T-CVMA 165-2024 禽白血病病毒磁微粒化学发光检测方法

CCSB41T/CVMA165—2024禽白血病病毒磁微粒化学发光检测方法Magneticparticlechemiluminescencemethodfordetectionofavian2024-5-23发布2024-5-23实施中国兽医协会发布IT/CVMA165—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东农业大学提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：禾旭（郑州）生物技术有限公司、山东农业大学、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：李秀梅、赵鹏、乔宏兴、刘近、任雪建、王一新、杨晓帆、常爽、吕园园、陶飞飞、杨志、杨转、刘明瑞、赵小月、殷笑丹、李亚静、阴思晴、施开创、尹彦文、冯淑萍、龙凤。T/CVMA165—20241禽白血病病毒磁微粒化学发光检测方法本文件规定了禽白血病病毒磁微粒化学发光检测方法的试剂与耗材、器材与设备、实验前准备、操作步骤、试验成立条件和结果判定标准等内容。本文件适用于泄殖腔拭子、胎粪、蛋清样品中禽白血病病毒的检测，适用于禽白血病的监测、流行病学调查等工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范T/CVMA32禽白血病病毒抗原化学发光免疫分析检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1反应杯reactioncup化学发光免疫分析仪配套使用的反应容器。3.2示踪物tracer吖啶酯标记的禽白血病病毒单克隆抗体。3.3激发液excitationfluid激发液由激发液A和激发液B组成，与化学发光免疫试剂配合使用，是一种辅助试剂，为发光过程提供碱性环境使用。4符号和缩略语下列缩略语适用于本文件。2T/CVMA165—2024MES溶液：4-吗啉乙磺酸溶液（4-Morpholineethanesulfonicacidsolution）PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphatebuffersaline）MEST溶液：4-吗啉乙磺酸吐温溶液（4-MorpholineEthylsulfonicAcidTweenSolution）PBST：磷酸盐吐温溶液（PhosphatebuffersalineinTween）NHS溶液：N-羟基丁二酰亚胺溶液（N-hydroxysuccinimidesolution）5技术原理采用夹心法的磁微粒直接化学发光检测技术检测禽白血病病毒抗原。将待测样品、禽白血病病毒抗体包被的磁性微球溶液反应一段时间后，再加入吖啶酯标记的禽白血病病毒单克隆抗体示踪物混合，孵育洗涤后，加入激发液A和激发液B；在碱性条件下，吖啶酯分子的发射光强度达到最大，通过测量的发光值结果和既定的判定方法判定待测样品的阴阳性。6试剂与耗材6.1磁性微球溶液，制备方法见附录A。6.2示踪物，制备方法见附录B。6.3阴性对照和阳性对照，制备方法见附录C。6.4浓缩洗涤液，制备方法见附录D。6.5稀释液，制备方法见附录D。6.6激发液A，制备方法见附录D。6.7激发液B，制备方法见附录D。6.8其他相关试剂，制备方法见附录D。6.9化学发光免疫分析仪，操作步骤见附录E。7器材与设备7.1最大离心力8,000r/min以上的离心机。7.2化学发光免疫分析仪。7.32℃~8℃冰箱，-20℃冰箱。7.437℃温箱。7.5规格为5mL和10mL的一次性采血器。7.61.5mL灭菌离心管。7.7反应杯。T/CVMA165—202438实验前准备8.1样品采集及处理8.1.1蛋清样品取全蛋，破碎后取蛋清，置-18℃以下冻融一次，用塑料吸头吸取蛋清直接进行检测。8.1.2泄殖腔拭子取泄殖腔拭子时，将拭子伸入泄殖腔转3圈并沾取少量粪便；用棉签于待检鸡只泄殖腔取样后，放入lmL样品稀释液中，置-18℃以下冻融1次，恢复室温（15℃~25℃)后，剧烈振荡1min，挤出棉签中的液体，弃棉签。将液体于2℃~8℃下，以12,000r/min离心1min，取上清直接进行检测。8.1.3胎粪样品用棉签取待检鸡只胎粪，放入1mL稀释液中，置-18℃以下冻融1次，恢复室温（15℃~25℃)后，剧烈震荡1min，挤出棉签中的液体，弃棉签。液体在2℃~8℃下，以12,000r/min离心1min，取上清直接进行检测。8.2样品的存放与运送样品若在一周内检测，可置2℃~8℃条件下保存。若超过一周检测，应置于-80℃以下冷冻保存。运输时注意冷藏。采集的样品可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，在24h内完成样品运输。9操作步骤9.1将样品、阴性对照、阳性对照分别各加100μL至相应反应杯中，再分别加入20μL磁性微球溶液，混匀后，37℃反应15min。9.2各反应杯中加入300μL洗涤液，清洗3次。9.3在反应杯中加入吖啶酯标记的禽白血病病毒单抗示踪合物100μL，混匀后，37℃温育10min。9.4重复步骤9.2后分别加入100μL激发液A和100μL激发液B。9.5化学发光免疫分析仪自动测定各反应杯发光值。10结果判定10.1试验成立条件阴性对照发光值与阳性对照发光值之比≥10，实验成立。10.2试验结果判定样品与阴性对照发光值之比﹤0.2，样品判定为禽白血病病毒抗原阴性。T/CVMA165—20244样品与阴性对照发光值之比≥0.2，样品判定为禽白血病病毒抗原阳性。T/CVMA165—20245磁性微球溶液A.1磁珠偶联物的制备A.1.1抗体处理取500μL抗禽白血病病毒P27蛋白单抗（浓度1mg/mL），装入透析袋中，置于透析液磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，室温（15℃~25℃)透析4h。A.1.2洗涤羧基球取200μL羧基磁珠（浓度50mg/mL）到离心管中，固定到磁力架上进行磁分离（或10,000r/min离心5min），移除上清。向磁珠中加入1mL的4-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），振荡分散均匀后，固定到磁力架上进行磁分离（或10,000r/min离心5min），移除上清。重复用MES磁分离洗涤2次，用0.5mLMES溶液重悬羧基球。A.1.3羧基球活化向羧基球重悬液中加入250μL的N-羟基磺基琥珀酰亚胺溶液（sulfo-NHS溶液），振荡分散均匀，再加入125μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液（EDC溶液），摇匀后固定在混匀器上室温（15℃~25℃)反应30min。反应结束后，磁分离，移除上清，用MES磁分离洗涤2次。A.1.4偶联抗体上述磁珠用800μL的4-吗啉乙磺酸吐温溶液（MEST溶液）分散，加入需要偶联的抗体溶液，然后补加MEST至总体积1mL，摇匀后固定在混匀器上室温反应4h以上。反应结束后，磁分离，移除上清，用封闭液磁分离洗涤2次，收集每次洗涤的上清液。A.1.5封闭加入1mL的封闭液，振荡分散均匀后，固定在混匀器上反应4h。A.1.6保存封闭离心，移除上清，用保存液磷酸盐吐温缓冲液（PBST溶液）磁分离洗涤3次，加入1mL的PBST重悬偶联后的磁珠，2℃~8℃保存备用。A.2磁珠溶液的制备将得到禽白血病病毒抗体磁珠偶联物用PBST按照1:100稀释，加入0.02%Proclin-300混匀后，无菌分装，2℃~8℃保存。T/CVMA165—20246示踪物B.1标记单抗的制备B.1.1透析取500μL抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体（浓度2mg/mL），装入透析袋中，置于透析液PBS中，室温（15℃~25℃)透析4h。B.1.2标记取出透析后的抗体溶液，加入洁净玻璃瓶中，再将吖啶酯溶液（浓度5.0mmoL/L）20μL加入抗体溶液中，避光，室温反应2h。B.1.3封闭反应后入10%（m/V）赖氨酸封闭，室温反应1h。B.1.4洗涤将标记抗体溶液，装入透析袋内，置于pH值7.4的0.05moL/LPBS透析液中，室温（15℃~25℃)透析过夜，中间换液2～3次。B.1.5保存取出透析后的标记抗体溶液，加等体积甘油，放置-20℃以下保存备用。B.2示踪物的制备将得到的禽白血病病毒标记单克隆抗体用PBS缓冲液（0.01moL/L，pH值7.4）按照1:1,000稀释，加入0.02%Proclin-300混匀后经0.22μm滤器过滤，无菌分装，于2℃~8℃保存。T/CVMA165—20247阴性对照和阳性对照C.1阴性对照阴性对照为PBS溶液。称取磷酸氢二钠（含12个结晶水）2.9g、磷酸二氢钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g，加入800mL纯化水搅拌溶解，再加纯化水定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。C.2阳性对照将-70℃保存的pET-32a-ALV-p27-BL21（DE3）菌株划线至含50μg/mL氨苄霉素LB固体培养基，在37±2℃温箱倒置培养12h～16h。挑取单菌落转接于200mL含50μg/mL氨苄霉素LB液体培养基中，置37±2℃、在200r/min摇床振荡培养12h左右至OD600nm达到0.6h～0.8h，加入终浓度为0.5mmoL/L的IPTG，继续振荡培养6h。将诱导后菌液，以12,000r/min离心1min后，收集菌体，用PBS（0.01moL/L，pH值7.2）重悬沉淀，通过超声波破碎仪破碎菌体后，在2℃~8℃下，以12,000r/min离心10min，取上清。采用镍离子梯度亲和层析法进行纯化获得纯化的禽白血病病毒p27蛋白。T/CVMA165—20248其他相关试剂D.1浓缩洗涤液称取十二水合磷酸氢二钠72.5g、磷酸二氢钾5g、氯化钠200g、氯化钾5g，加入700mL双蒸水加热搅拌溶解，再加入12.5mL的吐温-20，而后加双蒸水定容至1,000mL。使用前将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释。1份25倍浓缩洗涤液加24份蒸馏水。例如：40mL25倍浓缩洗涤液加入960mL蒸馏水。D.2稀释液称取2.9g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、8g氯化钠、0.2g氯化钾，加入800mL双蒸水搅拌溶解，加入牛血清白蛋白10g、Proclin-3001mL、吐温-201mL，用双蒸水定容至1,000mL，过滤除菌。D.3激发液A量取200mL纯化水，加入37%浓盐酸溶液8.33mL，加入30%过氧化氢溶液5.46mL，搅拌均匀加纯化水定容至1,000mL。定量分装，2℃~8℃保存。D.4激发液B量取200mL纯化水，加入氢氧化钠20g、十六烷基三甲基溴化铵5.7g，搅拌溶解，加入曲拉通X-1002.5mL，搅拌均匀加纯化水定容至1,000mL。定量分装，2℃~8℃保存。D.5PBS溶液称取磷酸氢二钠（含12个结晶水）2.9g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g，加入800mL纯化水搅拌溶解，再加纯化水定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。D.6MES溶液称取9.76gMES、29.22gNaCl、5mL10%的Brij35，溶于1,000mL纯化水，调节pH为6.0，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。D.7NHS溶液称取10mg的NHS，溶于1mLMES溶液中，临用配制10min内使用。D.8EDC溶液称取10mg的EDC溶于1mLMES溶液中，临用配制10min内使用。D.9MEST溶液取800mLMES溶液（0.5moL/L，pH值6.0），加入0.05%Tween20，用MES溶液定容至1L。D.10封闭液量取800mLPBS溶液（0.01moL/L，pH值7.4加入10gBSA、0.5mL吐温-20、2mLProclin-300，搅拌均匀，PBS定容至1,000mL，经0.22μm过滤，置2℃~8℃保存。T/CVMA165—20249D.11PBST溶液量取800mLPBS（0.01moL/L，pH值7.4），加入0.5mL吐温-20、2mLProclin-300，搅拌均匀，PBS定容至1,000mL。T/CVMA16