【《四环素和铜离子对小球藻抗氧化系统活性的影响探究报告》3500字】

四环素和铜离子对小球藻抗氧化系统活性的影响探究报告目录TOC\o"1-3"\h\u10411四环素和铜离子对小球藻抗氧化系统活性的影响探究报告 1157501.1引言 1150851.2四环素和铜离子对小球藻SOD酶活性的影响 1196531.3四环素和铜离子对小球藻CAT酶活性的影响 3325851.4小结 61.1引言当生物受到外界污染物的胁迫时，体内会产生大量具有杀伤性的活性氧自由基，这类具有代表性的杀伤性自由基包括超氧自由基(·O2-)、羟自由基(·OH)等，同时还会产生具有强烈氧化性的副产物过氧化氢(H2O2)。藻类暴露于有毒污染物时也会产生活性氧（ROS），并通过多不饱和脂肪酸（PUFA）的过氧化对藻类细胞造成致命的伤害。为抵御胁迫诱发的氧化损伤，藻类在长期进化过程中形成了一种由酶类和非酶类组成的抗氧化应激保护系统，在受到胁迫时会做出一系列应激或非应激的抗氧化反应，从而减少细胞损伤[5]。在以前的研究中，SOD活性、CAT活性和MDA含量常被用作表征污染物毒性的指标。故本研究选取超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）作为反映抗氧化系统活性的指标，通过测定SOD酶、CAT酶活性反映两种物质对小球藻抗氧化系统的影响，从而反映二元混合物对小球藻的毒性效应，系统地考察四环素与铜离子的毒性变化规律，研究四环素和铜离子对小球藻抗氧化系统活性的联合毒性效应。1.2四环素和铜离子对小球藻SOD酶活性的影响图4-1显示了不同浓度混合物环境下小球藻SOD酶活性变化情况。相对于空白对照组，添加四环素和铜离子的实验组小球藻SOD酶活性变化与之截然不同。在四组空白对照组中，SOD酶活基本保持在一个相对稳定的低水平状态。当四环素添加量为0时，小球藻仅受铜离子的影响，根据图4-1a可以看出，当铜离子添加量为1mg/L时，小球藻SOD酶的活性陡然增大，随后迅速减小至空白样品中的SOD酶活性水平，呈现出明显的应激现象，而铜离子添加量为2mg/L的同组小球藻SOD酶活性则是在第三天才开始升高。这说明在铜离子单独作用于小球藻时，小球藻的应激效应在离子浓度为1mg/L时高于离子浓度为2mg/L的实验组，且铜离子的存在将会使小球藻受到氧化损伤，导致机体对损伤做出反应生成额外的SOD酶用于清除损伤。当加入的四环素浓度为2.5mg/L时，由图4-1b可知，铜离子添加量为0的实验组同样表现出了与对照组不同的变化趋势：在接触前期（第一天和第二天）小球藻的SOD酶活性略高于对照组，在第三天则降低至低于对照组的水平。在四环素和铜离子共同作用的情况下，小球藻SOD酶活性始终高于对照组，且此时铜离子添加量的多少所带来的差异并不明显。图4-1混合物环境下小球藻SOD酶活性变化柱状图（a：四环素添加量为0；b：四环素添加量为2.5mg/L；c：四环素添加量为5mg/L；d：四环素添加量为10mg/L）当加入的四环素浓度为5mg/L时，由图4-1c可以看出，即使是未添加铜离子的实验组也表现出了较为明显的应激效应，且该效应随着铜离子浓度升高而加强，直至第三天SOD酶活性迅速降低至较低水平，且添加了铜离子的实验组甚至出现了活性为负值的情况，这说明在暴露于四环素和铜离子混合物三天后，该组小球藻的抗氧化系统受到了极大损伤，暴露于5mg/L四环素和铜离子共存环境下的小球藻已经不能产生有活性的SOD酶清除氧化损伤产生的氧化性物质。根据上述分析，可以得出以下结论：（1）单独添加四环素和铜离子均可激发小球藻的应激反应。对铜离子来说，浓度为1mg/L时的激发效果强于浓度为2mg/L的情况；对于四环素来说，浓度为5mg/L时的激发效果显著强于2.5mg/L时的效果。（2）四环素和铜离子对小球藻SOD酶活性的抑制呈协同关系。当四环素浓度水平不高时，四环素和铜离子同时存在将会导致小球藻应激反应的增强；当四环素浓度达到5mg/L时，小球藻的抗氧化系统将会受到严重破坏。1.3四环素和铜离子对小球藻CAT酶活性的影响SOD被认为是抗氧化剂系统的第一道防线，而CAT则被认为是第二道防线，它能够分解H2O2从而提高了细胞对氧化损伤的抵抗力（Li等，2016）。因此，CAT酶活性的变化能够进一步说明藻体受到的氧化损伤程度。图4-2显示了中低浓度四环素混合物环境下小球藻CAT酶活性变化情况。空白对照组中，CAT酶活性整体上随时间呈下降趋势。对照组中CAT酶活性稳中有降的变化趋势，说明小球藻在逐步适应培养环境，符合小球藻的生理特性。图4-2混合物环境下小球藻CAT酶活性变化柱状图（a：四环素添加量为0；b：四环素添加量为2.5mg/L）图4-2a反映了未添加四环素的各实验组CAT酶活性情况。培养一天后实验组CAT酶活性降低幅度小于对照组的正常衰减速度，说明小球藻在铜离子氛围下受到了氧化损伤，需要保持一定浓度的CAT酶活性进行抵御，且铜离子浓度为2mg/L时受到的损伤更大。培养两天后对照组中CAT酶活性测得为0，可能是因为SOD酶活性较为稳定，小球藻无需产生CAT酶用于抵抗氧化损伤；加入铜离子的两组实验组中CAT酶活性同样出现大幅度下降，一种可能的原因是SOD酶在受到应激反应刺激后活性增强，氧化损伤产生的自由基被清除从而无需继续合成CAT酶用于抵抗氧化损伤。培养三天后，对照组及实验组均出现CAT酶活性增强的现象，对照组出现该情况的原因可能是针对SOD酶活性下降的代偿性现象，实验组则是因为SOD酶活性的应激性增强效应结束，铜离子持续性的毒性开始发挥作用，藻体受到的氧化损伤增强，需要更高活性的CAT酶进行抵御。整体来说，一定浓度的铜离子对小球藻抗氧化系统有损害效应，且2mg/L的浓度对小球藻的毒害作用大于1mg/L浓度时的毒害作用，小球藻藻体出于抵御这种毒害的需要保持一定的CAT酶活性。图4-2b反映了在实验组各添加了2.5mg/L四环素、不同浓度铜离子条件下小球藻CAT酶活性情况。与活性逐渐下降的对照组相比，除未添加铜离子的实验组外，在四环素和铜离子共存的环境下，小球藻受应激效应影响，CAT酶的活性大幅度提高，且铜离子浓度为2mg/L时小球藻CAT酶活性高于浓度为1mg/L的实验组活性。这说明在2.5mg/L四环素浓度氛围时，四环素与铜离子对小球藻的氧化损伤呈协同作用，且铜离子浓度越高协同作用越强。图4-3反映了四环素浓度为5mg/L和10mg/L条件下各组CAT酶活性情况。这两组的测试结果与上两组完全不同，仅对照组之间的区别就较为明显。此处作出两种假设解释实验现象：一是小球藻藻种在实验过程中经过了数次传代，逐步适应了实验使用的BG-11培养基，在进行到此部分实验时由于进入新环境而产生的应激效应消失，因此机体无需合成CAT酶进行应激抗氧化反应；二是藻种在实验过程中逐渐老化，产生抗氧化酶的能力下降，在接种实验时已经由于老化产生的自由基氧化受损。考虑到实验组出现CAT活性为负值的情况，后一种解释更贴合现实情况，下面将在该假设基础上对实验结果进行分析。如图4-3a所示，除接种当天初始活性外，对照组和未添加铜离子的实验组中小球藻CAT酶活性测定值均为负值，考虑到同组实验测定的SOD酶活性仍旧较高，而SOD催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，故猜想此组实验接种的小球藻天然在合成CAT酶的能力方面有所不足，导致自身无法清除SOD酶反应生成的过氧化氢，从而出现CAT酶活性为负值的现象。由图可知在仅添加5mg/L四环素、未加入铜离子的实验组在培养一天后出现了与对照组相比较高的负值结图4-3混合物环境下小球藻CAT酶活性变化柱状图（a：四环素添加量为5mg/L；b：四环素添加量为10mg/L）果，结合同组SOD酶活性高于对照组活性的实验结果，合理推测SOD酶作用产生的过氧化氢与显色剂钼酸铵结合反应，导致测量结果呈负值。但当体系中存在一定浓度铜离子时，实验测定的CAT酶活性仍呈正值，且铜离子浓度越高CAT酶活性越高，这说明在四环素浓度为5mg/L条件下，四环素和铜离子在抑制CAT酶合成上呈拮抗作用。在四环素添加量为10mg/L的条件下，如图4-3b所示，各组小球藻的CAT酶活性均为负值，且除添加了铜离子的实验组之外，各组CAT酶活性绝对值随时间均匀减小。体系中存在铜离子的两实验组在培养三天后CAT酶活性出现了朝正值发展的趋势，这说明在四环素浓度为10mg/L条件下，四环素和铜离子在抑制CAT酶合成上呈拮抗作用。通过查阅相关文献，可以提出能够解释四环素和铜离子出现拮抗作用的假说。目前己有文献通过红外光谱技术证实了土霉素(Oxytetracycline)和铜离子相互作用可以形成一种如图4-4的新的化学结构的络合物[28]，根据本次实验的结果，可以合理推测铜离子和四环素相互作用也会形成类似的络合物，而这种络合物的形成降低了铜的生物可利用性。图4-4土霉素与铜离子结合形成的络合物结构图[28]1.4小结本章通过测定不同条件下小球藻SOD酶、CAT酶活性反映混合物对小球藻抗氧化系统的影响，研究并得到了四环素与铜离子对小球藻抗氧化系统的影响规律。结合上述实验结果及分析，可以得出以下结论：（1）四环素和铜离子在单独作用于小球藻时