CN113307880B 在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体(CAR)及其使用方法 （希望之城公司）

201480076612.72014.03.14US2013004514A1,2013.在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体使用经由表达嵌合抗原受体(CAR)遗传重定向的T细胞的过继免疫疗法是一种用于癌症治疗膜序列与胞内信号传导域连接的胞外配体结合24.权利要求1-2中任一项的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体由插入到病毒载体5.权利要求3的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体由插入到病毒载体中的核酸序6.分离的由病毒载体转导的人免疫细胞群体，所述病8.分离的用嵌合抗原受体基因转导的人免疫细胞群9.权利要求8的分离的用嵌合抗原受体基因转导的人免疫细胞群体，其中所述抗原识10.权利要求8或9的分离的用嵌合抗原受体基因转导的人免疫细胞群体，其中所述抗11.权利要求8或9的分离的用嵌合抗原受体基因转导的人免疫细胞群体，其中与用包含编码源自未修饰的免疫球蛋白Fc区的间隔物域的核苷酸序列的嵌合抗原受体基因转导12.权利要求8或9的分离的用嵌合抗原受体基因转导的人免疫细胞群体，所述方法进一步包括与一种或多种抗癌疗法联合施用用所述嵌合抗原受体基因转导的人免疫细胞群13.权利要求8或9的分离的用嵌合抗原受体基因转导的人免疫细胞群体，所述方法进一步包括与一种或多种抗癌疗法联合施用用所述嵌合抗原受体基因转导的人免疫细胞群314.分离的用嵌合抗原受体基因转导的人免疫细胞群体在制备用于治疗受试者的癌症20.权利要求14-17任一项的用途，其中所述药物进一步与一种或多种抗癌疗法联合，21.权利要求14-17中任一项的用途，其中所述药物进一步与一种或多种抗癌疗法联4在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体(CAR)及其[0001]本申请是基于申请日为2014年3月14日，优先权日为2014年1月13日，申请号为[0003]本申请要求2014年1月13日提交的美国临时专利申请号61/926,881的优先权，通[0005]本发明在国家健康研究所(NIH)授予的拨款号P50CA107399和P01CA030206下得[0006]使用表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继免疫疗法是一种因为这些细胞能以不依赖于人白细胞抗原(HLA)的方式直接识别并杀死表达抗原的肿瘤细的胞质共刺激(例如CD28或4-1BB)域产生胞内信号，展现出etal.2013；Brentjensetal.2011；Gruppetal.2013；K使用不源自IgFc域的铰链/间隔物序列，诸如那些来自CD8α或CD28的(Brentjenset[0009]根据一些实施方案，提供了对Fc受体(FcR)具有受损的结合的重组嵌合抗原受体5[0012]设计具有降低或受损的对FcR的结合的间隔物域(诸如本文中描述的那些)的CAR[0016]源自经修饰的免疫球蛋白Fc区的间隔物域，所述经修饰的免疫球蛋白Fc区在其[0021]5.实施方案1的方法，其中所述经修包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自S228P氨基酸取代、L235E氨基酸取代、[0022]6.实施方案1的方法，其中所述经修[0024]8.实施方案1的方法，其中所述胞内信号传导域是6[0027]11.由病毒载体转导的人免疫细胞群体，所述病毒载体包含包括CAR基因的表达[0029]源自经修饰的免疫球蛋白Fc区的间隔物域，所述经修饰的免疫球蛋白Fc区在其[0033]13.实施方案11的方法，其中所述经修饰的免疫球蛋白Fc区是经修饰的IgG1、[0034]14.实施方案11的方法，其中所述经[0035]15.实施方案11的方法，其中所述经修[0036]16.实施方案11的方法，其中所述胞内信号传导域[0037]17.实施方案16的方法，其进一步包括一个或多个源自CD28、诱导型共刺激[0040]源自经修饰的免疫球蛋白Fc区的间隔物域，所述经修饰的免疫球蛋白Fc区在其[0042]19.实施方案18的方法，其中与包含编码7[0046]源自经修饰的免疫球蛋白Fc区的间隔物域，所述经修饰的免疫球蛋白Fc区在其CH2区中具有导致对FcR的受损的结合的一个或多个突变，其中所述一个或多个突变选自中。图1a显示了用于基因修饰T细胞以进行植入研究的CD19R/EGFRt(顶部)和EGFRt(底部)表达构建体的示意图。标示了CD19特异性CD28-共刺激CAR(CD19R)、可自身切割T2A、huEGFRt、和药物抗性DHFRFS和IMPDH2IY基因的序列部分，以及延长因子1启动子序列(EF-者用含有(A)中描述的CD19R/EGFRt(CD19R)或EGFRt/DHFRFS/IMPDH2IY(EGFRt)构建体的慢色从每组(n＝3-5只小鼠)收获的第7天和第14天外周血白细胞。使用基于阴性对照染色创建的象限，在每个直方图中标示淋巴细胞门控的huCD45+和huCD45+EGFRt+细胞的百分比。数据代表用来自多个供体的TCM衍生的细胞进行的4次不指定体积滴度的生物素化的可溶性人Fcgamma受体1，接着用缀合有PE的链霉亲合素(SA-分比在每个直方图中标示，并且基于设置为检测仅用SA-PE染色的细胞(黑线)的<1％的M1[0050]图3显示了根据一个实施方案，突变IgG4间隔物不影响表达CAR的T细胞的CD19特个点突变L235E和N297Q的CD19特异性CAR(CD19R(EQ))、和含有除去整个CH2域的截短的EGFRt标志物、在氨基酸235(CD19R(L235E))或氨基酸297(CD19R(N297Q))处具有单一IgG48标记的CD19+LCL或SupB15靶物的动剂OKT3的LCL(LCL-OKT3)和CD19阴性K562细胞作为阳性和阴性对照靶物。描述了在指定的E:T比率的一式三份孔的均值百分比铬释放±S.D.。[0051]图4显示了根据一个实施方案，具有突变IgG4间隔物的CAR展现出抑制的FcγR结合。用以下生物素化的试剂染色表达单独的EGFRt标志物、亲本CD19R、单点突变CD19R[0052]图5显示了根据一个实施方案，表达具有突变IgG4间隔物的CAR的T细胞展现出增强的体内植入。使用经照射的NS0-IL15支持物，在第0天将107个表达亲本CD19R、单独的EGFRt标志物、单点突变CD19R(L235E)或CD19R(N297Q)、双点突变CD19R(EQ)、或CH2缺失中的CD45+EGFRt+细胞的均值百分比±S.E.M.。当使用未配对Studentt检验与给予表达第3天将5x106个表达单独的EGFRt标志物、亲本CD19R、双点突变CD19R(EQ)、或CH2缺失CD19Rch2Δ的CAR+TCM衍生的细胞(总共107个细胞)i.v.输注到NSG小鼠中。然后，通过分比在每个直方图中标示，并且基于设置为检测仅用SA-PE染色的细胞(黑线)的<1％的M1示第21天的外周血的活淋巴细胞门控群体中的CD45+EGFRt+细胞的均值百分比(+S.E.M.)。了每组的KaplanMeier存活分析。使用时序(Mantel-COX)检验进行组间的统计学存活分[0054]图7显示了根据一个实施方案，大量表达CD19R(EQ)的T细胞展现出增强的治疗效表达亲本CD19R或双点突变CD19R(EQ)的CAR+T细胞i.v.输注到NSG小鼠中。然后，通过Xenogen成像监测LCL肿瘤生长。图7a显示了输入T细胞(在珠刺激和慢转导后第21天使用)9染色(中间，底部)画出的象限的免疫反应性细胞的百分比。图7b显示了对每组描绘了第2酶活性的均值通量水平(±S.E.)。图7d显示了每组的KaplanMeier存活分析。使用时序[0055]图8显示了根据一些实施方案，表达具有突变IgG4间隔物的CAR的非富集的TCM衍素染色从每组(n＝4-6只小鼠)收获的第7天和第14天外周血白细胞。图8A显示了描绘输入[0058]根据本文中描述的实施方案，提供了靶向癌症相关抗原的重组嵌合抗原受体包括一系列编码与本文中描述的CAR的蛋白质或肽域对应的氨基酸序列的区域。由于遗传个胞内信号传导域和任选地至少一个胞内共[0064]CAR抗原结合域可以包含核苷酸序列，其在表达为肽或多肽时结合癌症相关抗原相关抗原可以是突变癌基因或肿瘤抑制基因的产物，或者另一种突变基因的产物(例如过[0065]根据本文中描述的实施方案，可以通过本文中描述的CAR抗原结合域靶向的癌症ErbB2/HER2/neu/EGFR2、ErbB3、ErbB4、上皮肿瘤抗原(ETA)、FBP、胎儿乙酰胆碱受体scFv可以具有以下的氨基酸序列：[0072]FcCH2域内的一些氨基酸序列已经被鉴定为在抗体-FcR相互作用中具有参与内的表达CAR的免疫治疗细胞，从而帮助防止免疫学排斥和对细胞的清楚以意图对患者提酸替换为脯氨酸的变体蛋白质或肽。征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于另一分组的氨基酸)或者以保守的方式(即通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于同一分组的氨基酸)改用与存在于未修饰的铰链中的氨基酸残基不同的氨基酸残基取代的一个或多个氨基酸残237,238,239,243,247,267,268,280,290,292,297,298,299,300,305,309,218,326,330,但不限于下列氨基酸残基取代中的一个或多个V234A,L234V,L234F,L234A,L235A,L235E,G236A,G237A,P238S,S239D,F243L,P247I,S267E,H268Q,S280H,K290S,K290E,K290N,R292P,N297A,N297Q,S298A,S298G,S298D,S298V,T299A,Y300L,V305I,V309L,E318A,K326A,K326W,K326E,L328F,A330L,A330S,A331S,P331S,I332E,E333A,E333S,E333S,K334A,A339D,A339Q,P396L,PCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYPos.279VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKPos.339AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLPos.399DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLIgG4Fc区中的氨基酸残基不同的氨基酸残基取代的一个或多个氨基酸残基。一个或多个取代的氨基酸残基选自但不限于220,226,228,229,230,233,234,235,234,237,238,239,243,247,267,268,280,290,292,297,298,299,300,305,309,218,326,330,331,332,333,酸残基取代中的一个或多个：220S,226S,228P,229S,230S,233P,234A,234V,234F,234A,235A,235E,236A,237A,238S,239D,243L,247I,267E,268Q,280H,290S,290E,290N,292P,297A,297Q,298A,298G,298D,298V,299A,300L,305I,309L,318A,326A,326W,326E,328F,饰的IgG4Fc区中的氨基酸取代为指定位置处的上文鉴定235A,235E,236A,237A,238S,239D,243L,247I,267E,268Q,280H,290S,290E,290N,292P,297A,297Q,298A,298G,298D,298V,299A,300L,305I,309L,318A,326A,326W,326E,328F,饰的IgG4Fc区中的氨基酸被替换为指定位置处的上文鉴定氨酸(P)替换丝氨酸(S)的取代(S228P)、235位亮氨酸(L)替换谷氨酸(E)的取代(L235E)、[0095]在其它实施方案中，间隔物域源自经修饰的IgG4Fc区，其被双重突变以包含球蛋白Fc区包含其CH2域的全部或部分的一个或多个缺失(oneormoredeletionsof[0099]在一些实施方案中，间隔物域可以修饰为用免疫球蛋白Fc区取代没有结合FcR的编号根据EU索引或EU编号方案(Kabat等,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.,UnitedStatesPublicHealthService,NationalEU编号方案指EU抗体的编号(Edelman等,1969,ProcNatlAcadSciUSA63:78-85，其在氨基酸序列的核苷酸序列：述的那些共刺激域构成，或者备选可以由两个或更多个共刺激域的两个或更多个部分构酸序列的核苷酸序列：原性选择工具(例如与抗生物素微珠组合使用生物素化的西妥昔单抗进行的免疫磁性选择析以追踪T细胞植入)、和自杀基因(例如经由西妥昔单抗/Erbitux@介导的抗体依赖性细案中，可以用作附加基因的诱导型自杀基因是诱导型胱天蛋白酶9基因(参见Straathof等[0112]在一些实施方案中，可以将包含上文描述的CAR基因的表达盒插入载体中以经由NO:24-27的氨基酸序列：[0130]根据一些实施方案，可以在用于治疗受试者中的癌症的方法中使用CAR基因和用胞转导有并且表达单一突变体基因构建体，诸如如本文中描述的CD19R(L235E)或CD19R法治疗施用此类细胞时，经转导的T细胞特异性在体内靶向并且裂解表达癌症相关抗原的[0131]可以使用经转导的T细胞群体治疗的癌症可以包括但不限于急性成淋巴细胞性白道癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因肉瘤肿瘤家族颅外胚细胞瘤(EwingSarcomaFamilyofTumorsExtracranialGermCellTumor)、性腺外胚细胞瘤肝外胆管癌(ExtragonadalGermCellTumorExtrahepaticBileDuctCancer)、眼癌骨纤维组织细胞瘤(Eye(MetastaticSquamousNeckCancerwithOccultPrimaryMidlineTractCarcinoma旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、中间分化的松果体实质肿瘤(PinealParenchymal[0132]可以根据本文中描述的方法使用的用一种或多种CAR基因转导的一种或多种T细合物施用的响应并且相应调节剂量来确定有效量或治疗有效量。关于更多指导，参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,21stEdition,Univ.ofSciences况的完全或部分消退、或其一些组合。治疗/处理也可以意味着状况的防范性或预防性治第二CAR基因转导的T细胞的第二群体组合施用治疗有效量的用第一CAR基因转导的T细胞[0138]可以根据本文中描述的方法使用的另外的抗癌疗法可以包括一种或多种抗癌规[0139]可以根据本文中描述的实施方案与经CAR转导的T细胞联合施用的化学治疗剂和[0140]可以根据本文中描述的实施方案与经CAR转导的T细胞联合施用的免疫治疗剂包括但不限于免疫调节剂(例如STAT3抑制剂、来那度胺(Lenalidomide))和治疗性单克隆抗[0141]可以根据本文中描述的实施方案与经CAR转导的T细胞联合施用的靶向治疗剂包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂(伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼[0143]实施例1：在IgG4Fc间隔物区中掺入突变的嵌合抗原受体(CAR)避免Fc受体介导[0144]为了测定细胞FcR介导的相互作用是否在过继性转移的表达CAR的T细胞的免疫学内的一个或两个位点(L235E和/或N297Q)进行了突变–本文中称为CD19R(L235E)、CD19R(N297Q)或CD19R(EQ)–以及在其IgG4Fc间隔物中具有CH2缺失的CD19特异性CAR–本文中称的消除改善过继性转移的表达CAR的T细胞的持久性的胞质域(Kowolik等2006)组成；b)核糖体跳跃T2A序列(Szymczak等，2004)和c)截短的EGFR序列(Wang等2011a)。如先前描述(Jonnalagadda等，2013)生成EGFRt-T2A-DHFRFS-T2A-IMPDH2IY_epHIV7慢病毒载体。通过使用QuikChangeIIXL试剂盒(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)对已经由Geneart合成的经密码子优化的CD19R28Z_pGA质粒进行定点诱变生成CD19R(L235E)28Z-T2A-EGFRt_epHIV7、CD19R(N297Q)28Z-T2A-消化的CD19R28Z-T2A-EGFRt_epHIV7连接。从已经由Geneart合成的经密码子优化的CD19R-HL-CH3(CO)_pMK-RQ质粒生成CD19Rch2Δ28Z-T2A-EGFRt_epHIV7载体，用NheI/[0147]细胞系和维持。如描述(Wang,2011b)，从肝素化外周血分离人外周血单核细胞(PBMC)，所述肝素化外周血获自含有在希望之城国家医学中心(CityofHopeNationalMedicalCenter,COHNMC)进行成分输血(apheresis)的健康供体的残留血液成分的弃去的员会(IRB方案#09025)，和COHNMC人受试者保护局(OfficeofHumanSubjects一些情况中，经转导的T细胞对于EGFRt表达进行免疫磁性富集，如先前描述(Wang等，[0148]在补充有10％热灭活的胎牛血清(FCS,Hyclone,Logan,UT)，2mML-谷氨酰胺(IrvineScientific)和25mMHEPES(IrvineScientific)的RPMI1640(IrvineScientific,SantaAna,CA)中培养经EBV转化的类淋巴母细胞细胞系(LCL)和表达OKT3的和链霉亲合素获自BDBiosciences(SanJose,CA)。生物素化的抗-Fc购自JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.(WestGrove,PA)。先前描述了生物素化的西妥昔单分析免疫荧光细胞的百分比，并且使用FCSExpressV3(DeNovoSoftware,CA,USA)计算[0152]体内T细胞植入和疗法。所有小鼠实验得到COHNMC机构动物护理和使用委员会批个指定的TCM衍生的细胞，并且一周三次腹膜内(i.p.)注射2x107个经照射的NS0-IL15以在的证据已经显示了TCM-衍生的细胞上的CAR表达似乎与使用NSG小鼠的体内异种移植物模型降低，所述实验比较非转导的TCM衍生的细胞与(i)以慢病毒转导以表达CD19特异性CAR施用到小鼠中后7和14天收集的外周血，用抗人CD45mAb染色允许检测非转导的TCM衍生的管输入细胞的类似水平的转导和/或EGFRt表达(图1b，78-79％阳性)，与那些接受EGFRt+抗原的缺乏，以及已经看到了与表达不同抗原特异性的CAR的T细胞相似的现象的实情(数据未显示)提示了外周血中的植入/持久性的缺乏是不依[0156]HuFcγR结合CD19R+T细胞。CD19R构建体包含源自小鼠单克隆抗体FMC63的CD19特包含人IgG4Fc区的一部分，调查了FcR-介导的先天性免疫应答选择性清除CD19R/EGFRt+前植入研究中观察到的CAR+T细胞持久性的缺乏提供潜在的[0157]CD19R突变体的生成。为了进一步测试对表达CAR的TCM群体的潜性CAR(图3a)。还生成了具有IgG4CH2域缺失(即含有残基235和297的域缺失)的CD19特异[0158]huFcγR对具有突变IgG4间隔物的CAR的结合受损。为了测定CAR中的不同突变/缺缺失的T细胞都展示显著降低的对这些FcγR的结合。γR结合的CD19R突变或缺失是否会转化为过继转移移前不进行EGFRt富集的TCM衍生的细胞也观察到经基因修饰的细胞的此种挽救的植入和生的T细胞，而不是TCM衍生的品系中的CD19R(EQ)表达也导致改善的抗肿瘤效力和延长的[0162]在临床上，过继性T细胞策略的体内治疗效力与过继性转移后的植入和持久性直持(新近综述于(Overwijk&Schluns2009)、和使用最佳的T细胞群体进行转移(Berger等供了进一步的证据，即嵌合抗原受体(CAR)设计在指导治疗细胞的植入和持久性中发挥重以以与FcγR结合关联的方式潜在抑制NSG小鼠模型中表达CAR的细胞的植入和/或持久性。的体内持久性转化为体内小鼠模型中的显著改善的CAR指导的描述的研究突出显示了FcR介导的针对表达CAR的T细胞的响应对于体内T细胞持久性和抗掺入突变以防止FcγR识别。IgG-间隔物的CAR的T细胞在人中的持久性和治疗效力。CART细胞植入和体内抗肿瘤效力具有对IgG1和IgG3的最强的亲和力和降低的对IgG4的亲和力(Schroeder&Cavacini2010；且一些情况中在施用后通过定量PCR可检出低水平的CART细胞长达6周(Savoldo等2011)入在体内防止FcR介导的细胞识别的修饰。此类修饰可以牵涉改变氨基酸序列或者序列缺的T细胞的无意活化和/或宿主免疫应答(Hombach等2010)，所述转移的T细胞的无意活化和/或宿主免疫应答可以促成此免疫治疗策略的各种不想要的副作[0168]Berger,C,Jensen,MC,Lansdorp,PM,Gough,M,Elliott,C,andRiddell,SR(2008).Adoptivetransferofecellsestablishespersiste305.[0169]Berger,C,Flowers,ME,Warren,EH,andRiddell,SR(2006).Analysisoftransgene-specificimmuneresponsesthatlimittheinvivopersistenceofadoptivelytransferredHSV-TK-modifieddonorTcellsafterallogeneichematopoieticcelltransplantation.Blood107:2294-2302.OpinImmunol22:251-257.[0171]Brentjens,RJ,Santos,E,Nikhamin,Y,Yeh,R,Matsushita,M,LaPerle,K,etal.(2007).GeneticallytargetedTcellseradicatesystemicacutelymphoblasticleukemiaxenografts.ClinCancerRes13:5426StefanskiJ,TaylorC,OlszewskaM,Borquez-OjedaO,QuJ,WasielewskaT,HeQ,BernalY,RijoIV,HedvatC,KobosR,CurranK,SteinherzP,JurcicJ,RosenblatT,MaslakP,FrattiniM,SadelainM.(2013)CD19-targetedTcellsrapidlyinducemolecularremissionsinadultswithchemotherapy-refractoryacute[0173]BrentjensRJ,RivièreI,ParkJH,DavilaML,WangX,StefanskiJ,TaylorC,YehR,BartidoS,Borquez-OjedaO,OlszewskaM,BernalY,PegramH,PrzybylowskiM,HollymanD,UsachenkoY,PirragliaD,Hos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