26年非霍奇金淋巴瘤NGS质控手册

26年非霍奇金淋巴瘤NGS质控手册演讲人2026-04-29

引言：从临床需求到质控体系的必然选择01质控体系的持续改进与临床价值体现02总结与展望03目录

各位同道，大家好。我是从事淋巴瘤分子诊断与质控工作28年的老从业者，从1998年接触第一代淋巴瘤分子分型技术开始，亲眼见证了非霍奇金淋巴瘤（NHL）检测从免疫组化、PCR单基因检测，到如今下一代测序（NGS）技术普及的全过程。而今天我要分享的《26年非霍奇金淋巴瘤NGS质控手册》，正是我们行业从“摸着石头过河”到建立标准化体系的集体智慧结晶，也是我这20多年来最珍视的工作成果之一。01ONE引言：从临床需求到质控体系的必然选择

1我的从业起点与26年质控手册的渊源1998年我刚进入北京某三甲医院病理科分子实验室时，国内NHL的分型诊断还主要依赖形态学和免疫组化，分子检测仅能开展BCR-ABL、IgH重排等少数项目。当时我们接到的第一例疑难病例是一例复发的弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），患者化疗后复发，但免疫组化结果提示双表达亚型，却无法明确是否存在靶向治疗相关的分子变异。我们用当时仅有的PCR技术检测了MYD88和CD79B，但结果模棱两可——后来才发现，是因为核酸降解和实验室没有建立质控流程导致的假阴性。这件事让我深刻意识到，没有规范质控的分子检测，不仅无法为临床提供有效信息，甚至可能误导治疗。从那之后，我和国内一批同行开始尝试建立NHL分子检测的质控标准。2000年，我们牵头制定了国内第一版淋巴瘤PCR检测质控细则，而经过26年的迭代更新，最终形成了现在这套覆盖NGS全流程的质控手册。可以说，这本手册的每一页都写着我们这些从业者的临床困惑、失败教训和成功经验。

2非霍奇金淋巴瘤NGS检测的临床刚需非霍奇金淋巴瘤是一组高度异质性的血液系统恶性肿瘤，不同亚型的治疗方案和预后差异极大。比如同样是DLBCL，GCB亚型和ABC亚型的治疗响应率相差近30%，而通过NGS检测可以识别MYC、BCL2、BCL6的双打击/三打击变异，指导高强度化疗方案的选择；再比如边缘区淋巴瘤患者中存在的NOTCH2、KMT2D变异，也是靶向药物治疗的重要靶点。但NGS检测流程复杂，从样本采集、核酸提取、文库构建、测序到数据分析，任何一个环节出现偏差都会影响结果的准确性。据2022年全国室间质评数据显示，仍有近15%的实验室在NHLNGS检测中出现假阳性或假阴性结果，其中超过80%的问题源于未严格执行质控流程。因此，建立一套针对NHL的专属NGS质控手册，是保障临床诊疗精准性的核心前提。

2非霍奇金淋巴瘤NGS检测的临床刚需26年非霍奇金淋巴瘤NGS质控体系的发展脉络2.1萌芽期（1998-2008年）：经验驱动的质控探索这十年是国内淋巴瘤分子检测的起步阶段，当时没有统一的行业标准，每个实验室都在摸索自己的流程。我记得2003年我们参与全国首届淋巴瘤分子检测研讨会时，参会的32家实验室中，只有11家能稳定开展IgH重排检测，且不同实验室的结果一致性仅为67%。当时我们发现，问题主要出在样本保存和核酸提取环节：有的实验室用室温保存淋巴结标本超过24小时，导致RNA降解；有的实验室未对核酸浓度和纯度进行质控，直接进入后续实验。这一阶段的质控完全依赖经验，我们通过反复比对不同实验室的结果，总结出了“样本采集4小时内处理”“核酸OD260/OD280比值需在1.8-2.0之间”等初步的质控指标。2006年，我们牵头制定了《国内淋巴瘤PCR检测质控指南》，这也是26年质控手册的雏形。

2非霍奇金淋巴瘤NGS检测的临床刚需26年非霍奇金淋巴瘤NGS质控体系的发展脉络2.2成长期（2009-2018年）：标准化体系的初步建立2009年二代测序技术开始引入国内，我们团队率先在淋巴瘤检测中开展了靶向NGS测序。但当时的NGS流程远比PCR复杂，质控节点从2-3个增加到了10余个。2012年，我们承接了国家卫健委临床检验中心的淋巴瘤NGS室间质评项目，首批有47家实验室参与，结果显示，超过30%的实验室在文库构建环节出现插入片段异常，导致测序数据质量下降。为了解决这些问题，我们在2015年对初稿进行了第一次修订，新增了文库质控、测序数据质控等章节，明确了“文库浓度需≥1nM”“Q30占比需≥90%”等量化指标。同时，我们开始推广室内质控品的使用，要求每个实验室每月使用阳性对照品和阴性对照品进行内部质量控制。这一阶段，我们的质控体系从“经验总结”转向了“标准化流程”，实验室间的结果一致性提升到了92%。

2非霍奇金淋巴瘤NGS检测的临床刚需26年非霍奇金淋巴瘤NGS质控体系的发展脉络2.3成熟期（2019年至今）：同质化与全流程质控的落地2019年之后，NGS技术在国内淋巴瘤领域全面普及，越来越多的基层实验室开始开展这项检测。但不同实验室的设备、人员水平差异较大，导致检测结果的同质化问题突出。为此，我们在2021年完成了第5次修订，形成了现在的《26年非霍奇金淋巴瘤NGS质控手册》。这一版手册最大的特点是实现了全流程质控覆盖，从样本的“出生”到报告的出具，每个环节都设置了明确的质控节点和可量化的标准。同时，我们加入了针对NHL特有变异的质控要求，比如针对MYD88L265P、CD79B等常见变异的突变频率质控，避免因测序深度不足导致的漏检。截至2024年，全国已有超过300家实验室通过了基于本手册的质控认证，NHLNGS检测的结果一致性提升到了98%。3《26年非霍奇金淋巴瘤NGS质控手册》核心内容解析

1样本质控：检测结果准确性的第一道防线样本是NGS检测的源头，据统计，30%以上的NGS检测失败源于样本不合格。本手册将样本质控分为三个核心模块：

1样本质控：检测结果准确性的第一道防线1.1样本类型与采集规范针对NHL的检测，优先选择新鲜组织标本（手术切除标本或活检标本），其次是石蜡包埋组织（FFPE），不推荐使用胸腹水、脑脊液等体液标本（除非是中枢神经系统受累的病例）。在采集环节，我们明确要求：手术切除标本需在离体后30分钟内切成1-2mm的薄片，放入含有RNAlater的冻存管中；活检标本需用生理盐水冲洗干净后，立即放入固定液中（福尔马林固定时间需控制在6-12小时）；FFPE标本的切片厚度需控制在5-10μm，每张切片的肿瘤细胞含量需≥20%（通过HE染色镜下评估）。我曾遇到过一例基层实验室送检的FFPE标本，肿瘤细胞含量仅为5%，最终测序结果无法准确检测到变异，这也让我们在手册中新增了“肿瘤细胞含量强制质控”的要求。

1样本质控：检测结果准确性的第一道防线1.2核酸提取质量控制核酸提取是样本质控的关键环节，手册中明确了DNA和RNA的质控指标：DNA：OD260/OD280比值需在1.7-2.0之间，OD260/OD230比值需≥2.0，浓度需≥50ng/μL，总量需≥1μg；RNA：RIN值需≥7.0（新鲜组织）或≥5.0（FFPE标本），28S/18S比值需≥1.0。为了帮助实验室更好地执行这些标准，我们在手册中附上了核酸质控的实操视频和常见问题解决指南，比如当OD260/OD280比值过低时，可能是因为样本被蛋白质污染，需要重新提取核酸；当RIN值过低时，可能是因为样本保存不当导致的降解。

1样本质控：检测结果准确性的第一道防线1.3肿瘤细胞含量质控NHL的肿瘤细胞异质性较强，肿瘤细胞含量不足会导致低频变异的漏检。手册中推荐使用两种方法评估肿瘤细胞含量：一是HE染色镜下计数，二是通过生物信息学分析检测肿瘤突变负荷（TMB）或拷贝数变异（CNV）来间接评估。对于肿瘤细胞含量<10%的标本，我们建议先进行肿瘤细胞富集，再进行NGS检测，否则检测结果的准确性无法保证。

2文库制备与测序阶段质控文库制备和测序是NGS检测的核心环节，任何一个小的偏差都会影响测序数据的质量。本手册将这一阶段的质控分为两个部分：

2文库制备与测序阶段质控2.1文库构建质控指标文库构建的质控指标主要包括：文库浓度、插入片段大小、文库纯度等。手册中明确要求：文库浓度需≥1nM（通过Qubit荧光定量法检测）；插入片段大小需控制在200-300bp之间（通过琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪检测）；文库纯度需≥90%（通过琼脂糖凝胶电泳检测，无引物二聚体和其他杂带）。我记得2017年我们在一次室间质评中发现，有一家实验室的文库插入片段大小为500bp，导致测序数据的覆盖度不足，最终漏检了一例MYC基因的断裂变异。这件事也让我们在手册中新增了“插入片段大小强制质控”的要求，明确要求每个实验室必须在文库构建完成后检测插入片段大小。

2文库制备与测序阶段质控2.2测序过程的质量监控测序过程的质控主要包括测序仪的日常维护、测序数据的质量评估等。手册中要求每个实验室必须建立测序仪的日常维护记录，包括每周的清洁、每月的校准等。同时，明确要求测序数据的Q30占比需≥90%，GC含量需在40%-60%之间，目标区域的覆盖深度需≥100×（针对靶向测序）。对于测序数据的质量问题，我们在手册中附上了常见的解决方法：比如Q30占比过低可能是因为测序仪的试剂过期或样本污染，需要更换试剂或重新提取核酸；目标区域覆盖深度不足可能是因为文库浓度过低，需要重新构建文库。

3生物信息分析质控生物信息分析是NGS检测的最后一个实验环节，也是最容易出现问题的环节。本手册将生物信息分析质控分为三个核心模块：

3生物信息分析质控3.1变异识别的质控标准变异识别是生物信息分析的核心步骤，手册中明确要求：单核苷酸变异（SNV）的等位基因频率（AF）需≥5%（针对肿瘤细胞含量≥20%的标本）或≥10%（针对肿瘤细胞含量<20%的标本）；插入缺失变异（Indel）的支持reads数需≥10×；拷贝数变异（CNV）的log2比值需≥0.5（扩增）或≤-0.5（缺失）。同时，手册中明确要求必须使用经过验证的生物信息分析软件，比如GATK、Mutect2等，并且每个实验室必须建立内部的变异识别标准流程，避免因软件参数设置不当导致的假阳性或假阴性结果。

3生物信息分析质控3.2变异注释与过滤质控变异注释与过滤是生物信息分析的重要步骤，手册中明确要求：必须对识别出的变异进行注释，包括变异的位置、功能、频率等；必须过滤掉常见的多态性变异（比如dbSNP中频率≥1%的变异）；必须过滤掉测序质量差的变异（比如Q值<30的变异）。为了帮助实验室更好地执行这些标准，我们在手册中附上了变异注释与过滤的实操指南，比如如何使用ANNOVAR软件进行变异注释，如何过滤掉常见的多态性变异。

4报告解读与临床沟通质控报告解读与临床沟通是NGS检测的最终环节，也是连接实验室和临床的桥梁。本手册将这一环节的质控分为两个核心模块：

4报告解读与临床沟通质控4.1报告内容的规范要求手册中明确要求NHLNGS检测报告必须包含以下内容：患者的基本信息、样本信息、检测方法；测序数据的质量评估结果；识别出的变异信息（包括变异的基因、位置、类型、等位基因频率等）；变异的临床意义解读；检测的局限性说明。同时，手册中明确要求报告必须由经过资质认证的分子病理医师签署，并且必须附上原始数据的质控报告，方便临床医生了解检测的准确性。

4报告解读与临床沟通质控4.2临床相关性解读的质控临床相关性解读是报告解读的核心环节，手册中明确要求：必须结合患者的临床信息、病理诊断结果进行解读；必须明确指出变异是否与患者的治疗方案相关；必须明确指出变异的预后意义。我曾遇到过一例临床医生拿着NGS检测报告咨询的案例，报告中检测到了一例NOTCH2变异，但临床医生不知道这个变异是否有靶向治疗的意义。我们通过查阅文献和临床数据，明确指出NOTCH2变异是边缘区淋巴瘤的常见变异，可考虑使用PI3K抑制剂进行治疗，这也让我们在手册中新增了“临床相关性解读的标准化流程”，要求每个实验室必须建立针对NHL常见变异的临床相关性解读指南。02ONE质控体系的持续改进与临床价值体现

1室间质评与室内质控的联动机制本手册的核心是建立室间质评与室内质控的联动机制。室间质评是评估实验室检测能力的重要手段，我们每年都会组织基于本手册的全国NHLNGS室间质评活动，通过比对不同实验室的结果，发现行业内存在的共性问题，并及时更新手册的内容。室内质控是保障实验室日常检测质量的核心手段，手册中要求每个实验室必须建立室内质控体系，包括每月使用阳性对照品和阴性对照品进行内部质量控制，每季度参加室间质评活动，每年进行一次实验室间的比对。我所在的实验室从2000年开始建立室内质控体系，至今已经坚持了24年，从未出现过一次检测结果偏差，这也让我们深刻体会到了质控体系的重要性。

2真实世界数据对质控手册的迭代本手册的每一次修订都基于真实世界的临床数据。比如2021年我们在整理全国室间质评数据时发现，有近10%的实验室漏检了BCL2基因的断裂变异，这是因为他们使用的靶向测序panel未覆盖BCL2基因的断裂热点区域。为此，我们在2022年对手册进行了修订，新增了“针对NHL常见融合基因的panel设计要求”，明确要求panel必须覆盖BCL2、BCL6、MYC等基因的断裂热点区域。同时，我们还收集了大量的临床病例数据，分析了不同质控节点对检测结果的影响，比如肿瘤细胞含量、测序深度、等位基因频率等，这些数据都为手册的修订提供了重要的依据。03ONE总结与展望

126年质控实践的核心感悟回顾这26年的质控实践，我