CN113604423B 通过调节mir-124分化干细胞的方法 （艾克塞利瑞提德生物技术公司）

201380071949.42013.11.26WO2006091766A2,2006.0本文提供了通过调节miR-124来分化滋养层2物滋养层干细胞分化得到所述分离的胰腺祖细胞，其中所述bFGF的浓度为10ng/ml-803.根据权利要求1或2所述的分离的胰腺祖细胞，其中所述分离的胰腺祖细胞还表达4.根据权利要求1或2所述的分离的胰腺祖细胞，其中所述分5.根据权利要求1或2所述的分离的胰腺祖细胞6.根据权利要求1或2所述的分离的胰腺祖细胞，其7.根据权利要求1或2所述的分离的胰腺祖细胞8.根据权利要求1或2所述的分离的胰腺祖细胞，干细胞分化而来，并且所述分离的胰腺祖细胞与所述滋养层干细胞相比具有低或缺乏9.根据权利要求1或2所述的分离的胰腺祖细胞，其10.根据权利要求1或2所述的分离的胰腺祖细胞，其中所述分离的胰腺祖细胞是人细11.根据权利要求1或2所述的分离的胰腺祖细胞，其中所述分离的胰腺祖细胞来自啮3[0003]本申请要求2012年11月30日提交的美国临时申请号61/732,162和2013年9月12日[0005]本申请包含已经以ASCII格式电子提交并通过引用全文并入于此的序列表。所述[0006]在原肠胚形成期间，上胚层细胞产生原条中内胚层，随后产生包括定形内胚层[0009]该发明内容中提供的本发明实施方案仅意在示例性的并意在提供本文所公开的束本公开内容或任何请求保护的本发明实施方案4下，所述调节在时间空间上，例如在定形内胚层阶段在约1小时至约8小时之间激活miR-种情况下，该hsa-miR-124是hsa-miR-124-5p(SEQIDNO:1:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或[0012]在一个方面，本文提供了由本文的一种或多种方法分离的一种或多种分化细5开的任何方法中使用。种分离的祖细胞可以在本文公开的任何方法6胞与一种或多种物剂接触以激活miR-124，从而产生响应于葡萄糖刺激而分泌胰岛素的分方法包括使哺乳动物滋养层干细胞与一种或多种物剂接触以激活miR-124，从而产生胰腺如在定形内胚层阶段在约1小时至约8小时之间激活miR-124。在一些实施方案中，提升了7醇为约1mmol/L。在一些实施方案中，烟酰胺的浓度不大于约100mmol/L，例如约1至约Sox17、Foxa2和GSK3#的一种或多种因子。在一些实施方案中，本文中的miR-124是miR-124a是智人miR-124a(hsa-miR-124a)，例如hsa-miR-124-5p(SEQIDNO:1:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或hsa-miR-124-3p(SEQIDNO:2:UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或其[0025]1.一种分化哺乳动物滋养层干细胞的方[0026]2.根据项目1所述的方法，其中所述哺乳动物滋养层干细胞是人滋养层干细胞[0043]19.根据项目18所述的方法，其中在定形8[0047]23.根据项目1-22中任一项所述的方法氧化剂或还原剂。9[0072]48.根据项目23所述的方法，其中一种或多种物剂调节CAMP反应元件结合蛋白1[0077]53.根据项目23-52中任一项所述的方法，其中所述一种或多种物剂调节包括[0084]60.根据项目59所述的方法，其中所述hsa-miR-124a是hsa-miR-124-5p(SEQIDNO:1:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或其[0085]61.根据项目59所述的方法，其中所述hsa-miR-124a是hsa-miR-124-3p(SEQIDNO:2:UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或其[0087]63.根据项目1-62中任一项所述[0090]66.根据项目65所述的分离的祖细胞[0091]67.根据项目65所述的分离的祖细胞[0092]68.根据项目67所述的分离的祖细[0100]76.根据项目65-69中任一项所述的分离的祖细胞，其中所述分离的祖细胞是单[0110]86.根据项目85所述的分离的祖[0114]88.根据项目87所述的方法，其中与未与所述[0115]89.根据项目87所述的方法，其中与未与所[0133]101.根据项目95-99中任一项[0135]103.根据项目95-101中任一项所述的方法，其中所述分离的祖细胞是胰腺祖细[0136]104.一种治疗有需要的哺乳动物的疾病的方[0142]110.根据项目104-109中任一项所述的[0144]112.根据项目104-111中任一项所[0147]115.根据项目104-114中任一项所述的[0150]118.根据项目117所述的方法，其中所述#调理[0151]119.根据项目118所述的方法，其中所述#调[0154]122.根据项目116-121中任一项所述的方法[0155]123.根据项目116-121中任一项所[0156]124.根据项目116-122中任一项[0157]125.根据项目123所述的方法，其中[0158]126.根据项目116-125中任一项所述的方法，其中[0159]127.根据项目116-126[0169]137.根据项目127-136中任一项[0176]144.根据项目127-143中任一项[0183]151.根据项目116-126中任一项所述的方[0185]153.根据项目151或152所述的方法，其中所述一种或多种物剂包括维生素代谢[0188]156.根据项目116-155中[0191]159.根据项目158所述的方法，其中所述miR-124a是智人miR-124a(hsa-miR-NO:1:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或NO:2:UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或其胞分化为胰腺祖细胞期间胰腺的发育相关转录因子的时程分布图(time-course图1B显示了在DE形图2B显示了在DE的转变期间Mixl1、Cdx2和Oct4的免疫荧光图达之间的相关性，并显示了活性PI3K/Akt/CREB1信号传导途径靶向miR-124a的不同位点。图3C显示了通过qPCR试验测定的p-CREB1和miR-124a的平行表达，以及通过CREB1ChIP与qPCR量化的包含CREB1-结合位点1(acgccgtcatt,SEQIDNO:148)和位点2(ggtgacgtcagc,SEQIDNO:149)的miR-124-2和包含CREB1-结合位点(ggtgacgtcacc,SEQIDNO:150)的NO:152)的Smad43’UTR的pGL4.51-Luc报告构建体；图3E显示了针对靶向hsa-miR-124a图3M显示了通过24hr诱导的#调理素和胰岛素的免疫荧光[0198]图4A至图4E是一组显示hTS细胞衍生的胰腺祖细胞的特性的图。图4A至图4C显示了体外功能性葡萄糖刺激试验。图4A显示了根据ELISA测定，细胞响应于高葡萄糖浓度微镜-视频系统(Olympus,IX-81,DP30,MIU-IBC-IF-2)记录的形态变化和阳性DTZ染色。图4C显示了根据放射免疫测定，高葡萄糖(25mM)刺激分别以7.6ng/hr/106个细胞产生C-肽(以上方的线表示)并以393.8μIU/hrME)和烟酰胺在内的因子的多种组合对来自hTS细胞的胰岛素表达细胞的诱[0201]图7是一张TissueQuest分析图像，其显示根据胰岛素和胰高血糖素的共表达，bFGF(10ng/ml)实现了相似百分[0202]图8是一组来自代表性免疫印迹分析的图像，其说明在不同细胞过程期间转录因[0206]图12是一组流式细胞术图像，其显示Oct4的敲低上调了Nanog(左)且反之亦然[0207]图13是一组流式细胞术图像，其显示Nanog的敲低上调了Sox2(右)且反之亦然[0209]图15是一组Western印迹图像，其显示FGFR抑制剂(PD166866)阻断bFGF诱导的[0213]图19是一张条形图，其显示当包含miR-124a或抗-miR-124acDNA的质粒转染到[0215]图21是一组Western印迹图像，其显示通过使用Smad4shRNA抑制bFGF诱导的[0216]图22是一组Western印迹图像，其显示通过使用Oct4shRNA抑制bFGF诱导的Oct4[0217]图23是一组Western印迹图像，其显示在bFGF诱导后1-4hr之间的抑制性GSK3#导[0220]图26是一组显示#调理素(浅色点)和胰岛素(深色点)在bFGF诱导的胰腺祖细胞中物剂激活miR124。在一些实施方案中，本文的物剂调节一种或多种转录因子，例如mix1、员公知的，并包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些载体以及保持游离型的那些[0230]载体的构建可以使用在例如如在Sambrook等人,[0232]可以通过亲和技术或通过细胞分选(例如，荧光激活细胞轻神经变性疾病或病症的组合物的有效量是足以减少或去除该神经变性疾病或病症的症物滋养层干细胞分化成胰腺祖细胞。本发明的另一个方面是在胰腺分化期间通过miR-124地通过定形内胚层(DE)的形成而诱导朝向分泌胰岛素的胰腺祖[0244]在一些实施方案中，哺乳动物滋养层干细胞衍生的胰腺hTS细胞)分化成胰腺祖细胞，从而提供在生成用于1型DM患者中的基于细胞的疗法的分泌胰岛素的胰腺祖细胞中作为干细胞的可更新来[0250]在一些实施方案中，FGF(例如，bFGF)通过RTK激活PI3K/Akt途径以使CREB1磷酸[0256]AGGCCUCUCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAAUGUCCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAA[0258]AUCAAGAUUAGAGGCUCUGCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGCGGAGCCUACGGCUGCACUU[0260]UGAGGGCCCCUCUGCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCUAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAA[0261]本文的miR-124的核酸序列可以包括任意miR-124家族成员的核酸序列的片段或案中，抗-miR-124可以具有与miR-124的序列有任意互补性(compliment)的序列，例如登录号登录号序列hsa-miR-124-5pMIMAT0004591CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU(SEQIDNO:1)hsa-miR-124-3pMIMAT0000422UAAGGCACGCGGUGAAUGCC(SEQIDNO:2)aca-miR-124aMIMAT0021725UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:5)age-miR-124aMIMAT0002466UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:8)bta-miR-124aMIMAT0003811UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAG(SEQIDNO:17)ccr-miR-124aMIMAT0026331UCAAGGUCCGCUGUGAACAC(SEQIDNO:20)egr-miR-124aMIMAT0020240UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:50)emu-miR-124aMIMAT0020266UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:53)gga-miR-124aMIMAT0001128UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:56)ggo-miR-124aMIMAT0002465UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:59)lla-miR-124aMIMAT0002471UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:64)mdo-miR-124aMIMAT0004102UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:65)mml-miR-124aMIMAT0002470UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:66)mmu-miR-124-3pMIMAT0000134UAAGGCACGCGGUGAAUGCC(SEQIDNO:68)mmu-miR-124-5pMIMAT0004527CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU(SEQIDNO:67)odi-miR-124aMIMAT0006082UAAGGCACGCGGUGAAUGCUAA(SEQIDNO:73)ppa-miR-124aMIMAT0002467UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:81)ppy-miR-124aMIMAT0002468UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:84)ptr-miR-124aMIMAT0002469UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:85)rno-miR-124-3pMIMAT0000828UAAGGCACGCGGUGAAUGCC(SEQIDNO:87)rno-miR-124-5pMIMAT0004728CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU(SEQIDNO:86)sme-miR-124a-3pMIMAT0003992UAAGGCACGCGGUGAAUGCUU(SEQIDNO:93)sme-miR-124a-5pMIMAT0012112UGCUUUUAACGCGGAGCUUUAGU(SEQIDNO:92)ssc-miR-124aMIMAT0002156UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA(SEQIDNO:103)[0276]在一个方面，本文提供了由本文的一种或多种方法分离的一种或多种分化细任何方法中使用。开的一种或多种分离的祖细胞可以在本文公开的任何方法中使用。[0282]人输卵管是女性的受精部位和常见的异位妊娠部位，在例如内细胞团(ICM)与滋养外胚层之间的区分(distinction)以及从全能性到多能性的具相关的干细胞提供了支持。异位妊娠在工业化国家中占所有妊娠的1至2并且在发展中了来源于异位妊娠的人滋养层干细胞(hTS细胞)作为几乎无法获得的hES细胞的替代物用极性滋养外胚层中触发高速率的细胞增殖，从而导致细胞在整个胚泡阶段朝向腔壁区移细胞以增殖状态存在至少4天的窗口期，这取决于ICM分泌的成纤维细胞生长因子4(FGF4)[0285]本文提供的一个方面使用AffymetrixTM平台来探询GeneChipHumanGen前期的不同组的细胞滋养层，由此它们具有内细胞团(ICM)和/或滋养外胚层的分子特征用例如0.25％胰蛋白酶/EDTA回收并以例如1:3的稀清α-MEM)中完全切碎并在显微镜下鉴定，接着胰蛋白酶化(例如，用0.025％胰蛋白酶/止。可以获得粘附的细胞并将其在合适的条件下(例如，在37℃在5％CO2下的条件α-MEM、10％FBS和1％青霉素-链霉素中)培养。在两次传代后，hCG的水平会变得利用商业试剂盒方法中使用。[0301]在一种情况下，所述一种或多种物剂包括外源性miR-124前体或外源性抗-miR-种情况下，miR-124a是hsa-miR-124-3p(SEQIDNO:2:UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或其片段。在一种情况下，例如，如通过Western印迹分析所指示的，FBS与胰岛素水平在FGF(例如一些实施方案中，下降的Mixl1和高水平的T和Gsc可能暗示从哺乳动物滋养层干细胞到中的Cdx2，针对DE的Oct4或Nanog，针对原肠内胚层的Cdx2或Nanog，或针对胰腺祖细胞的Smad4或Mixl1来诱导miR-124或之后添加的BMP，例如BMP2、BMP7或BMP4。在一些实施方案中，BMP的有效量不大于约可以指以由于细胞死亡而导致受试者的中枢神经系统的神经元逐渐损失为特征的任何状将脂质基团并入脂质体的脂双层中以保持靶向配体与脂质体双层的稳能力筛选化合物的方法，该方法包括将该化合物与本文的胰腺祖细胞或分化细胞组合起乳动物滋养层干细胞用于筛选在培养中影响哺乳动物滋养层干细胞或分化细胞的特性的因子的不同混合物处理不同的孔。如果所处理的细胞以令人满意的方式(最佳地还在条件确定所处理的细胞是否发展出特定谱系的分化细胞的功能或表型特性来测试潜在分化因同细胞群体之间的基因和蛋白质表达，并用于鉴定并表征在分化过程中上调或下调的因或由于化合物被设计成具有在其他情况下具有非预期的副作用的效应，而完成所述筛选。受试者施用有效量的使用本文公开的本发明方法制备的分离的哺乳动物滋养层干细胞或的胰岛素或不产生胰岛素(调节葡萄糖利用的激素)。在2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿娠糖尿病(或妊娠期糖尿症，GDM)可以是没有先前诊断的糖尿病的女性在妊娠期间表现出高血糖水平的状况。成人潜伏性自身免疫糖尿病(LADA)可以是1型糖尿病在成人中发展的[0341]在一些实施方案中，本文的细胞、组合物和方法可以用于治疗或预防糖尿病(例脊髓侧索硬化、弗里德希共济失调症(Friedreich'sataxia)、路易体疾病(Lewybody[0351]在一些实施方案中，本文描述的方法可以用于减轻或改善神经疾病或病症的症状。与神经疾病或病症相关的症状的非限制性实例包括震颤、步态障碍、不良性步态调、指-指试验或指-鼻试验中的错误指示、辨距不良、霍-斯二氏现象(Holmes-Stewart米特综合征(Lhermittesyndrome)、共济失调、口吃、膀胱直肠障碍(vesicorectal胞与一种或多种物剂接触以激活miR-124，从而产生响应于葡萄糖刺激而分泌胰岛素的祖例如hsa-miR-124-5p(SEQIDNO:1:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或hsa-miR-124-3p(SEQID物滋养层干细胞可以用于用3D细胞生物打印技术生成器官和/或组织。3D细胞生物打印技[0366]本实验获得了高雄医学大学医院人文学科研究与伦理委员会的机构审查委员会(InstitutionalReviewBoardonHumanSubjectsResearchandEthicsCommittees,白酶/EDTA(Sigma-Aldrich)胰蛋白酶化15min，并随后添加包含10％FBS的α-MEM以使反应检测到。20％FBS和10ng/mlbFGF的组合，相比于在群体中表达2.1％和1.9％其他组合，生成了11.2％的最大免疫反应性胰岛素阳性(图5)。bFGF诱导使胰岛素+/胰高血糖素+细胞(8.5％)作为指示物获得了相似的结果(图7)。胰岛素+胰高血糖胞(bFGF10ng/ml)、712个细胞(bFGF20ng/ml)、485个细胞(bFGF40ng/ml)和571个细胞[0370]bFGF诱导后，时程分析揭示了标识胰腺发育的级联阶段的转录因子的动态分布内胚层相关蛋白——在诱导后15min升高。通过与升高的Brachyury(T)或Goosecoid(Gsc)24hr内bFGF通过DE形成和原肠内胚层诱导朝向胰腺祖细胞14)期间的相互负自动调节反馈环路(reciprocalnegativeautoregulatoryfeedback[0375]图3A说明了通过miR-124a向DE特化的分子途径。免疫印迹分析揭示了bFGF通过FGFR1激活了PI3K/Akt途径及其下游效应物cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1()图15-18)。译和/或引起RNA降解。通过序列分析和萤光素酶报告试验表明，miR-124a抑制Smad4(图Foxa2但在DE阶段下调Smad4和Mixl1诱导miR-124a的多[0377]β调理素——一种蛋白质激素——主要在肝脏中表达并功能性地诱导高胰腺β-细分析揭示β调理素mRNA的时间空间升高在12hr时开始，在16hr时到达峰值约100并在此[0380]胰腺祖细胞通过将免疫反应性胰岛素分泌到培养基中来监测葡萄糖水平(图4A[0381]放射免疫试验测量了免疫反应性C-肽和胰岛素水平响应于高葡萄糖(25mM)刺激[0382]在免疫细胞化学上，hTS细胞衍生的胰腺祖细胞表达多种标志物，包括Sox2、[0385]将未分化的hTS细胞保持在补充有10％(v/v)胎牛血清(SAFCBiosciences)的α-的阶段特异性分化参考如先前描述的多种细胞标志物(M.Borowiak,Rev.Diabet.Stud.7,[0387]DTZ(MerckKGaA,Darmstadt,Germany)、bFGF(Sigma)、异硫氰酸荧光素(FITC)、的异硫氰酸荧光素(FITC,Invitrogen)或AlexaFluor488、594、647(Invitrogen)或染色，对核(5min)细胞进行显微镜检查。随后在室温下与第二抗体孵育(1hr)并洗涤，用50％甘油固定载玻片。在共聚焦激光扫描显微镜(LSM700；ZeissZ1或OlympusFluoView1000共聚焦激光扫描显微镜)或TissueFAXS系统(TissueQnosticsGmbH,Vienna,Austria)[0393]根据制造商的方案使用TRIZOL试剂(Invitrogen)与DNAaseI柱上消化(Qiagen,Valencia,CA)从一式三份或五份样品中的hTS细胞中分离RNA。总RNA(500ng)用于使用向引物一式两份地进行PCR。针对miRNA茎环qPCR，根据制造商的说明(Applied引物(AppliedBiosystems)，一式三份或五份地进行比较实时PCR，包括无模板对照。U6snRNA(RNU6B；AppliedBiosystems)用作内源性对照。使用SDS2.2.2软件(Applied[0395]采集bFGF-处理的hTS细胞的细胞裂解物。通过与蛋白G-琼脂糖(Minipore)孵育从hTS细胞(1x106)提取免疫沉淀DNA片段，并如先前所述(T.T.Y.Lee等人,PLoSONE7,e52491(2012))使用抗-CREB1或抗-Oct4或抗-β-联蛋白的抗体。特异性引物用于扩增在染试剂(MirusBioLLC,Madison,WI,US)将非特异性对照miRNA(30pmol)或miR-124a前体[0404]miR-124a前体和抗-miR-124a购自SystemBiosciences。简言之，使用TransIT-LT1转染试剂(Mirus,Madison,WI)将miR-124a前体(60pmol)或抗-miR-124a(60pmol)转染的培养基用冻干机(VirTis,Warminster,PA)冻干，并用无菌水(400μl)再水合疫测定。分别通过C-PEPII-RIA-CT(DIAsourceImmunoAssaysS.A.Belgium)和Coat-A-Count胰岛素(SiemensHealthcareDiagnosticsInc.LA,CA)确定培养基中的C-肽和胰岛[0408]在用非特异性shRNA或针对Cdx2或Oct4或Sox2或Nanog的shRNA转染后，将细胞(5式细胞术(FACScan,BDBiosciences,SanJose,CA)前使之通过具有细胞过滤器盖(BD4℃下在包含1％(vol/vol)OsO4的Palade固定液中锇处理(osmication)2hr之前和之后将染色，并使用JEM-2000EXII(JEOL,Tokyo)检查。囊泡颗粒的成像参考先前所述(K.A.D’