高中生物竞赛课件生物化学DNA的合成

DNA的复制和修复1本章内容DNA的复制1DNA的损伤和修复22DNA的生物合成DNA的半保留复制DNA复制的起始点和方向原核细胞DNA的复制真核细胞DNA的复制反转录作用DNA的损伤和修复细菌的限制修饰系统3一、DNA的半保留复制（一）概念

指以亲代DNA分子为模板，按照碱基配对的方式合成出子代DNA分子的过程。每个子代分子的一条链来自亲代DNA分子，另一条链是新合成的，这种复制方式称为～。复制：指以亲代DNA分子为模板合成出子代DNA分子的过程。转录：以DNA分子为模板合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程。逆转录：以RNA为模板将遗传信息传给DNA的过程。4(二)半保留复制假说的提出：

1953年，Watson&Crick在DNA双螺旋基础上（碱基配对原则）提出。1.DNA复制的假设：有3种可能：

1）全保留式；

2）半保留式；

3）混合式。52.实验依据

1958年Meselson和Stahl首次用实验证明了DNA的半保留复制。由此证实了DNA复制时，亲代分子分为两条链，分别构成子代分子的一半，且经过多代仍保持完整性。6他们先使大肠杆菌在以N15的NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长，使其DNA全部变成N15的DNA。然后将细菌转入含N14的NH4Cl普通培养基，并将各代的细菌DNA抽提出来进行CsCL密度梯度离心。由于N15比N14DNA的密度大，离心时就形成位置不同的区带。他们发现在N15培养基上生长的细菌只形成一条N15的DNA区带，移至N14培养基上经过一代后，所以的ＤＮＡ的嘧啶在Ｎ１４和Ｎ１５之间，说明形成了半Ｎ１５和一半Ｎ１４的杂交分子，第三代以后Ｎ１４ＤＮＡ成比例的增加。亲代分子分为二个亚单位（两条链），分别构成子代分子的一半，且经过多代仍保持完整性。73.意义：1）半保留复制保证了遗传的稳定性；2）DNA是处于不断变异和发展之中。ＤＮＡ复制8二、DNA复制的起点和方向1、实验：用3H标记的dT，得到含3H的DNA；放射自显影或者电镜观察。2、推测：若放射性在两端——双向；若在一端——单向。

9DNA的复制开始于染色体上固定的起始点。起始点是含有100-200个碱基对的一段DNA。显示ＤＮＡ的两条链在起始点形成叉子样的复制叉，随着复制叉的移动完成ＤＮＡ的复制过程，说明ＤＮＡ复制可以朝一个方向，也可以朝两个相反的方向进行。10３实验证明：细菌染色体DNA复制大多是一个起点，双向复制。11（一）复制起点：原核生物：

1个起点；

真核生物：

多个起点。12大肠杆菌DNA是一个复制子基因组能独立进行复制的单位称~，含起点。13果蝇DNA复制具有多复制起点在真核生物染色体的不同位置上有多个起始点，如果蝇染色体为30000个碱基对，有2000-3000个复制起始位点。复制叉数目很大，复制总速度比原核生物快。果蝇胚胎ＤＮＡ３ｍｉｎ复制一代，而基因组总长只有果蝇１／４０的大肠杆菌染色体复制一代却需要４０ｍｉｎ。14（二）方向：多为双向

15DNA链的合成方向是：5’→3’模板链的解读方向是：3’→5’16（三）复制叉（replicationfork)：

DNA复制是边解链边复制，复制中的DNA在复制点呈分叉状，将分叉点称~。17（四）DNA复制的方式1、

直线双向复制单点双向，T7噬菌体多点双向，真核染色体DNA细菌为环状DNA复制起始于单个位点，每个复制泡包括2个复制叉。方向：5’→3’。182、θ型复制环状DNA的复制叉呈θ结构：环状双链DNA，对称复制，单向或双向（E.coli）19203、滚环复制环状单链DNA，Φx174214、D环复制(取代环复制)不对称复制：线粒体、叶绿体DNA。两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。225、多复制叉复制第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。23DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定，DNA复制的速率实际上取决于起始频率。E.coli复制叉移动的速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟[4.2×106/（50Kb×2）=42]。富营养时，可采取多复制叉复制方式，20min复制一代。真核复制叉前进的速率约1000-3000bp/min，采用多复制子方式，真核染色体复制一代要6-8小时。

24三、原核生物DNA的复制（DNA指导的DNA合成）（一）大肠杆菌的DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)：催化dATP、dGTP、dCTP、dTTP聚合成新的3’，5’磷酸磷酸二酯键；有外切酶活性。25ＤＮＡ复制过程最基本的酶促反应是四种脱氧核苷酸的聚合反应。1956年Kornberg等首次从大肠杆菌中分离出催化此反应的DNA聚合酶。他们将大肠杆菌提取液与P32标记的dNTP混合物一块温育，发现少量新合成的DNA的磷酸根上有p32标记，催化这个反应的酶是DNA聚合酶I，现已高度纯化。它是相对分子量为109KDa的一条肽链。261、E.COLiDNA聚合酶Ⅰ1）需要原料：4种dNTP作为底物；解开的DNA双链为模板；与模板互补的引物（DNAorRNA，要求有游离的3’-OH）；Mg2+；酶活性部位含有紧密结合的Zn2+

；272）DNA聚合酶Ⅰ功能：催化dNTP加到DNA链的3’-OH末端（方向5’→3’）。3’端外切酶活性，可起校对作用；5’端外切酶活性，可切除引物、嘧啶二聚体；28脱氧核苷酸逐个加到引物的３‘端，是按照Ｗａｔｅｒｓｏｎ和Ｃｒｉｃｋ的碱基配对的原则，党模板上出现一个A时，新链就叫上一个脱氧的T。新的研究表明，DNA聚合酶不仅能催化DNA链的延长，还能从DNA的3’或者5‘末端按照3’-5‘或者5’-3‘的方向把DNA链逐步切断。29302、DNA聚合酶Ⅱ:反应需Mg2+

、NH4

+

；以带缺口(gap)的dsDNA为模板，反应同酶Ⅰ；具3’→5’外切酶活性；活力较低。3、DNA聚合酶Ⅲ：活力较强，主要负责DNA链的延伸；具3’→5’外切酶活性；311969年发行一个大肠杆菌的变异株DNA聚合酶I活力很低，但是仍能以正常的速度合成DNA，因此怀疑存在其他的DNA聚合酶，70年代分离出了DNA聚合酶II和III。DNA聚合酶Ⅲ活力是I的15倍，II的300倍。32DNA聚合酶III450KDa，主要成分是分子量为140KDa的a链，b亚基的功能是识别引物并使DNA母链与引物链结合。33450KDa，主要成分是分子量为140KDa的a链，b亚基的功能是识别引物并使DNA母链与引物链结合。一旦全酶结合在正确的起始位置上，DNA聚合酶III辅酶就以游离的形式释放，随后DNA聚合酶III复合物催化子代DNA链的延伸。34354、DNA聚合酶的校对作用：依赖于3个DNA聚合酶的3’末端外切酶活性，进行校对和纠错。多种蛋白质参与，从而保证了复制的准确性。36E.COLi的DNA聚合酶

ⅠⅡⅢ5’→3’聚合作用+++5’→3’外切酶作用+－－3’→5’外切酶作用+++聚合核苷酸数/min600309000分子数/细胞40010010主要功能切除引物修复复制修复37下列有关DNA聚合酶Ⅱ的论述，哪一项是错误的？A是复制酶；B有5′—3′聚合活性；C有3′—5′外切酶活性；D有5′—3′外切酶活性。下列有关DNA聚合酶Ⅰ的论述，哪一项是错误的？A是复制酶又是修复酶；B有5′—3′聚合活性；C有3′—5′外切酶活性；D没有5′—3′外切酶活性。大多数染色体DNA的复制是A单向的；B单向的和双向的；C双向的；D单向或双向。38(二）大肠杆菌DNA连接酶（ligase）：1、作用：

催化相邻的二个DNA片段间的连接；2、条件：

①两片段相邻；②两片段需与同一互补链结合;③反应耗能。39连接酶作用机理40（三）双链DNA的半不连续复制机制1、冈崎片段和半不连续复制①问题的提出：已知DNA两条链反向且都能作为模板；已知DNApol聚合方向只能是5’→3’；冈崎等提出DNA的不连续复制模型，认为：新合成3’→5’走向的DNA是由许多5’→3’方向合成的DNA片段连接而成的。41②实验：放射自显影；电子显微镜观察。冈崎片段：以

5’→3’走向DNA为模板合成小的DNA片段，约1000-2000核苷酸。1968年冈崎等用H3标记的dTTP掺入噬菌体去感染大肠杆菌，发现段时间内首先合成较短的DNA片段，接着出现较大的分子。42③结论：DNA是半不连续合成的。前导链（leadingstrand):

以3’→5’链为模板，新生链以5’→3’方向连续合成；后随链(laggingstrand):

以5’→3’链为模板，新生链以5’→3’方向合成若干短片段（冈崎片段），再通过连接酶连接成DNA链，为后随链。4344下列有关DNA复制的论述，哪一项是正确的？ADNA复制是全保留复制；B新链合成的方向与复制叉前进方向相反者，称前导链C新链合成的方向与复制叉前进方向相同者，称前导链；D前导链是不连续合成；E滞后链是连续合成。452、RNA引物①问题提出：已知DNApol只能在3’-OH上延伸，由谁提供了3’-OH？②实验证明：新合成的DNA链中有RNA，证明DNA聚合酶合成新DNA时需要引物（一小段RNA）。在多瘤病毒体外系统中合成冈崎片段5‘端是一个约10个核苷酸长的RNA。46③RNA引物酶（RNAprimase)：引物酶与多种起始蛋白结合形成引物体；功能：催化引物合成：

在DNA一定部位合成，并与其互补，合成方向5’→3’；参与解链。引物RNA3’-OH末端作为DNA合成的起始点。RNA引物合成的过程称作引发。实验证据证明DNA复制的引发需要一种称作引物体的RNA合成系统。47④RNA引物（RNAprimer)引物酶合成的引物为十几个核苷酸的RNA。冈崎片段引物的合成不需要特异的起始部位。33引物酶沿模板链向分叉的方向前进，并断断续续的催化合成后随链的引物RNA短链。48⑤后随链合成过程：引物酶以DNA为模板，合成后随链引物。DNApolⅢ在引物上延伸（前导链和后随链）。完成DNA合成后，DNApolⅠ用其5’→3’外切酶活性除去引物。DNA连接酶将两个冈崎片段连接起来。493、滞后链生成包括：起始：RNA引物的合成；延长：从引物3’端添加dNTP，合成DNA;终止：切除RNA引物，连接各片段。504、与母本DNA双链分离相关的酶：1）DNA解链酶(DNAhelicase)：

使复制叉前方DNA双链解开，每解1个bp需耗2个ATP。2）单链结合蛋白

（SingleStrandBindingprotein,SSB）：几分子的SSB与已分开的DNA链紧密结合，以防两链重新结合。

此时，复制酶系统结合在模板链上，进行半不连续复制。513）DNA旋转酶

（拓扑异构酶Ⅱ，topoisomerase)：复制前：松弛DNA超螺旋，解除拓扑张力复制后：重新引入超螺旋（需ATP供能）

。

52（四）总结——原核细胞DNA的复制过程：1、合成所需材料：①模板DNA②原料：合成引物所需的NTP，合成DNA所需的dNTP；③酶和pr。2、合成方向：5’→3’；模板链解读方向：3’→5’533、合成步骤：识别起点：由DNA指导的引物酶等多种pr完成；解旋：由拓扑异构酶Ⅱ解除超螺旋；解链：由DNA解链酶催化解开一短链，SSB与单链DNA结合，防止双链间氢键再形成；RNA引物合成：以DNA为模板，在引物酶催化下由DNA转录生成5-10个核苷酸链；54DNA链延长：在引物3’-OH基上，按碱基互补原则经DNA聚合酶（主要是酶Ⅲ）催化DNA链从5’→3’延伸。

前导链为连续的；后滞链为不连续的冈崎片段。

切除引物，补齐缺口：由DNA聚合酶Ⅰ催化，切去RNA引物；按碱基互补原则，沿5’→3’方向，补齐缺口。55连接切口(nick)：由DNA连接酶催化，将补齐缺口的3’-OH基与下一个冈崎片段的5’-P以磷酸二酯键连接起来（消耗NAD+），最终形成完整的、与模板互补的DNA新链。校正并修复DNA：由DNA聚合酶校正并切除错配，再按5’→3’方向加上正确核苷酸。终止：相当于两个复制叉的中点处。至此，原核细胞DNA合成完毕。56模板DNA前导链模板解旋酶引物后滞链模板DNpolymerase连接酶冈崎片段已连接的冈崎片段单链结合蛋白新合成的前导链DNA聚合酶57原核生物复制时，主要起聚合作用的酶是A、DNA聚合酶ⅠB、DNA聚合酶аC、DNA聚合酶ⅡD、DNA聚合酶ⅢDNA连接酶的作用是A、合成RNA引物B、将双螺旋解链C、去除引物，天补空隙D、使双连DNA缺口的两个末端连接起来58DNA拓扑异构酶的作用是A、辨认复制的起始点B、稳定复制叉

C、解开DNA双连作模板D、断开DNA,使复制旋转时不致缠绕打结。关于引物酶的描述，下列正确的是A、不需要DNA为模板B、以dNTP为底物C、合成方向是3′-5′D、其产物是带-OH的RNA片段复制中的RNA引物A、解开DNA双连B、使DNA聚合酶Ⅲ活化C、提供5′-P合成DNA链D、提供3′-OH合成DNA链59DNA复制时需要①DNA聚合酶Ⅲ，②解链酶，③DNA聚合酶Ⅰ，④引物酶，⑤连接酶，其作用顺序是

A、④③①②⑤B、②③④①⑤C、②④①③⑤D、①②③④⑤60三、真核细胞DNA的复制真核生物与原核类似，但更复杂，不同之处：（一）DNA模板上有多个起点，即真核细胞DNA复制由多个复制子共同完成的。61（二）有5种DNA聚合酶，各具功能；引物合成、核苷酸链聚合：α；核DNA的复制、校正：δ；线粒体DNA的复制：

γ修复DNA：

β、ε；真核生物中至少有5种DNA聚合酶，分别命名为α、β、γ、δ和ε。δ具有3‘-5’核酸外切酶的活性。62（三）端粒（telomere)的复制：1、端粒：真核生物线形染色体末端具有的特殊结构，由成串的重复序列组成，富含G的核苷酸序列。

端粒的功能：稳定染色体末端结构；防止染色体间末端连接；补偿5’末端切除引物形成的空缺。632、端粒酶（telomerase)：一种含RNA链的逆转录酶，以所含RNA链（约150b）为模板来合成DNA端粒。功能：1）起模板作用（与端粒互补）；

2）有逆转录酶的作用。端粒酶是一种核糖核蛋白，它是由RNA和蛋白质两种成分组成。643、端粒复制模型:1）借RNA与3’末端ssDNA互补；2）以酶上RNA为模板,使DNA链延伸，合成多个重复单位；3）端粒酶RNA反折作为引物，由DNA聚合酶α合成互补链。由此染色体保持大致相同的长度。654、端粒、端粒酶意义与细胞衰老、凋亡有关；

正常：生殖细胞由于有端粒酶而保持端粒的一定长度；

体细胞端粒酶活性丧失，端粒短到一定程度引起细胞凋亡。

异常：肿瘤细胞端粒酶活性恢复，端粒复制，细胞恶性增殖。意义：抑制端粒酶活性可防治肿瘤。66四、反转录作用：RNA指导的DNA合成1、反转录（逆转录reverstranscription）：

以RNA为模板，4种dNTP为底物，合成与模板互补的DNA的过程。这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称~。发生部位：宿主细胞质672、反转录酶：RNA指导的DNA聚合酶，催化逆转录反应的酶。功能:1）以RNA为模板合成DNA;2）RNase活性，水解杂合链中的RNA；3）以DNA为模板合成DNA。病毒反转录酶作用时需要引物，生成的DNA链的方向是5’-3‘，含Zn2+。68HIV的复制693、反转录作用的生物学意义：1）发展了中心法则；702）有助于对RNA病毒致癌机理的了解；3）有助于研究疾病的起因、寻找防治途径；4）反转录病毒可改建成理想的信息载体，用于肿瘤和遗传病的基因治疗；5）用于分子生物学的研究：合成基因、测序。71五、DNA的损伤与修复一、DNA的损伤：

一些生物因素、理化因素：UV（紫外线）、电离辐射和化学诱变剂可使细胞DNA受到损伤而引起生物突变或致死。一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。UV造成的基因改变嘧啶二聚体的形成72

引起DNA损伤的化学及物理因素5573化学诱变因素:烷化剂：是亲电试剂，能与亲核中心反应，特别是与鸟嘌呤N7原子作用。烷化剂有二甲基硫酸，甲基甲烷磺酸，N－甲基－N’－硝基－N－亚硝基胍等。亚硝酸：腺嘌呤、胞嘧啶经亚硝酸氧化脱氨形成次黄嘌呤和尿嘧啶（这些碱基也能自发脱氨）。嵌入剂：吖啶类染料，如原黄素、溴乙锭。它们是一类平面分子，能插DNA双螺旋堆积的碱基之间。物理诱变因素：电离辐射(x射线、αβ

射线):打断嘌呤咪唑环产生甲酰胺基咪唑环;造成碱基缺失或修饰。UV辐射:DNA经紫外照射，同一条链上相邻两个嘧啶碱基之间交联形成嘧啶二聚体。诱变剂和致癌剂的检测：BruceAmes设计了简易检测方法——Amestest。采用鼠伤寒沙门氏杆菌的His营养缺陷型,菌与待测物置于不含His的培养基中培养。若待测物具有诱变作用，可使缺陷型发生突变恢复His合成能力而产生菌落。74二、