CN113439085B 包含互补部分的修饰寡核苷酸的制造方法 （味之素株式会社）

2021.08.17PCT/JP2020/0063662020.02.18WO2020/171092JA2020.08.27oligoribonucleotidesynthesisw2069-2076.AliceSosic.EnzymaticFormationofPEGylatedOligonucleotides.Bioc本发明提供siRNA、异源双链寡核苷酸等包个以上的寡核苷酸原料片段进行处理而生成该修饰寡核苷酸，该合计4个以上的寡核苷酸原料片段相当于将该修饰寡核苷酸在满足下述条件(i)～(v)的片段连接部进行切割的情况下得到的寡核苷酸原料片段：(i)在互补部分的各链侧中分别存在1个以上的片段连接部，并且在该修饰寡核苷酸中存在合计(ii)将该修饰寡核苷酸在片段连接部进行切割突出末端的长度为1～10个碱基；(iii)至少1个4个以上的寡核苷酸原料片段中的4个寡核苷酸原料片段包含长度为5～25个碱基的互补部分；并且(v)与寡核苷酸原料片段的互补部分的各链侧对应的碱基长度的合计均为11～27个碱基长2JayakrishnanNandakumar.HowaLigaseDiscriminatesRNAversuDamage.MolecularCell211-221.AliceSosic.EnzymaticFormaPEGylatedOligonucleotides.Bioc3合计4个以上的单链寡核苷酸原料片段相当于将该修饰寡核苷酸在满足下述条件(i)(ii)将该修饰寡核苷酸在片段连接部进行切割的情况下，在互补部分中形成突出末(iv)该合计4个以上的单链寡核苷酸原料片段中的4个寡核苷酸原料片段包含长度为5(v)与寡核苷酸原料片段的互补部分的各链侧对应的碱基长度的合计均为11～27个碱9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在10mM以下的料片段混合溶液置于65℃以上的高温下并在其后4[0003]专利文献1中记载了通过使与将目标寡核苷酸切割(剪切)而得的片段对应的多个[0004]非专利文献1中记载了通过将寡聚DNA片段与PEG化寡聚DNA片段在粘性末端用DNA酸作为原料的含互补部分的寡核苷酸的基于[0005]非专利文献2和3中记载了用连接酶连接通过使1条寡核苷酸链与同其互补的2条[0006]非专利文献4中记载了用RNA连接酶连接具有粘性末端的24聚体双链寡聚RNA，形退火能力会显著下降的短链且推测因修饰型碱基的引入而导致酶的连接活性下降的寡核[0013]非专利文献1：SosicA,PasqualinM,PasutG,GattoB.2014.Enzymatic[0014]非专利文献2：Bullard,D.R.,&Bowater,R.P.(2006).Directcomparisonofnick-joiningactivityofthenucleicacidligasesfrombacteriophageT4.Biochem.J,398,135-144.[0015]非专利文献3：Nandakumar,J.,&Shuman,S.(2004).HowanRNALigase5DiscriminatesRNAversusDNADamage.MolecularCel[0016]非专利文献4：Nandakumspecificityandstructure-guidedmutationalanalysisofbacteriophageT4RNA[0017]非专利文献5：JayaprakashK.Nair,etal.(2014),MultivalentN-Acetylgalactosamine-ConjugatedsiRNALocalizesinHepatocytesandElicitsRobustRNAi-MediatedGeneSilencing.J.Am.Chem.Soc.,136,16958[0020]本发明的目的是提供siRNA、异源双链寡核苷酸等含互补部分的寡核苷酸的有效标的含互补部分的寡核苷酸的两个互补部分切割而得的片段对应的4个以上的寡核苷酸原以上的寡核苷酸原料片段进行酶法合成的方法仅报道有制造长度为28个碱基以上的较长酶合成作为4个以上的寡核苷酸原料片段的长度少于28个碱基等更短链的寡核苷酸的方6[0030](iv)该合计4个以上的寡核苷酸原料片段中的4个寡核苷酸原料片段包含长度为5[0031](v)与寡核苷酸原料片段的互补部分的各链侧对应的碱基长度的合计均为11～27C-芳7[0053][图2-1]图2-1～图2-6是表示实施例1中利用T4RNA连接酶2使得用于生成相同[0059][图3-1]图3-1～图3-4是表示实施例2中利用T4RNA连接酶2使4个片段的短链天然型RNA的组合进行反应时的各反应温度下的siRNA[0063][图4]图4是表示实施例3中各T4RNA连接酶2浓度下由修饰型RNA生成的siRNA和(Deinococcusradiodurans)的RNA连接酶(DraRnl)存在下的反应产物以及RNA可信制品[0065][图6]图6是表示实施例6中的反应产物的示意图、以及不存在酶和在T4RNA连接酶2的存在下的反应产物的基于HPLC的分析图谱[0066][图7]图7是表示4个寡核苷酸原料片段(包括含错配碱基对的寡核苷酸原料片段)[0067][图8]图8是表示5个或6个寡核苷酸原料片段与由其生成的双链修饰寡核苷酸的[0068][图9]图9是表示对于使用5个或6个寡核苷酸原料片段的反应中的双链修饰寡核[0069][图10]图10是表示包括在5'末端添加有DMTr基的寡核苷酸原料片段的4个寡核苷酸原料片段与由其生成的双链修饰寡核苷酸的关[0070][图11]图11是表示包括在5'末端添加有载体的寡核苷酸原料片段的4个寡核苷酸[0071][图12]图12是表示将核苷酸残基的连接部的磷酸基替换为硫代磷酸基的4个寡核苷酸原料片段与由其生成的双链修饰寡核苷[0072][图13]图13是表示4个寡核苷酸原料片段与由其生成的发夹型修饰寡核苷酸的关[0073][图14]图14是表示用于比较寡核苷酸原料片段中的突出末端的碱基长度对反应8性的影响的4个寡核苷酸原料片段与由其生成的双链修饰寡核苷酸[0074][图15]图15是表示用于比较产物的碱基长度对反应性的影响的4个寡核苷酸原料[0075][图16]图16是表示用于探讨高浓度底物时的反应初速度的4个寡核苷酸原料片段[0076][图17]图17是表示用于比较产物的碱基长度的4个寡核苷酸原料片段与由其生成[0079]本发明提供含长度为11～27个碱基的互补部分的修饰寡核苷酸(以下也称为“目[0081]通过本发明的方法制造的目标修饰寡核苷酸为包含长度为11～27个碱基的互补化学修饰中的取代后的取代基)取代而得的925'-或3'-磷酸基修饰中也包括磷酸基中酸基)。作为磷酸基的保护基，可列举例如：三苯甲基(Tr)、对甲氧基苯基二苯基甲基[0088]交联型修饰(bridgingmodification，桥连修饰)可为了例如使核苷酸残基的立取代为2'-O-甲基取代亚甲基-4'(约束的乙基交联化核酸(constrainedethylbridged代为2'-O-N(R)-C1～6亚烷基-4'2与4'-H取代为2'-N(R)-C(O)-4'(例如，基的糖部分本身的取代”的修饰型核苷酸残基，还可列举作为具有不被生物体内的酶(例[0092]“包含互补部分的寡核苷酸”是指包含互补核苷酸序列相互配对的结构的寡核苷苷酸切割为寡核苷酸原料片段的情况下与包含互补部分的寡核苷酸中的互补部分对应的仅是便于指向互补部分的任意一方及另一方的称呼，并没有生物学上的意义(特别是RNAi[0093]目标修饰寡核苷酸在互补部分中包含上述的修饰残基。含修饰型核苷酸残基的双链寡核苷酸或环型寡核苷酸)、在环型部分包含修饰型核苷酸残部核苷酸残基为修饰型核苷酸残基的寡核苷酸的全修饰型寡核苷酸等的不诱导RNase活性[0097]本发明的方法中用作原料的合计4个以上的寡核苷酸原料片段，可按照对应于将[0101](iv)该合计4个以上的寡核苷酸原料片段中的4个寡核苷酸原料片段包含长度为5[0102](v)与寡核苷酸原料片段的互补部分的各链侧对应的碱基长度的合计均为11～27段的数量也可从构成主要与目标修饰寡核苷酸(主要为双链核酸)的有义链和反义链对应寡核苷酸原料片段的数量分别为2个以上。这样的与有义链和反义链对应的寡核苷酸原料中的4个寡核苷酸原料片段可以按照目标修饰寡核苷酸包含长度较好是5～25个碱基长度、长度的增加而下降，因此较好是全部寡核苷酸原料片段中的4个寡核苷酸原料片段被设计成互补部分的长度为17个碱基以下。构成互补部分的2条链的长度较好是5～25个碱基长设定为满足上述的范围且相互整合(匹配)的值。例如，突出末端的长度为5个碱基的情况[0108]特定的实施方式中，上述条件(iv)中所规定的4个寡核苷酸原料片段的长度分别接酶可以是单链RNA连接酶或双链RNA连接酶中的任何，较好是双链RNA连接酶。作为双链[0119]连接酶处理中的寡核苷酸原料片段的浓度只要是足以生成目标修饰寡核苷酸的(例如，18～30个碱基长度)。N个和M个的碱基长度还可分别独立为11～27个碱基长度(例[0126]本发明的方法可包括合成寡核苷酸原料片段的工序(例如，固相合成等化学合[0127]本发明的方法可在连接酶处理工序之后包括反应停止工[0128]本发明的方法可在连接酶处理工序之后包括纯化目标修饰寡核苷酸的工序。例寡核苷酸原料片段呈变性状态(非配对状态)，将寡核苷酸原料片段混合溶液加热至高温，热至高温的操作和为了形成配对而进行冷却的处理(加热-冷却处理)，可通过简化的操作[0130]为了省略加热-冷却处理，连接酶处理工序之前寡核苷酸原料片段混合溶液置于[0132](1)对于存在于不同体系中的上述组合所含的全部寡核苷酸原料片段和寡核苷酸实施方式中，本发明可通过例如将该寡核苷酸原料片段在2～50℃混合而获得寡核苷酸原实施方式中，本发明可通过例如向含寡核苷酸连接酶的溶液中依次在2～50℃添加该寡核[0140]在由4个片段的短链天然型RNA以酶法合成siRNA的反应中，对该片段的碱基长度[0150]使用4个片段的寡核苷酸通过T4RNA连接酶2(新英格兰生物实验室(NewEngland[0152]将反应液通过采用XbridgeOligonucleotideBEHC18柱(沃特世[0155][实施例2]天然型RNA的连接反应中的反应温度的影响的评价对短链的连接反应进行了反应。反应液的组成为50mMTris-HCl、2mMMgCl2、1mM二硫苏糖醇、400μMATP、过HPLC对反应液所含的连接产物的浓度进[0159]对由修饰型寡核苷酸中的4个片段开始的siRNA的酶法连接反应的进展进行了评[0165]使用4个片段的修饰型RNA通过T4RNA连接酶2进行了反应。反应液的组成为50mM流速0.4mL/分钟。流动相通过采用A液(六氟异丙醇-三乙胺)和B液(甲醇)的线性梯度进行[0174]对由修饰型寡核苷酸中的4个片段开始的siRNA的酶法连接反应的进行(进展)使[0175]反应液的组成为DNA连接酶50mMTris-HCl、10mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mM[0177][实施例5]耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)RNA连接酶的制备和连接[0178]构建以E.coli表达来源于耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)的属于Rnl5家族的RNA连接酶DraRnl的株，制备纯化酶。首先，通过基因全合成而制成具有将[0180]使各表达株在含100mg/L氨苄西林的LB琼脂培养基中于37℃生长(培养)一夜。将所得的菌落接种于含100mg/L氨苄西林的LB培养基100mL，使用坂口烧瓶(Sakaguchi[0181]培养结束后，从所得的培养液通过离心分离收集菌体，悬浮于由50mMTris-HCl[0182]将所得的可溶性组分供于用所述缓冲液平衡了的带His标签的蛋白质纯化柱[0185]使用4个片段的修饰型RNA通过DraRnl进行了反应。反应液的组成为50mMTris-4流速0.4mL/分钟。流动相通过采用A液六氟异丙醇‑三乙胺和B液(甲醇)的线性梯度进行了[0190]对由4个片段的寡核苷酸通过酶法连接来生成具有环结构的修饰寡核苷酸的反应[0196]使用表4的4个片段的底物寡核苷酸通过T4RNA连接酶2(新英格兰生物实验室)进[0212]对由4个片段的寡核苷酸通过酶法连接来生成在碱基对中具有错配部分的双链修[0213]反应液的组成为1.78μg/mLT42[0222]对由5个片段和6个片段的寡核苷酸通过酶法连接来生成双链修饰寡核苷酸的反[0223]反应液的组成为1.78μg/mLT42下也进行了反应。按照实施例5中记载的条件通过HPLC对反应液所含的连接产物的浓度进[0232]反应液的组成为1.78μg/mLT42[0242]反应液的组成为1.78μg/mLT42[0250][实施例12]在连接部具有硫代磷酸二酯键的双链修饰寡核苷酸的生成反应对由将磷酸基替换为硫代磷酸基的4个片段的寡核苷酸通过酶法连接来生成双链修饰寡核苷酸[0251]反应液的组成为1.78μg/mLT42[0260]对由4个片段的寡核苷酸通过酶法连接来生成发夹型寡核苷酸的反应的进展进行[0261]反应液的组成为1.78μg/mLT42[0270]按照产物相同、并形成长度为1～6个碱基的突出末端的条件设计底物的寡聚核位置。将合成的目标产物可信制品和底物片段的序列示于表12，将4个片段的组合示于图[0271]反应液的组成为1.78μg/mLT42[0278]对制造由长度为11～14个碱基的互补部分形成的较短的目标产物的情况下的反[0279]反应液的组成为1.78μg/mLT42[0282]残存率(％)＝(添加酶的条件下的底物的峰面积的合计)/(阴性对照的底物的峰[0283]由长度为11个碱基的互补部分形成的产物与由长度为12个碱基以上的互补部分[0292]在各pH下对存在更高浓度的底物的条件下的修饰寡核苷酸的生成反应速度进行[0293]反应液的组成为1.78μg/mLT4RNA连接酶2(新条件加入EDTA而停止反应。按照实施例5中记载的条件通过HPLC对反应液所含的连接产物mLT4RNA连接酶2(新英格兰生物实验室)量的条件(对照条件)、将酶溶液用保存缓冲液稀释至17.8μg/mL后向含最终浓度0.1％的TritonX-100的反应液中添加1/10量的条件(试验条件1)、将酶溶液用含最终浓度0.1％的TritonX-100的保存缓冲液稀释至17.8μg/mL后向含最终浓度0.09％的TritonX-100的反应[0302]采用修饰寡核苷酸的反应中，反应液的组采用DNA的反应中，反应液的组成为22.0μg/mLT7DNA连接酶(新英格兰生物实验室)、50mMTris-2[0303]根据所得的质谱分析结果，基于在先文献(Roussisetal.,Journalof[0305]杂质的残存率(％)＝(反应液中的N±1聚体相对于目标产物的比例)/(底物溶液uuauagagcaauagggggaagcuuuggaa