镉离子胁迫对小麦SOD、POD、CAT活性和丙二醛含量的影响

摘要本实验采用了实验室土培法，研究选取周麦36、洛麦42、洛麦49这三个半冬性小麦品种作为实验材料，分别用浓度梯度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L的氯化镉溶液从小麦出芽开始处理，探究重金属镉离子胁迫对不同品种小麦幼苗叶片和根系中的SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）活性及小麦体内MDA（丙二醛）含量的影响并分析酶活的变化趋势。结果表明：随着镉离子浓度的升高，幼苗叶片和根系中的MDA含量明显逐渐增加。三个小麦品种的SOD、POD、CAT活性均呈现出先扬后抑态势；POD和CAT在镉离子浓度为0.4mmol/L时酶活性达到峰值；在镉离子浓度为0.6mmol/L时POD酶活性达到峰值；其中洛麦49的SOD、POD、CAT酶活性曲线均高于周麦36和洛麦42，表明洛麦49的耐镉离子胁迫能力比周麦36和洛麦42更强，即耐镉性较强。经方差分析可知，小麦的SOD、POD和CAT活性在各浓度下均有显著差异，因此在镉污染下，洛麦49耐镉性较之周麦36和洛麦42较强。关键词：镉胁迫，SOD，POD，CAT，MDA引言重金属污染是一个严重的环境问题，不仅限制植物生产力，还威胁着人类健康REF_Ref9922\r\h[1]。Cd（镉）属于工业生产中产生的有毒物质，也是常见的环境污染物REF_Ref9922\r\h[2]。当生物体摄入过量镉时，会出现明显的生理机能损伤，生长发育也会受到严重影响。目前普遍认为，土壤中镉含量不超过0.8mg/kg时，基本不会对生态环境和生物体造成危害。不过，土壤质地差异会影响镉的迁移转化和有效性，砂质土、黏质土等不同类型土壤中，镉的安全阈值存在差异，最高可达到3mg/kg。重金属镉对作物的毒害是多维度的，主要体现在生长发育、光合作用、酶系统、细胞分裂以及元素吸收转运等关键生理过程。在生长发育层面，镉不是植物生长必需元素，却具有极强生物毒性。当植物体内镉积累达到一定浓度，叶片会变黄枯萎、茎秆生长受限而缩短、侧根数量减少REF_Ref9922\r\h[3]。同时，叶绿素合成会受阻碍，抗氧化酶活性降低，细胞膜结构遭到破坏，细胞完整性受损，最终抑制植株整体生长。光合作用方面，镉会干扰植物正常生理活动，降低光合速率，直接影响有机物合成，削弱植物的能量供应和物质积累能力。酶系统是植物代谢的核心调控因素，而镉能够与酶活性中心或蛋白质巯基紧密结合，使酶失去催化功能，导致植物代谢通路紊乱，影响养分合成、能量转化等关键生命活动。细胞分裂过程中，镉会干扰细胞分裂周期的正常调控，降低细胞分裂指数，并导致染色体形态发生畸变。当镉浓度超标时，细胞分裂无法有序进行，严重破坏植物生长发育进程。此外，植物根系会主动吸收环境中的镉。随着镉在植物体内不断累积，毒害效应持续加剧，对植物健康造成更严重威胁。镉不具备还原性，无法直接通过氧化反应生成活性氧（ROS）REF_Ref9922\r\h[4]。不过，在镉胁迫下，植物体内仍会积累O2-、H2O2等活性氧自由基。过量活性氧会攻击细胞内的蛋白质、脂类，引发膜脂过氧化反应，破坏生物膜结构，进而扰乱植物正常的生理代谢过程。这一过程会显著抑制植物生长，导致作物减产，严重时甚至致使植株死亡REF_Ref9922\r\h[5]。为抵御活性氧的危害，植物演化出非酶和酶两类清除系统。非酶系统包含谷胱甘肽、抗坏血酸等物质，直接参与氧化还原反应去中和活性氧；酶系统则由SOD、CAT、POD等组成，通过催化分解将活性氧转化为无害物质，维持细胞内氧化还原平衡。小麦是全球重要粮食作物之一。因其适应性强、用途广泛，在全球各地均有大面积种植。研究小麦对于提高产量和质量、增强适应性、丰富基因资源、促进国际合作以及保障粮食安全等方面都具有重要的现实意义和长远的发展前景REF_Ref10425\r\h[5]。因此，筛选抗逆性小麦品种和提高小麦产量已经成为当下的研究热点，也是未来农业的研究课题。本课题为了探究不同Cd浓度对小麦的POD，SOD，CAT活性和MDA含量的影响。以三种半冬性小麦周麦36，洛麦42，洛麦49为材料，来阐述重金属Cd对小麦的胁迫机理及小麦抗氧化酶活性的影响及膜脂过氧化的程度，并为选育耐镉小麦品种提供一定的理论依据。1.材料与方法1.1材料的选择1.1.1试验材料选用三个半冬性小麦品种：周麦36、洛麦42、洛麦49。1.1.2试验仪器低温冷冻离心机，UV762紫外可见分光光度计，4000lx人工气候箱，恒温水浴锅，计量天平，研钵，1000µL、100µL、10µL移液枪，2ml离心管，500ml、1L容量瓶，若干泡沫板，烧杯，玻璃棒，试管，若干花盆（直径21cm，深16cm）。1.1.3试验药品测定SOD所需试剂：50mmol/L的PBS（磷酸钠缓冲液）（pH7.8），130mmol/L的甲硫氨酸溶液，750μmol/L的氮蓝四唑，20μmol/L的核黄素溶液（避光保存，现用现配），100μmol/L的EDTA-Na2（乙二胺四乙酸钠）溶液。测定POD所需试剂：50mmol/L的PBS（磷酸缓冲液）（pH7.0），20mmol/L愈创木酚溶液（乙醇可助溶），40mmol/L过氧化氢溶液（现配现用）。测定CAT所需试剂：60mmol/L的过氧化氢溶液（现配现用），50mmol/L的PBS（内含1%聚乙烯吡咯烷酮，pH7.8）。测定MDA所需试剂：5%TCA（三氯乙酸）溶液，0.67%TBA（硫代巴比妥酸）溶液（避光保存，现用现配），50mmol/L的PBS（磷酸钠缓冲液）（pH7.8）。1.2试验方法1.2.1供试材料与处理方法第一步，先对三种小麦进行催芽。筛选麦粒圆润、完整、无病害且大小均匀的种子，每个小麦品种挑选约500粒。将选好的种子用75%的乙醇浸种30s后用蒸馏水洗净，再放在蒸馏水中浸泡过夜。将过夜种子沥干后放在培养皿上并盖上湿纱布进行催芽。第二步，土培法对发芽小麦进行培育。将营养土等量均匀装入到塑料花盆中，每盆播种约50粒左右，并在花盘上分别标记周麦36、洛麦42、洛麦49作为记号。设置五个氯化镉浓度梯度，分别为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L，每个镉离子浓度处理3盆，每个浓度梯度做重复实验3次，共计45盆。小麦放置于通风良好，阳光充足的自然环境下生长，每三天进行一次定时定量的浇水，待小麦长到三叶期（约长15-20cm左右）时，取小麦叶片和根系进行酶活检测和丙二醛含量检测。1.2.2粗酶液提取SOD粗酶液提取：取相同浓度处理下的三盆小麦叶片各0.2g，置于预先冷却的研钵中。加入50mmol/L磷酸钠缓冲液研磨（冰浴条件下），直至成均匀的浆液。然后使用移液枪将匀浆移到2mL的离心管中，离心管进行配平后，置于高速冷冻离心机中（参数为15min，12000rmp）。SOD粗酶液将位于上清液中，将其保存在4℃冰箱供后续使用。POD粗酶液提取：参考SOD提取方法。使用50mmol/L的磷酸缓冲液，离心机参数设置为5min，4000rmp。CAT粗酶液提取：参考SOD提取方法。使用50mmol/L磷酸钠缓冲液，离心机参数设置为5min，4000rmp。MDA粗酶液提取：参考SOD提取方法。使用50mmol/L磷酸钠缓冲液，离心机参数设置为10min，12000rmp。小麦根系中的SOD、POD、CAT、MDA的粗酶液提取方法与叶片的提取方法相同。需值得注意的是用剪刀剪取小麦根后应用清水冲洗干净，滤纸或抹布擦干后再进行称重。1.3吸光度测定1.3.1三种小麦SOD活性测定采用NBT（氮蓝四唑）光还原法测定SOD的活性REF_Ref10549\r\h[6]。5个浓度梯度处理中每组3次重复，每组重复测定需5支样品管和2支对照管（避光下“无酶液”空白组和光照下“无酶液”对照组）分别按表1顺序加入以下试剂，核黄素溶液见光被激发，生成超氧化物自由基，需放到最后加入。各试剂按比例混合后将一支“无酶液”的对照管放置于黑色塑料袋中（模拟黑暗环境)，其余反应管均置于光照强度4000lx的人工气候培养箱内，反应时长设定为15分钟，时间结束后，将反应管置于黑暗环境下反应结束，随后使用紫外分光光度计，在560nm波长条件下测定吸光度（OD）数值；以黑暗环境处理的对照管做空白参比进行仪器调零，用相应体积的磷酸钠缓冲液代替酶液做对照管。照光对照管的吸光度值记录为ODs。SOD酶活性的计算公式：表1.小麦叶片和根系SOD测定的反应体系试剂反应管(mL)对照管(mL)50mMPBS(pH7.8)1.51.5130mMMet(甲硫氨酸）0.30.3750uMNBT0.30.3100uMEDTA-Na20.30.320uM核黄素0.30.3酶液0.10.1mLPBS代替蒸馏水0.20.2总体积331.3.2三种小麦POD活性测定采用愈创木酚法测定POD的活性REF_Ref10634\r\h[7]。5个浓度梯度处理中每组3次重复，每组重复测定需5支样品管和1支对照管（灭火酶液（沸水浴5分钟）以排除背景干扰）分别按表2顺序加入以下试剂。POD催化过氧化氢（H2O2）氧化愈创木酚，生成棕褐色产物四愈创木酚。因此，实验通过最后添加H2O2触发反应，利用分光光度计在470nm波长条件下检测吸光度变化情况。即刻计时，当数值稳定后每隔60s记录一次，共测3分钟，记录3次。POD酶活性的计算公式：表2.小麦叶片和根系POD测定的反应体系试剂反应管（mL）对照管(mL)50mM磷酸缓冲液（pH7.0）2.62.620mM愈创木酚0.30.340mMH2O20.010.01酶液0.10.1（沸水浴五分钟）总体积331.3.3三种小麦CAT活性测定采用紫外分光光度法测定CAT活性REF_Ref10702\r\h[8]。5个浓度梯度处理中每组3次重复，每组重复测定需5支样品管和1支对照管（用PBS代替酶液，扣除H2O2自发分解）分别按照表3依次加入以下试剂。CAT能催化H2O2分解为H2O和O2，故实验通过最后添加H2O2触发反应，利用分光光度计在240nm波长条件下检测吸光度变化情况。即刻计时，当数值稳定后每隔60s记录一次，共测3分钟，记录3次REF_Ref11473\r\h[12]。CAT酶活性的计算公式：CAT活性U/(g·min)=(∆𝐴240/min×𝑉总)÷(m×𝑉1×0.1×t)表3.小麦叶片和根系CAT测定的反应体系试剂反应管（mL）对照管（mL）50mMPBS(pH7.8)1.71.760mMH2O20.20.2酶液0.1等体积PBS代替总体积221.3.4三种小麦MDA含量测定采用硫代巴比妥酸-TBA法测定MDA活性REF_Ref10852\r\h[9]。5个浓度梯度处理中每组3次重复，每组重复测定需5支样品管和1支对照管（“无酶液”中加入5%TCA和0.67%TBA）分别按照表4依次加入以下试剂。当环境处于高温且酸性（pH值为3.5）状态时，MDA会与TBA发生化学反应，生成一种红棕色的TBA-MDA复合物，这种复合物在波长532nm的光下吸收能力最强。由于植物组织中可能存在糖类等干扰物，需在600nm处测定背景值，并在450nm处进行校正。试剂依次加入，反应管和对照管都应在沸水浴15min后，立即冰浴冷却终止反应，5000rpm离心5min，取上清测吸光度REF_Ref11009\r\h[10]。MDA浓度的计算公式：CMDA活性(umol/L)=6.45×（OD532－OD600）－0.56×OD450MDA含量的计算公式：MDA含量(nmol/g)=（CMDA×V）/m×V1表4.小麦叶片和根系MDA测定的反应体系试剂反应管(mL)对照管(mL)0.67%TBA（含5%TCA）11酶液11总体积221.4数据的处理将SOD、POD、CAT、MDA记录的各数据带入到相应的计算公式，分别计算出三种酶活性数值和丙二醛含量数值。将SOD、POD、CAT、MDA计算的各数据使用WPSOfficeExcel软件输入处理，使用Word软件绘制相应的图表，使用SPSSAU统计分析软件进行方差分析和显著性测验，分析不同镉浓度处理对小麦叶片和根系抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响REF_Ref11251\r\h[11]。2.结果与分析2.1三种小麦幼苗SOD酶活性比较2.1.1镉胁迫下对三种小麦叶片和根系SOD酶活性的影响如图1、图2所示，从整体上来看，随着镉离子浓度的逐渐增加，三种小麦的叶片和根系的SOD活性变化均为先升后降。在镉离子胁迫下，洛麦49的SOD活性曲线在周麦36和洛麦42之上，显示在这一生理指标上洛麦49表现更佳。周麦36、洛麦42和洛麦49均在0.6mmol/L的镉离子浓度处理下，叶片和根系SOD酶活性出现峰值分别为459.1U/g、452.9U/g；454.5U/g、460.1U/g；477.7U/g、463.9U/g。图1.不同镉离子浓度处理下三种小麦叶片SOD活性均值比较图2.不同镉离子浓度处理下三种小麦根系SOD活性均值比较2.1.2三种小麦叶片和根系中SOD酶活性方差分析表5.三种小麦叶片SOD酶活方差分析表6.三种小麦根系SOD酶活方差分析注：小写字母表示α=0.05；大写字母表示α=0.01SPSS软件对数据处理分析，邓肯式比较结果在表5、表6中所示：对同一镉离子浓度下不同品种小麦方差分析可以得出，各品种间差异显著，故洛麦49较之周麦36和洛麦42的SOD活性更高，品种较佳；而三种小麦叶片和根系中SOD酶活性，在不同浓度镉离子胁迫处理之间存在着显著差异。2.2三种小麦幼苗POD酶活性比较2.2.1镉胁迫下对三种小麦叶片和根系POD酶活性的影响如图3、图4所示，从整体上来看，三种小麦品种的叶片和根系中的POD酶活性随着镉离子浓度的逐步增加均呈现出先升后降的趋势，且均在0.4mmol/L镉胁迫处理下，POD酶活性有最大值。在镉离子胁迫下，洛麦49的POD活性曲线在周麦36和洛麦42之上，且周麦36的POD活性曲线高于洛麦42，显示在这一生理指标上洛麦49表现更佳。三种小麦品种洛麦49、周麦36、洛麦42的叶片和根系的POD酶活在0.4mmol/L出现峰值，分别为701.15U/g、709.93U/g；693.26U/g、696.60U/g；679.93U/g、685.49U/g。图3.不同镉离子浓度处理下三种小麦叶片POD活性均值比较图4.不同镉离子浓度处理下三种小麦根系POD活性均值比较2.2.2三种小麦叶片和根系中POD酶活性方差分析表7.三种小麦叶片POD活性方差分析表8.三种小麦根系POD活性方差分析注：小写字母表示α=0.05；大写字母表示α=0.01。SPSS软件对数据处理分析，邓肯式结果在表7、表8中所示：对同一镉离子浓度下不同品种小麦方差分析可以得出，洛麦49较之POD活性更高，品种较佳；而三种小麦叶片和根系中POD酶活性，在不同浓度镉离子胁迫处理之间存在着显著差异。2.3三种小麦幼苗CAT酶活性比较2.3.1镉胁迫下对三种小麦叶片和根系CAT酶活性的影响如图5、图6所示，从整体上来看，随着镉离子浓度的逐渐增加，三种小麦的叶片和根系的CAT活性变化均为先升后降。在镉离子胁迫下，洛麦49的CAT活性曲线在周麦36和洛麦42之上，且周麦36的CAT活性曲线高于洛麦42，显示在这一生理指标上洛麦49表现更佳。三种小麦品种洛麦49、周麦36、洛麦42的叶片和根系的CAT酶活在0.4mmol/L出现峰值，分别为701.15U/g、709.93U/g；693.26U/g、696.60U/g；679.93U/g、685.49U/g。图5.不同镉离子浓度处理下三种小麦叶片CAT活性均值比较图6.不同镉离子浓度处理下三种小麦根系CAT活性均值比较2.3.2三种小麦叶片和根系中CAT酶活性方差分析表9.三种小麦叶片CAT酶活方差分析表10.三种小麦根系CAT酶活方差分析注：小写字母表示α=0.05；大写字母表示α=0.01。SPSS软件对数据处理分析，邓肯式比较结果在表9、表10中所示：对同一镉离子浓度下不同品种小麦方差分析可以得出，洛麦49较之CAT活性更高，品种较佳；而三种小麦叶片和根系中CAT酶活性，在不同浓度镉离子胁迫处理之间存在着显著差异。2.4三种小麦幼苗MDA含量比较2.4.1镉胁迫下对三种小麦叶片和根系丙二醛含量的影响如图7、图8所示，从整体上来看，随着镉离子浓度的逐渐增加，三种小麦叶片和根系中的丙二醛含量均逐渐增加。在镉离子胁迫下，洛麦42的MDA含量曲线在周麦36和洛麦49之上，且周麦36的MDA含量曲线高于洛麦49，显示在这一生理指标上洛麦49数值普遍偏小，其表现更佳。三种小麦品种在0mmol/L镉离子浓度时，其叶片和根系中丙二醛含量均在0-3nmol/g正常范围内；在有镉离子胁迫下，其叶片和根系中丙二醛含量均在3-10nmol/g范围内变化。图7.不同镉离子浓度处理下三种小麦叶片MDA含量均值比较图8.不同镉离子浓度处理下三种小麦根系MDA含量均值比较2.4.2三种小麦叶片和根系中丙二醛含量方差分析表11.三种小麦叶片MDA含量方差分析注：小写字母表示α=0.05；大写字母表示α=0.01。表12.三种小麦根系MDA含量方差分析注：小写字母表示α=0.05；大写字母表示α=0.01。SPSS软件对数据处理分析，邓肯式比较结果在表11、表12中所示：对同一镉离子浓度下不同品种小麦方差分析可以得出，洛麦42较之MDA含量更高，品种最差；而三种小麦叶片和根系中MDA含量，在不同浓度镉离子胁迫处理之间存在着显著差异。3.讨论本次试验发现，经镉离子梯度处理后，三种小麦叶片与根系中的SOD、POD和CAT活性均表现出先升高后降低的变化规律。其中，SOD活性在0.6mmol/L镉离子浓度时达到最高，POD和CAT活性则在0.4mmol/L浓度时达到峰值。这一变化揭示了小麦在应对镉胁迫时的抗氧化防御机制及耐受限度。同时，随着镉离子浓度增加，小麦叶片和根系中MDA含量持续上升，表明镉胁迫导致的膜脂过氧化损伤不断加剧，该结果与前人研究一致REF_Ref11871\r\h[14]。从作用机制看，镉离子进入小麦细胞后，干扰光合作用与呼吸作用的电子传递过程，促使O2-、H2O2等ROS大量积累。在低浓度镉胁迫阶段，细胞启动抗氧化防御系统：SOD首先将O2-转化为H2O2，这为抵御ROS的第一道防线；随后，POD利用抗坏血酸等还原剂，CAT则直接催化过氧化氢分解为水和氧气，共同清除细胞内多余的过氧化氢，避免其转