α-1,4糖苷键；(2)麦芽糖磷酸化酶(maltose为P36924(Uniprot)；麦芽糖磷酸化酶来源于Bacillussp.RK-1，其蛋白编号分别为为PH0749(KEGG)；聚磷酸葡萄糖激酶来源于ThermobifidafuscaYX，其蛋白编号为Tfu_1811。这些基因通过基因合成获得，克隆至pET载体上，分别获得相应表达质粒pET20b-[0088]在一个1.0mL的反应体系中含有20g/L麦芽糊精(DE4-7)，20mM磷酸钠缓冲液应，反应时间为24个小时。葡萄糖6-磷酸的浓度采用葡萄糖6-磷酸测定试剂盒(Sigma-[0091]通过体外多酶催化体系将淀粉和聚磷酸转化为肌醇的催化途径见图2。该途径中芽糖为单位依次水解α-1,4糖苷；(2)麦芽糖磷酸化酶(maltosephosphorylase，EC酸生成D-葡萄糖6-磷酸；(5)肌醇1-磷酸合成酶(inositol1-phophatesynthase，EC5.5.1.4)，催化D-葡萄糖6-磷酸生成肌醇1-磷酸；(6)肌醇单磷酸酶(inositol为AF_1794(KEGG)；肌醇单磷酸酶来源于Thermotogamaritima，其蛋白编号为TM1415[0093]利用淀粉为底物一锅法制备肌醇：在一个1.0mL的反应体系中含有20g/L玉米淀[0096]通过体外多酶催化体系将麦芽糊精和聚磷酸转化为塔格糖的催化途径见图3。该聚磷酸生成D-葡萄糖6-磷酸；(5)磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoseisomerase，EC蛋白编号为WP_019907213.1(Genebank)；塔格糖6-磷酸磷酸酶来源于Archaeoglobus[0101]通过体外多酶催化体系将淀粉和聚磷酸转化为阿洛酮糖的催化途径见图4。该途酸生成D-葡萄糖6-磷酸；(5)磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoseisomerase，EC5.3.1.9)，催化葡萄糖6-磷酸转化为果糖6-磷酸；(6)阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(D-[0102]在本实施例中，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶来源于ThermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumDSM571，其蛋白编号为Tthe_1731(KEGG)；磷酸酶来源于[0106]通过体外多酶催化体系将淀粉和聚磷酸转化为甘露糖的催化途径见图5。该途径麦芽糖为单位依次水解α-1,4糖苷键；(2)麦芽糖磷酸化酶(maltosephosphorylase，EC酸生成D-葡萄糖6-磷酸；(5)磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoseisomerase，EC[0111]通过体外多酶催化体系将淀粉和聚磷酸转化为果糖1,6-二磷酸的催化途径见图催化D-葡萄糖和聚磷酸生成D-葡萄糖6-磷酸；(5)磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose[0113