26年肝癌NGS检测临床质控手册

26年肝癌NGS检测临床质控手册演讲人2026-04-29

目录01.编写背景与核心定位07.总结与展望03.肝癌NGS检测全流程质控体系05.质量控制的持续改进与能力验证02.肝癌NGS检测的临床应用基础04.不同样本类型的差异化质控要点06.本手册的临床应用与衔接

我从1998年开始投身肝癌临床检验与质控工作，至今已走过26个年头。从最初仅能通过常规PCR检测个别肝癌相关基因，到如今NGS技术已成为肝癌精准诊疗的核心支撑工具，这期间我见证了行业从混乱到规范的全过程。这本手册是我和团队十余年临床实践、上千次质量比对、百余次临床反馈复盘的总结，旨在为肝癌NGS检测的全流程质控提供可落地的统一标准，帮助检验、临床、研究机构规避常见风险，保障检测结果的准确性与临床实用性。01ONE编写背景与核心定位

1肝癌诊疗的精准化刚需据国家癌症中心2023年数据，我国肝癌年新发例数超47万，死亡例数超42万，发病率与死亡率均居恶性肿瘤前列。随着靶向治疗、免疫治疗的普及，肝癌诊疗已从经验医学转向精准医学：临床医生需要通过分子检测明确患者的驱动基因变异、肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定状态（MSI）等信息，才能选择合适的治疗方案。比如针对BRAFV600E突变的肝癌患者，靶向联合治疗的客观缓解率较传统化疗提升近3倍；而MSI-H型肝癌患者可从PD-1抑制剂治疗中获得长期生存获益。但临床中常出现不同实验室对同一患者样本的检测结果差异显著，甚至直接误导诊疗决策的情况，这让我们意识到建立统一的质控体系迫在眉睫。

2NGS技术在肝癌临床应用的现状与挑战NGS技术能一次性检测数百个基因的变异信息，完美匹配肝癌复杂的分子分型需求，但在临床落地过程中仍存在诸多痛点：一是样本质控标准不统一，比如部分送检样本离体时间过长导致DNA降解、肿瘤细胞占比不足导致检测结果失真；二是实验室内部流程缺乏规范，不同试剂盒、测序平台、生物信息学分析流程的结果一致性较差；三是临床解读与检测流程脱节，部分检验人员未结合肝癌的临床特征解读变异结果，导致假阳性或假阴性报告。我在2018年牵头参与全国肝癌NGS检测室间质评时发现，仅32%的实验室能达到80%以上的变异检测一致性，这一数据让我坚定了编写这本手册的决心。

3本手册的编写目的与适用范围本手册的核心目的是建立肝癌NGS检测从样本采集到报告发放的全流程质控规范，统一检测标准、减少结果偏差、保障临床诊疗有效性。本手册适用于开展肝癌NGS检测的临床检验科、病理科、第三方医学检验实验室，以及参与肝癌临床研究的科研机构，同时也可作为临床医生理解NGS检测质控逻辑的参考资料。02ONE肝癌NGS检测的临床应用基础

1肝癌的核心分子分型与诊疗关联肝癌的分子分型复杂多样，不同分型对应的治疗方案差异显著：①驱动基因变异型：包括EGFR、BRAF、MET等靶向药可及的变异，约占肝癌患者的15%-20%；②免疫治疗相关型：TMB≥10mut/Mb、MSI-H或PD-L1表达阳性的患者，免疫治疗获益显著；③HBV整合相关型：我国肝癌患者中85%合并HBV感染，HBV基因组整合到宿主基因组可导致抑癌基因失活，这也是肝癌发生的核心机制之一；④融合基因型：比如RET、NTRK融合，虽然占比低，但存在特异性靶向药物。临床送检的NGS检测需针对性覆盖上述分子分型，这也是质控的核心依据之一。

2临床常见送检场景与质控需求肝癌患者的NGS检测主要分为四大临床场景：①初诊晚期患者的一线用药前筛查，此时需优先检测靶向药可及的驱动基因与免疫治疗相关标志物；②术后复发患者的耐药机制检测，此时需检测获得性耐药变异，比如EGFRT790M、MET扩增等；③难治性患者的后线治疗方案选择，此时需覆盖罕见变异与融合基因；④临床研究入组筛选，此时需严格按照研究方案的要求进行样本采集与检测质控。不同场景下的样本类型、检测panel范围、质控标准均存在差异，比如术后复发患者的血浆ctDNA检测，质控标准需高于初诊患者的组织检测。

3肝癌检测样本的类型与质量特点临床常用的肝癌检测样本包括手术/活检组织样本、外周血ctDNA样本、胸腹水上皮细胞样本三类，每类样本的质量要求与质控要点均不相同：①组织样本：需保证肿瘤细胞占比≥20%、离体后15分钟内固定、固定液体积为组织体积的10-20倍；②ctDNA样本：需采用EDTA抗凝管采集、采血后2小时内离心分离血浆、血浆体积≥5mL；③腹水样本：需采集新鲜腹水、离心后保留沉淀、保证有核细胞数≥1×10^6个。我曾遇到过一例患者送检的组织样本离体后超过2小时才固定，最终检测结果显示多个关键基因的变异信号缺失，导致临床医生错过了最佳靶向治疗时机，这也让我们将样本离体时间纳入了强制质控指标。03ONE肝癌NGS检测全流程质控体系

1分析前质控：检测成功的前置保障分析前质控是整个检测流程的核心基础，据统计，约60%的检测失败案例均源于分析前环节的不规范操作。

1分析前质控：检测成功的前置保障1.1样本采集与运输规范针对不同样本类型制定了明确的采集要求：①组织样本：手术切除或活检获取的组织需立即放入10%中性福尔马林固定液，固定时间控制在6-48小时，避免固定时间过长导致DNA交联、过短导致组织腐败；②外周血样本：需使用EDTA-K2抗凝管采集，避免使用肝素抗凝管（会抑制后续PCR反应），采血后需在2小时内完成离心，离心参数为1600g离心10分钟，分离上层血浆后再以8000g离心10分钟去除残留细胞，最终血浆样本需保存在-80℃环境中，运输需使用干冰冷链；③腹水样本：需使用无菌离心管采集，采集后立即以1500g离心10分钟，保留沉淀并加入适量细胞保存液，常温运输即可。

1分析前质控：检测成功的前置保障1.2样本接收与质量评估样本接收环节需执行双人核对制度，核对内容包括患者姓名、性别、住院号、样本采集时间、样本类型等信息，同时需对样本质量进行快速评估：①组织样本：通过显微镜观察切片的肿瘤细胞占比，若占比<20%则需重新送检或进行激光捕获显微切割（LCM）富集肿瘤细胞；②血浆样本：通过Qubit荧光定量检测cfDNA浓度，若浓度<1ng/mL则需重新采集样本；③腹水样本：通过涂片染色观察有核细胞数与肿瘤细胞占比，若肿瘤细胞占比<10%则需重新采集。

1分析前质控：检测成功的前置保障1.3样本储存与流转管理所有样本需按照类型分类储存，组织蜡块需保存在室温干燥环境中，新鲜组织与血浆样本需保存在-80℃冰箱，且需建立样本流转台账，记录样本的接收、储存、检测、发放全流程信息，避免样本混淆或降解。我所在的实验室建立了样本二维码溯源系统，每一份样本都有唯一的二维码，扫码即可查看全流程信息，有效避免了样本混淆的问题。

2分析中质控：检测结果准确的核心环节分析中质控涵盖核酸提取、文库构建、测序、生物信息学分析四个核心步骤，每一步均需设置质控节点。

2分析中质控：检测结果准确的核心环节2.1核酸提取质控核酸提取需选择经过临床验证的试剂盒，同时需设置内参质控：①组织样本提取的DNA，需通过Nanodrop检测A260/A280比值在1.8-2.0之间，琼脂糖凝胶电泳显示主带清晰、无明显降解；②血浆样本提取的cfDNA，需通过片段分析仪检测片段峰集中在160-180bp之间，无明显大片段DNA污染；③腹水样本提取的DNA，需通过数字PCR检测内参基因的扩增效率≥90%。每批次提取的样本需同时提取阴性对照与阳性对照，若阴性对照出现扩增信号，则说明本次提取存在污染，需重新提取。

2分析中质控：检测结果准确的核心环节2.2文库构建质控文库构建需严格按照试剂盒说明书操作，同时需设置多个质控节点：①片段化质控：组织样本的DNA需片段化为200-300bp，cfDNA样本无需额外片段化，通过片段分析仪检测片段峰位置是否符合要求；②文库浓度质控：通过Qubit荧光定量检测文库浓度，若浓度<1nM则需重新构建文库；③文库质量质控：通过琼脂糖凝胶电泳或片段分析仪检测文库的片段分布，若存在大片段DNA污染则需重新纯化；④扩增效率质控：通过qPCR检测文库的扩增效率，若扩增效率<80%则需重新构建文库。

2分析中质控：检测结果准确的核心环节2.3测序过程质控上机测序前需对文库进行定量与稀释，保证上机的簇密度在目标范围内（通常为700-800k/mm²），测序过程中需监测Q30值，要求Q30≥85%，若Q30值低于80%则需重新上机测序。同时需设置测序对照，每批次测序需加入已知浓度的标准品，若标准品的检测结果与预期值偏差超过10%，则说明本次测序存在问题，需重新测序。

2分析中质控：检测结果准确的核心环节2.4室内质控品的常态化使用我们实验室建立了常态化的室内质控体系，每批次检测均需加入商品化的肝癌NGS室内质控品，质控品覆盖常见的驱动基因变异、MSI、TMB等标志物。若连续3次质控结果超出±2SD的控制线，则需暂停检测，排查试剂、仪器、操作流程等环节的问题，直至质控结果恢复正常后再继续检测。

3分析后质控：临床应用的关键保障分析后质控涵盖结果解读、报告审核、临床反馈三个环节，是连接检测与临床的核心纽带。

3分析后质控：临床应用的关键保障3.1生物信息学分析质控生物信息学分析需使用经过验证的分析流程，包括序列比对、变异检测、变异注释、过滤等步骤：①比对步骤需使用BWA-MEM工具，比对到人类参考基因组hg38；②变异检测需使用GATK工具，过滤掉测序深度<10×、等位基因频率（AF）<5%的变异；③变异注释需使用COSMIC、TCGA、ClinVar等权威数据库，明确变异的临床意义；④体细胞变异需与胚系变异数据库比对，排除胚系变异的干扰。我所在的实验室建立了自动化分析流程，但仍会安排专人对每一份报告的变异结果进行人工复核，避免自动化分析的遗漏。

3分析后质控：临床应用的关键保障3.2结果解读与报告审核结果解读需结合患者的临床特征、病史、样本类型等信息，避免单纯基于变异结果给出结论：①需区分体细胞变异与胚系变异，胚系变异需结合患者的家族史进行解读；②需明确变异的临床意义，将变异分为“临床意义明确”“临床意义未明”“良性”三类；③报告需包含检测方法、样本信息、检测结果、临床意义解读、局限性说明等内容。报告审核需执行双人审核制度，第一审核人负责核对检测结果与变异注释，第二审核人负责结合临床信息解读结果，只有两人均审核通过后才能发放报告。

3分析后质控：临床应用的关键保障3.3临床反馈与溯源改进我们建立了临床反馈台账，每月收集临床医生的反馈意见，比如患者的用药效果与检测结果是否匹配、报告解读是否符合临床需求等。若出现检测结果与临床不符的情况，需立即启动溯源流程，回溯样本采集、核酸提取、文库构建、测序、生物信息学分析等全流程环节，找到问题所在并制定改进措施。比如2022年有临床医生反馈某患者的TMB检测结果与免疫治疗效果不符，我们溯源后发现是测序深度不足导致TMB结果偏低，随后我们将ctDNA样本的测序深度从5000X提升至10000X，有效解决了这一问题。04ONE不同样本类型的差异化质控要点

不同样本类型的差异化质控要点针对肝癌常用的三类样本，需制定差异化的质控标准，避免一刀切的质控流程。

1手术/活检组织样本的质控要点组织样本是肝癌NGS检测的金标准样本，但需重点关注肿瘤细胞富集与固定质量：①若活检样本的肿瘤细胞占比不足20%，需使用激光捕获显微切割（LCM）技术富集肿瘤细胞，避免正常细胞的污染；②需检测组织样本的DNA完整性，通过DNA完整性指数（DIN）评估，要求DIN≥7；③若组织样本为蜡块样本，需检测蜡块的储存时间，若储存时间超过5年，则需重新采集新鲜样本进行检测，因为长时间储存会导致DNA降解。

2外周血ctDNA样本的质控要点ctDNA样本的检测难度较高，需重点关注cfDNA的浓度与片段分布：①需检测cfDNA的浓度，要求≥1ng/mL，若浓度过低则无法满足测序需求；②需通过片段分析仪检测cfDNA的片段分布，肝癌患者的cfDNA片段通常集中在160bp左右，若存在大量大片段DNA，则说明样本存在正常细胞的污染；③需检测血浆中的血红蛋白浓度，若血红蛋白浓度>50ng/μL，则说明样本存在溶血，溶血会导致cfDNA降解，影响检测结果。

3胸腹水上皮细胞样本的质控要点胸腹水上皮细胞样本的肿瘤细胞占比通常较低，需重点关注样本的富集与纯化：①需使用细胞保存液保存样本，避免细胞降解；②需通过密度梯度离心法富集肿瘤细胞，提高肿瘤细胞占比；③需检测样本的支原体污染情况，若存在支原体污染，则需重新采集样本，因为支原体污染会影响测序结果。05ONE质量控制的持续改进与能力验证

1室间质评的参与与结果分析室间质评是评估实验室检测能力的核心手段，我们实验室每年均会参加国家临检中心、省级临检中心组织的肝癌NGS检测室间质评，同时也会参与国际间的室间质评活动。每一次室间质评后，我们都会组织团队分析结果偏差的原因，比如若某一批次的MSI检测结果偏差较大，则需排查MSI检测的引物、测序深度、生物信息学分析流程等环节的问题。2021年我们参加全国肝癌NGS室间质评时，TMB检测结果偏差超过15%，我们溯源后发现是生物信息学分析流程中的TMB计算方法存在问题，随后我们更换了TMB计算工具，将偏差控制在了5%以内。

2实验室间的比对与协作我们与国内12家三甲医院的检验科建立了实验室间比对机制，每季度会交换相同的肝癌样本进行检测，比对结果的一致性。通过实验室间比对，我们发现了不同实验室在样本采集、核酸提取、生物信息学分析等环节的差异，随后我们共同制定了统一的质控标准，有效提高了全国范围内肝癌NGS检测的结果一致性。

3内部质量审核与人员培训我们实验室建立了每季度一次的内部质量审核制度，审核内容包括样本台账、质控记录、实验流程、报告审核等环节，审核结果会形成质量审核报告，提交给科室管理层。同时我们每月都会组织一次人员培训，培训内容涵盖样本采集、核酸提取、文库构建、测序、生物信息学分析、结果解读等全流程，培训后会进行考核，考核合格后方可上岗。2023年我们组织了12次培训，覆盖了所有检验人员，有效提高了团队的质控意识与操作技能。06ONE本手册的临床应用与衔接

1与临床科室的沟通培训为了让临床医生更好地理解肝癌NGS检测的质控逻辑，我们每季度都会组织临床科室的沟通培训，培训内容包括样本采集的注意事项、检测报告的解读方法、常见的质控问题等。比如我们会向肿瘤科医生讲解“为什么肿瘤细胞占比不足20%的样本无法得到准确的检测结果”，帮助临床医生理解质控标准的必