DB54T-高原土著鱼类感染线虫的诊断技术规范

ICSFORMTEXT65.150FORMTEXTB52DBFORMTEXT54DBFORMTEXT54/FORMTEXTT—FORMTEXTXXXXFORMTEXT     FORMTEXT高原土著鱼类感染线虫的诊断技术规范FORMDROPDOWNFORMTEXT（本稿完成日期：20260407）FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施FORMTEXT西藏自治区市场监督管理局   发布DB54/T—XXXX目  次TOC\o"1-3"\h\u19539目  次 I16238前言 II25624高原土著鱼类感染线虫的诊断技术规范 1256291范围 187522规范性引用文件 1217593术语和定义 130394样品采集与处理 2305195诊断技术 2231566结果判定 43648附录A（规范性）病原学诊断试剂配制方法 531530附录B（资料性）寄生部位 61386附录C（资料性）线虫病原形态特点 814180附录D（资料性）线虫分子生物学诊断引物及基因序列 12前言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第一部分标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及到专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院水产科学研究所。本文件主要起草人：潘瑛子、杨欣兰。高原土著鱼类感染线虫的诊断技术规范范围本文件规定了青藏高原土著鱼类感染线虫的术语和定义、样品采集与处理、诊断技术、结果判定的要求。本文件适用于青藏高原水域裂腹鱼亚科（Schizothoracinae）、鮡科（Sisoridae）和鳅科（Cobitidae）土著鱼类的野生及养殖群体中，嗜子宫线虫（Philometrasp.）、杆咽线虫（Rhabdochonaspp.）、对盲囊线虫（Contracaecumspp.）、束首线虫（Streptocaraspp.）四种线虫感染的诊断与结果判定。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SC/T7011.1水生动物疾病术语与命名规则第1部分：水生动物疾病术语WS/T10015.5公共卫生检测与评价实验室常用名词术语标准第5部分：分子生物学检测GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义SC/T7011.1、WS/T10015.5界定的以及下列术语和定义适用于本文件。高原土著鱼类自然分布于青藏高原水域，经长期演化形成的特有原生鱼类。本文件特指裂腹鱼亚科、鮡科、鳅科鱼类。线虫感染指由隶属于线虫纲（Nematoda）的嗜子宫线虫、杆咽线虫、对盲囊线虫、束首线虫，以幼虫或成虫形态寄生于青藏高原土著鱼类腹腔、肠道外壁及其脂肪组织、消化道所引起的寄生虫病。样品采集与处理仪器与耗材体视显微镜、手术剪、手术刀、托盘、培养皿或六孔板、玻璃板、乳胶手套、塑料吸管、尖头镊子。试剂与溶液0.65%生理盐水：按照附录A.1配制。70%乙醇：按照附录A.2配制。虫体采集4.3.1用手术剪从泄殖孔向前剪开鱼腹，采集腹腔内蠕动的线虫。4.3.2完整取出肠道，采集肠道外壁及脂肪组织上可见的白色蠕动线虫或透明包囊。挑取含虫体的脂肪组织置于玻璃板上，在体视显微镜下进一步分离虫体。4.3.3剪开肠道，用手术刀刮取肠内容物及肠壁黏液，置于玻璃板上，以另一玻璃板按压延展，在体视显微镜下采集其中的线虫和包囊。4.4样品保存将采集到的虫体放入装有0.65%生理盐水的培养皿或六孔板中，用塑料吸管反复吹吸清洗。用于形态学诊断的样品应立即观察；用于分子生物学诊断的虫体应保存于无水乙醇（≥99.5%）中。诊断技术5.1肉眼诊断5.1.1寄生于腹腔，体长在3.0厘米以上，身体略透明且带血色，两端钝圆的线虫可诊断为嗜子宫线虫感染。见附录B.1。5.1.2寄生于消化道，体白色，体型细长，体长1.0厘米以上的线虫可诊断为杆咽线虫感染。5.1.3寄生于鱼类肠道外壁及其脂肪组织、消化道内，体白色，体型较粗壮，两端尖细且中部膨大的可诊断为对盲囊线虫感染。见附录B.2。5.1.4以幼虫或包囊寄生于鱼类肠道外壁及其脂肪组织、消化道内，体型较小，两端钝圆，体色较透明的可诊断为束首线虫感染。5.2光学显微镜诊断5.2.1将用于形态学鉴定的虫体置于载玻片上，滴加0.65%生理盐水，加盖玻片轻压并排出气泡，于显微镜下观察。5.2.2典型嗜子宫线虫的形态见附录C.1。虫体圆筒状，两端钝圆，体表光滑无乳突；从顶面观察，头部呈三棱形。5.2.3典型杆咽线虫的形态见附录C.2。虫体细长，体表光滑；有漏斗状口囊和细长的咽；雄虫肛前乳突9~11对，交合刺不等长；雌虫尾部直而尖细，阴门位于身体中后部。5.2.4典型对盲囊线虫的形态见附录C.3。体表覆盖环纹；头部具三个明显的唇，尾部较尖，泄殖孔开口于尾部。5.2.5典型束首线虫的形态见附录C.4。虫体两端钝圆，体表覆盖环纹；头部有突起，泄殖孔位于尾部。5.3分子生物学诊断5.3.1仪器与耗材离心机、恒温水浴锅、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像分析仪、移液枪及枪头。5.3.2试剂与溶液rTaq聚合酶，2×PCR缓冲液（含Mg²⁺，dNTPplus），DNA提取试剂盒，DNAMarker，1×TAE电泳缓冲液，1.0%琼脂糖凝胶，阳性对照，空白对照，通用引物。5.3.3线虫DNA提取取4.3采集的虫体，使用DNA提取试剂盒，按照说明书提取样品DNA，-20℃保存。5.3.4PCR反应体系按表1配制反应体系，同时设置空白对照和阳性对照。组分1个检测体系加入量/μLrTaq聚合酶（250U）0.52×PCR缓冲液（含Mg²⁺，dNTPplus）10上游引物0.6下游引物0.6DNA模板1双蒸水（ddH2O）7.3总体积205.3.5扩增条件94℃预变性2min。循环40次：94℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸（1min/kb）。最后68℃终延伸10min。5.3.6凝胶电泳及成像用1×TAE电泳缓冲液配制1.0%琼脂糖凝胶（含100μL/L荧光染料）。电泳槽中加入缓冲液，液面没过胶面。取5μLPCR产物加入样品孔，以DNAMarker2000为对照，120V电泳0.5h。凝胶成像仪下观察、拍照并记录结果。5.3.7测序检测到目的条带，将扩增产物送公司测序后与附录D.2~D.5中线虫序列进行比对，确认为一致性达99%以上的线虫。6结果判定6.1线虫感染符合以下任一情况，判定为线虫感染：5.2肉眼诊断或5.3光学显微镜诊断为阳性；5.4分子生物学诊断为阳性，且测序比对确认。6.2线虫未感染结合5.2肉眼诊断、5.3光学显微镜诊断和5.4分子生物学诊断结果，全部为阴性，则判定为未感染线虫。附录A（规范性）病原学诊断试剂配制方法A.10.65%生理盐水称取6.5gNaCl，溶于纯水并定容到1000ml，室温保存。A.270%乙醇量取700ml无水乙醇，加入300ml纯水，混匀，室温保存。附录B（资料性）寄生部位B.1寄生腹腔的嗜子宫线虫B.2寄生于肠道外壁及脂肪组织的对盲囊线虫附录C（资料性）线虫病原形态特点C.1嗜子宫线虫1——整体形态；2——头部顶端，标尺=30μm；3——头部，标尺=500μm；4——尾部，标尺=500μm；C.2杆咽线虫1——头部，上下箭头分别示漏斗状的口囊和细长的咽，标尺=20μm；2——雄虫尾部，箭头示长短不一的交合刺，标尺=20μm；3——雌虫尾部，标尺=20μm；4——阴门，箭头所示，标尺=2μm；C.3对盲囊线虫1——头部，箭头示唇，标尺=20μm；2——尾部，箭头示泄殖孔，标尺=20μm。C.4束首线虫1——头部，箭头示突起，标尺=20μm；2——尾部，箭头示泄殖孔，标尺=20μm。附录D（资料性）线虫分子生物学诊断引物及基因序列D.1线虫通用引物（18SrRNA）上游引物：GMCTACCATGGTTGTAACGG（注：M=A或C，为简并碱基）下游引物：GCTATTGGAGCTGGAATTACCGD.2嗜子宫线虫18SrDNA序列CGGGTAACGGAGAATAAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACTTCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCTCAGCACAGAGGAGGTAGTGACGAAAAATAACGAGACCGTACTCGATGAGGCCGGTTATCGGAATGGGTAAAATTTAAACCCGTTAACGAGGATCTATGAGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCTCAAAGTGTATATCGGCATTGCTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCAGCCTTACGACGTGGTCCATTCATTGAATGCGAACTACGCCTCGTAGGCTATTTTGATGTTGGTTTTTCCTTATGTTGCTCTCATCGGCTGCGTAAGGTGGCTAACGAGTTTACCTTGAAAAAATTAGAGTGCTCAACGCGGGCTAACGCCTGAATACTCGTGCATGGAATAATGGAATAGGATCTCGGTTCTATTTTGTTGGTTTTCTGATCTGAGATAATGGTTAAGAGGGACAGACGGGGGCATTCGTATCGCTGCGTGAGAGGTGAAATTCTTGGACCGTAGCGAGACGTCCCACTGCGAAAGCATTTGCCAAGAATGTCTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCAGAGGTTCGAAGGCGATCAGATACCGCCCTAGTTCTGACCGTAAACGATACCAACTAGCGTTCCGTCAGCAGTAATTACGCCTTGACGGGCAGCTTTCCGGAAACGAAAGTTTTTCGGTTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTGACTCAACACD.3杆咽线虫18SrDNA序列GTTGTAACGGGTAACGGAGAATAAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCTCGGCATGAGGAGGTAGTGACGAAAAATAACGAGACCGTTCTCTTCGAGGCCGGTTATCGGAATGGGTACAATTTAAACCCGTTAACGAGGATCTATGAGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCTCAAAGTGTATATCGTCATTGCTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATCTGCGCCTCAGGACCCGGTCCGTCCATTGGACGAGAACTGGGCGCCTGGGCTATACACTGTCGGTTTTCGCAGCGTTTCCTTAACCGGACGCGCTGTGTGGCCGGCGAGTTTACCTTGAAAAAATTAGAGTGCTCAAAGCGGGCCTACGCCTGAATACTCGTGCATGGAATAATGGAATAGGATCTCGGTTCTATTTTGTTGGTTTTCTCAACTGAGATAATGGTTAAGAGGGACAGACGGGGGCATTCGTATCGCTGCGTGAGAGGTGAAATTCTTGGACCGTAGCGAGACGCCCGACTGCGAAAGCATTTGCCAAGAATGTCTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCAGAGGTTCGAAGGCGATCAGATACCGCCCTAGTTCTGACCGTAAACGATACCAACCAGCGTTCCGTCGGTGGTAATTACGCCTTGACGGGCAGCTTCCCGGAAACGAAAGTTTTTCGGTTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTCACCTGGCCCGGACACCGTGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCD.4对盲囊线虫18SrDNA序列CAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCTCGGCAAGAGGAGGTAGTGACGAAAAATAACGAGACCGTACTCTTTGAGGCCGGTTATCGGAATGGGTACAATTTAAACCCGTTAACGAGGATCTATGAGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCTCAAAGTGTATATCGTCATTGCTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATCTGCGCCTCAGGACTTGGTCCGCCCACTGGGCGAGAACTAGGCTCCTGGGCTAGTTCTGCTGGTTTTCTCTACGTTGCCTTCATCGGTCGCGTAGGGTGGCTAGCGAGTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGCTTCACGCGAGCTTATGTCTGAATACTCGTGCATGGAATAATAGAATAGGATCTCGGTTCTATTTTGTTGGTTTTCTGATCTGAGATAATGGTTAAGAGGGACGGACGGGGGCATTCGTATCGCTGCGTGAGAGGTGAAATTCTTGGACCGTAGCGAGACGCCCGACTGCGAAAGCATTTGCCAAGAATGTCTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCAGAGGTTCGAAGGCGATCAGATACCGCCCTAGTTCTGACCGTAAACGATACCAACTAGCGTTCCGTCGGCGGTAAATACGCCTTGACGGGCAGCTTCCCGGAAACGAAAGTCTTTCGGTTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTCACCTGGCCCGGACACCGTGAD.5束首线虫18SrDNA序列CGGGTAACGGAGAATAAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCTCGGCATGAGGAGGTAGTGACGA