1精讲册第24章　基因工程

第24章基因工程目录第1节重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取

考点清单

即练即清

考法清单第2节PCR和电泳

考点清单

即练即清

考法清单第3节基因工程的基本操作程序和蛋白质工程

考点清单

即练即清

考法清单提升提升提升第1节重组DNA技术的基本

工具和DNA的粗提取提升一、重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)来源主要是原核生物作用具体作用识别并切割双链DNA分子的特定核苷酸序列作用化学键磷酸二酯键作用结果限制酶切割DNA分子产生的末端通常有两种形式(如图所示):

“分子缝合针”——DNA连接酶作用将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键分类E.coliDNA连接酶来自大肠杆菌,连接互补的黏性末端和平末端的DNA片段,但连接平末端NDA片段的频率远低于T4DNA连接酶T4DNA连接酶来自T4噬菌体,连接互补的黏性末端和平末端的DNA片段“分子运输车”——基因载体作用将目的基因导入受体细胞种类质粒(最常用)定义裸露的(不与组蛋白结合)、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子结构特点具有复制原点(在细胞中能够自我复制)、标记基因(便于重组DNA分子的筛选)、一个至多个限制酶切割位点(供目的基因插入)其他载体噬菌体、动植物病毒等知识拓展(1)同尾酶是指识别DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割产生相同末端的限

制酶,如图。

由同尾酶产生的黏性末端,能够通过碱基互补配对彼此连接,可用于基因表达载体的构

建。(2)限制酶不切割原核生物自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别

序列或识别序列已经被修饰。(3)天然的质粒一般不完全具备载体的条件,往往需要进行人工改造后才能用作基因工程的载体。错DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成,但DNA连接酶连接两个

DNA片段,DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有核酸片段3'端。小表达[2024全国甲,38(2)]质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在

(答出两点即可)。避免载体自连,保证目的基因连接方向正确二、DNA的粗提取实验原理粗提取(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质;(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2mol/L的NaCl溶液鉴定DNA+二苯胺试剂

蓝色实验步骤

注意事项(1)过滤时应选用纱布而不是滤纸,如果用滤纸,可能会把DNA分子吸附在滤纸上。(2)沉淀时用等体积、预冷的体积分数为95%的酒精,主要是低能防止DNA酶降解DNA。(3)粗提取的DNA中可能含有核蛋白、多糖等杂质小表达(2023广东,11改编)DNA鉴定时,DNA溶液加入二苯胺试剂后

(填“会”

或者“不会”)立即呈现蓝色,原因是

。不会

将二苯胺试剂加入DNA溶液后,需要沸水浴加热,溶液才能呈现蓝色真题选改判即练即清1.(2024贵州,13)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。

(

)2.(2021全国乙,38)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键

是磷酸二酯键。

(

)√√从真题到教材3.限制酶能够识别

,并且使每一条链中特定部位的

断开(选必3P71)。载体上有特殊的标记基因,便于

(选必3P72)(2022广东,22)(2021全国乙,38)。双链DNA分子的特定核苷酸序列磷酸二酯键重组DNA分子的筛选4.DNA粗提取与鉴定(1)实验中涉及的主要试剂及作用:体积分数为95%的冷酒精溶液能溶解

,提取

DNA;DNA在不同浓度的NaCl溶液中

不同,它能溶于2mol/L的NaCl溶液(选必

3P74)(2024安徽,14)(2022山东,13)。(2)鉴定:在

条件下,DNA遇

呈现蓝色(选必3P74—75)(2023广东,11)(2022山东,13)。蛋白质溶解度沸水浴二苯胺试剂限制酶的酶切分析典例

(2025届佛山石门中学月考,13)限制酶是基因工程中必需的工具之一,如表表示

五种限制酶的识别序列及切割位点。下列关于限制酶的叙述,错误的是

(

)限制酶EcoRⅠBamHⅠSau3AⅠMfeⅠEcoRⅤ切割位点

A.EcoRⅠ和EcoRⅤ切割DNA片段产生的末端分别为黏性末端和平末端B.EcoRⅠ和MfeⅠ切割产生的DNA片段能被E.coliDNA连接酶连接在一起C.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割产生的DNA片段,连接后一定能被BamHⅠ切割D.以上五种限制酶均能识别双链DNA的特定序列,并切开特定部位的磷酸二酯键答案

C

解析

根据表中切割位点可知,EcoRⅠ和EcoRⅤ切割DNA片段产生的末端分别为黏性末端

和平末端,A正确;根据表格可知,EcoRⅠ和MfeⅠ切割产生的黏性末端相同,故EcoRⅠ

和MfeⅠ切割产生的DNA片段能被E.coliDNA连接酶连接在一起,B正确;BamHⅠ切割

,Sau3AⅠ切割

,二者切割后产生的黏性末端是相同的,因此二者切割后产生的黏性末端能够相连,连接后仍然存在

序列,能被Sau3AⅠ切割,但是不一定存在

序列,故不一定能被BamHⅠ切割,

C错误。

知识归纳限制酶识别的序列分析(1)同尾酶:识别DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割产生相同末端的限制酶。不同限制酶识别的碱基序列一般不同,但若切割后所产生的黏性末端是一样的,二者切

割后产生的黏性末端能够相连。如BamHⅠ和Sau3AⅠ切割后产生的黏性末端都是5'-

GATC-3';EcoRⅠ和MfeⅠ切割后产生的黏性末端都是5'-AATT-3'。(2)回文序列:限制酶识别的序列大多数为回文序列(由反向重复方式组成的DNA序

列。其5'到3'序列和其互补链的5'到3'序列完全相同)。若切割位点在识别序列(回文序

列)的中心轴线两侧,产生的末端为黏性末端,且形成的2个末端是相同的,也是互补的,如EcoRⅠ、BamHⅠ、Sau3AⅠ和MfeⅠ;若切割位点在识别序列中心轴线上,则产生平末端,如EcoRⅤ。变式

(同知识不同角度)(双酶切、酶切位点的连接)(2023新课标,6,6分)某同学拟用限

制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识

别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点

如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是

(

)A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coliDNA连接酶连接C解析

酶4切割位点位于抗生素抗性基因(标记基因),酶切后会破坏标记基因,D不符合题

意;酶3切割后产生平末端,E.coliDNA连接酶连接平末端的DNA片段的效率远低于T4

DNA连接酶,A不符合题意;若用酶3切割质粒、酶1切割目的基因,两者产生的末端无法

连接在一起,B不符合题意;酶1和酶2切割后产生不同的黏性末端,T4DNA连接酶既可

连接黏性末端,也可连接平末端,若用酶1和酶2同时切割质粒和目的基因,并用T4DNA

连接酶连接,则既可避免质粒和目的基因的自身环化,又能保证目的基因正确插入质粒,

C符合题意。第2节PCR和电泳提升一、PCR(聚合酶链式反应)原理DNA半保留复制和DNA的热变性PCR的条件模板含有待扩增序列的基因组DNA或从mRNA反转录来的cDNA原料四种游离的脱氧核苷酸或脱氧三磷酸核苷(dNTP)引物一般为根据目的基因两端序列设计的能与之互补配对的短单链核酸片段(一般需要选择2种引物分别扩增两条模板链)酶耐高DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)缓冲液需含有Mg2+,以激活DNA聚合酶PCR的步骤和结果

鉴定一般采用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定PCR的产物错(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作

为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。(2)引物是一小段单链的DNA或RNA,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,

使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。小表达(选必3P77改编)PCR技术操作中为什么需要用2种不同的引物?

。 DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链构成,PCR扩增时只能从各自模板链的3'端开始,故需碱基序列不同的2种引物二、琼脂糖凝胶电泳电泳的相关原理(1)电泳:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极某著名企业。(2)迁移速率:在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关,一般DNA分子越大,迁移速率越慢,距离加样孔越近。(3)电泳鉴定结果的观察:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来电泳结果及初步分析电泳结果示意图(常规结果)

电泳结果及初步分析结果初步分析根据条带位置判断DNA分子大小(1)泳道1为Marker,由一些分子大小已知的DNA片段组成,可以作为电泳结果中的参考系,以反映出待测片段的分子大小。如泳道4中的DNA片段介于3000bp~5000bp。(2)当DNA构象相同、电泳条件基本一致时,相对分子质量大的DNA分子迁移速率较小,相对分子质量小的DNA分子迁移速率较大,故泳道3的片段①的相对分子质量>片段②的相对分子质量根据电泳条带判断限制酶酶切位点数量泳道2和泳道3为同一个质粒经不同限制酶处理得到的结果。泳道2只

有1条条带,说明质粒含0或1个相应限制酶切割位点。泳道3含2条条带,说明质粒含2个相应限制酶切割位点。假设泳

道2中DNA分子为4800bp,则泳道3中DNA分子的大小分别为3000bp

(片段①)和1800bp(片段②)知识拓展(1)PCR扩增后电泳结果异常分析异常分析内容未出现扩增条带的可能原因模板DNA含有杂蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制剂;TaqDNA聚合酶失活;引物出现质量问题;引物浓度不合适;Mg2+浓度过低;变性低;变性时间过短等出现非特异性扩增条带的可能原因模板DNA出现污染;TaqDNA聚合酶出现质量问题;引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体;Mg2+浓度过高;复性时的低;PCR循环次数过多等(2)常见电泳种类:琼脂糖凝胶电泳——常用于鉴定核酸片段;聚丙烯酰胺凝胶电泳——

常用于蛋白质分析。真题选改判即练即清1.(2024广东,4)RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明。

(

)解析耐高DNA聚合酶的发现促进PCR技术的成熟。

2.(2024黑、吉、辽,7)在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快。

(

)解析DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在同一电场作用下,DNA片段不一定向负极迁移,一般情况下,DNA片段越长某著名企业速率越慢。××3.(2024河北,13)利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结

果。(

)4.(2023福建,4)PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理。

(

)解析为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验时使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理,但移液器不需要。

5.(2022辽宁,12)PCR延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。

(

)解析由于耐高DNA聚合酶只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故延伸过程中需要引物参与。

√××从真题到教材6.PCR技术需要

作为原料,通过

方式打开DNA双链,利用

催化合成DNA子链,同时要加入一对引物,引物的作用是

(选必3P77)(2022广东,22)(2024河北,13)(2023浙江6月选考,19)(2022天津,15)(2022辽宁,12)(2021湖北,16)(2021全国甲,38)。4种脱氧核苷酸加热

耐高DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸

7.PCR的产物一般通过

来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与

、DNA分子的

和

等有关(选必3P84)(2024湖南,15)(2024黑、吉、辽,7)。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度大小构象一、PCR引物的设计和选择引物的特点(1)是一段短单链核酸,且能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。(2)一般引物的5'端可以被修饰,而3'端需与DNA模板链严格互补配对,故不可被修饰。5'端常见的修饰:加酶切位点、加荧光标记、引入突变位点等。(3)PCR过程中,引物一般成对存在且成对的引物不能碱基互补配对,避免引物之间发生自连判断引物的方向(1)判断引物的3'端、5'端:引物与DNA模板链的3'端互补,方向相反;(2)DNA复制从引物的3'端继续向前进行;(3)由此可知,甲、乙、丙、丁四个引物的扩增方向如图1所示图1根据扩增目的选择引物(1)若扩增目的基因序列,则应选择图1中的引物乙、丙;(2)若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点,应设计一个引物与目的基因外部序列(即质粒序列)碱基互补配对,另一个引物与目的基因序列碱基互补配对,如图2所示的引物1、2图2典例1

(2024届汕头金山中学三模,16)巢式PCR是指先后用外、内引物扩增目的基因

的方法。其原理为:先以比目的基因大的DNA片段为模板,用外引物(F1、R1)进行扩

增,获得大量含目的基因的中间产物,再以扩增后的中间产物为模板,用内引物(F2、R2)

扩增目的基因,如图所示。下列说法错误的是

(

)

A.两对引物的碱基序列不相同,但均应为单链DNA片段B.第二次PCR能否进行,是对第一次PCR正确性的鉴定C.由于和两套引物都互补的靶序列较少,该技术可大大提高扩增的特异性D.如果两套引物一起加入反应体系中,外引物的复性显著低于内引物答案

C

解析

外引物和内引物两对引物的碱基序列不能相同,以防减小PCR扩增的特异性,但两对引

物均应为单链DNA片段,以便与模板互补配对,A正确;第二次PCR使用内引物(F2、R2)

以第一次PCR的产物为模板进行再次扩增,所以第二次PCR能否进行,是对第一次PCR

正确性的鉴定,B正确;DNA具有特异性,同时和两套引物同时都互补的DNA(靶序列)较

少,所以该技术可大大提高扩增的特异性,将需要的目的基因扩增出来,C正确;通常在一

定范围内,PCR引物片段较长的,则需较高退火增强扩增的特异性,根据题干信息

可知,巢式PCR是先用外引物扩增,然后再用内引物扩增目的基因的方法,如果两套引物

一起加入反应体系中,外引物长度应大于内引物长度,复性高于内引物,使外引物

先进行反应,D错误。变式1

(同知识不同角度)(引物的序列)(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长

度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切

(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是

(

)

A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶答案B

解析

由于引物只能引导子链从5'到3'合成,分析图中扩增获得的DNA片段可知,其中一个引

物序列为5'-TGCGCAGT-3',A正确;根据三种限制酶的识别序列和酶切后的DNA片段

左右侧的黏性末端可知,步骤①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ,B错误;用步骤①的两种酶对

载体进行酶切,至少切断2处,切割之后至少获得了2个片段,C正确;图中形成的是黏性末

端,E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶均可连接黏性末端,D正确。二、电泳图像分析根据电泳方向和条带的位置可判断DNA分子的大小,一般DNA分子越大,迁移速率越

慢,距离点样孔越近。典例2

(2025届广东六校联考,15)双脱氧末端终止测序法(Sanger法)是第一代DNA测

序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和1种ddNTP进行PCR,PCR产物变性后利用电

泳进行分离,根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对

照个体DNA模板链的一段碱基序列,结果如图所示。下列叙述正确的是

(

)

注:双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)有ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP四种;脱氧核苷三磷

酸(dNTP,PCR的原料)有dATP、dGTP、dTTP、dCTP四种。在DNA聚合酶作用下,

ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点,若连接上的是ddNTP,子链延伸终止;若连接上的是dNTP,子链延伸继续。A.PCR过程中需要解旋酶和DNA聚合酶,不需要DNA连接酶B.沿电泳方向,核苷酸链长度逐渐增大C.对照个体DNA模板链序列为:5'-CTACCCGTGAT-3'D.患者该段序列中某位点的碱基G突变为A答案

D

解析

电泳图分析:

PCR过程中利用高变性,使DNA解螺旋,因此PCR扩增中不需要解旋酶,PCR过程中需要DNA聚合酶,A错误;由电泳图分析可知,患者测序序列中某位点的碱基C突变为

T,由于C—G、T—A配对,则实际患者该段序列中某位点的碱基G突变为A,D正确。

变式2

(同知识不同角度)(PCR产物电泳结果分析)(2023浙江6月选考,19,2分)某研究

小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如

图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得

Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1

和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。

下列叙述正确的是

(

)A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子B解析

从图甲可知GFP和Gata3基因使用同一个启动子,故Gata3基因的启动子同时控制GFP

和Gata3基因的表达,A错误;由于启动子区在左侧,基因的编码区在右侧,因此转录的方

向是从左到右,mRNA的5'端为Gata3基因,3'端为GFP基因,因此翻译时先合成Gata3蛋

白,B正确;大片段可代表Gata3-GFP基因,小片段可代表Gata3基因,因此2号为Gata3-GFP

基因纯合子,4号为野生型,C错误;若用引物1和引物3进行PCR,因为引物3需要与GFP编

码区结合才能发挥作用,所以Gata3基因无法扩增,融合基因的纯合子的杂合子扩增出

的片段相同,不利于区分纯合子和杂合子,D错误。第3节基因工程的基本操作

程序和蛋白质工程提升一、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取目的基因用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是指编码蛋白质的基因(也可能是基因调控序列等)筛选合适的目的基因(1)对于未知序列要进行测序及蛋白质功能的鉴定;(2)利用序列数据库和序列比对工具等,筛选结构和功能已知的基因获得目的基因的途径(1)从中获取目的基因;(2)利用PCR获取和扩增目的基因;(3)通过蛋白质工程改建目的基因2.基因表达载体的构建(基因工程的核心步骤)构建目的(1)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;(2)使目的基因能够表达和发挥作用基因表达载体的组成

启动子的分类组成型启动子在多数或全部组织中保持持续的驱动转录活性诱导型启动子受外界化学或物理信号调控驱动下游基因转录,如乳糖操纵子特异型启动子具有组织特异性(在特定的组织或器官中驱动下游基因转录)或者发育时期特异性(在特定发育时期驱动下游基因转录),如水稻胚乳细胞启动子构建基因表达载体过程示意图

错启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比

启动子终止子起始密码子终止密码子位置DNADNAmRNAmRNA作用RNA聚合酶识别和

结合的部位,驱动基

因的转录使转录停止翻译的起始信号

(编码氨基酸:甲硫

氨酸)翻译的结束信号

(一般不编码氨基

酸)知识拓展(1)标记基因的常见类型及相应筛选方法标记基因常见类型筛选方法标记基因为抗生素的抗性基因(1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果目的基因插入某种抗生素抗性基因,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图,目的基因插入了四环素抗性基因,则四环素抗性基因失活。

(2)处理后的细菌有:未导入质粒的细菌、含重组质粒的细菌、含空质粒的细菌。(3)筛选方法:将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌或含空质粒的细菌,如图中1、2、3、4、5菌落,再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即含有目的基因的导入了重组质粒的菌落,如图中1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。标记基因常见类型筛选方法标记基因为必需营养物质合成基因基因表达载体上携带某种必需营养物质的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组分。将细胞在不含有此营养组分的培养基中培养,存活的便

是转化成功的细胞标记基因为报告基因[如绿色荧光蛋白(GFP)基因]基因表达载体上携带的GFP基因表达的绿色荧光蛋白,在一定条件下可发出绿色荧光。将携带该标记基因的重组质粒导入细胞后,若细胞可发出绿色荧光,则说明转化成功(2)对空质粒的筛选——蓝白斑筛选法:载体上携带有抗生素抗性基因及lacZ基因。

lacZ基因表达产物可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。该载

体上仅在lacZ基因中存在目的基因插入位点,若目的基因插入lacZ基因,则lacZ基因失

去相应功能。在大肠杆菌的培养基中加入相应抗生素和X-gal后,未导入质粒的菌株不

能生长,白色的菌落便是成功导入目的基因的大肠杆菌,呈现蓝色的菌落则是转入空质

粒的大肠杆菌。3.将目的基因导入受体细胞受体细胞的种类及方法植物细胞花粉管通道法使目的基因借助花粉管通道进入胚囊农杆菌转化法农杆菌能够将其环状质粒上的一段特殊DNA转移并整合到受体细胞的基因组中,并使之携带的基因在受体细胞中表达动物细胞显微注射法利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中微生物细胞Ca2+处理法先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中知识拓展农杆菌转化法(1)两次重组①第一次重组:目的基因(①)与Ti质粒构建重组载体。②第二次重组:重组Ti质粒上的T-DNA插入染色体DNA。(2)两次导入①第一次导入:将重组Ti质粒导入经Ca2+处理的农杆菌细胞。②第二次导入:将T-DNA导入植物细胞染色体DNA上。4.目的基因的检测与鉴定分子水平的检测检测目的基因是否导入受体细胞PCR操作方法:设计目的基因特异性引物,提取受体细胞内的基因组DNA进行PCR扩增,如果能够扩增出目的基因片段,说明该基因已经导入受体细胞DNA分子杂交操作方法:把目的基因片段用放射性同位素、生物素或荧光进行标记,与受体细胞的基因组DNA进行杂交,如果目的基因已经导入受体细胞,那么标记的基因片段就会与其结合,通过特殊的仪器就能够检测出来分子水平的检测检测目的基因是否转录逆转录-PCR(RT-PCR)操作方法:提取受体细胞内的总RNA进行逆转录,得到cDNA,以获得的cDNA为模板,设计待测目的基因特异性引物进行PCR核酸分子杂交操作方法:从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子,用已标记的目的基因片段作为探针与Mr-NA杂交检测目的基因是否翻译抗原—抗体杂交操作方法:从受体细胞中提取蛋白质后,进行电泳分离,然后利用目的蛋白的抗体进行检测个体生物学水平的鉴定检测目标性状的有无等,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定抗虫基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度二、基因工程的应用

三、蛋白质工程简介设计基础以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础目的改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质改造方法由于基因决定蛋白质,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成基本思路从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质应用速效胰岛素类似物的研发、延长干扰素的体外保存时间、枯草杆菌蛋白酶的改进等小表达蛋白质工程中为什么要通过基因操作来实现对天然蛋白质的改造?

。

蛋白质一般具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容;改造后的基因可以遗传给下一代,而直接改造的蛋白质无法遗传即练即清从真题到教材1.基因表达载体的构建:基因表达载体由目的基因、复制原点、

、启动子、

等组成。启动子位于基因的

,作用是

。诱导型启动子的作用是

。终止子的作用是

(选必3P80)(2024广东,21)(2023广东,20)(2022广东,22)(2024黑、吉、辽,25)(2024河北,22)。标记基因终止子上游 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因的转录

使转录在所需要的地方停下来

当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基因表达2.将目的基因导入受体细胞:将目的基因导入植物细胞常采用农杆菌转化法,需将目的

基因插入Ti质粒的

中;动物常采用显微注射技术将目的基因导入

;将目

的基因导入大肠杆菌时需先用

处理,使之处于一种能吸收境中DNA分子的

生理状态(选必3P81—82)(2021广东,22)(2021辽宁,24)。T-DNA受精卵Ca2+

3.目的基因的检测与鉴定:分子水平的检测,常采用

等技术检测DNA和RNA,检测

是否表达出相应的蛋白质常采用

;最终还要进行

水平的鉴定(选必3P82)(2021广东,22)(2022河北,24)。PCR抗原—抗体杂交技术个体生物学4.蛋白质工程的基本思路:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的

→推测

应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的

或

→获得所需要的蛋白质(选必3P94)。蛋白质结构脱氧核苷酸序列(基因)合成新的基因限制酶的选择和基因表达载体的构建1.限制酶的选择(1)限制酶选择的原则:①限制酶不能破坏目的基因的完整结构,也不能破坏载体上的启动子、终止子、复制

原点等必要元件;②应使目的基因按照正确的转录方向插入载体的启动子和终止子之间;③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,尽量选用不同的限制酶切割目的基

因和质粒,即双酶切。(2)实例分析:图1质粒为载体,图2为克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙链为

转录模板链(MfeⅠ和EcoRⅠ为同尾酶,可切出相同的黏性末端)。限制酶选择分析:图1质粒中含2个EcoRⅠ识别位点,选用EcoRⅠ会切去终止子,选用BamHⅠ会破坏启动子,故可选用的限制酶有MfeⅠ、HindⅢ、KpnⅠ;如果W基因以乙

链为转录模板链,RNA聚合酶从模板链的3'端开始转录,故W基因乙链的3'端与启动子

相连,5'端与终止子相连,为保证W基因与质粒正确连接,质粒的终止子一侧应选用与W

基因右侧相同的HindⅢ,故切割质粒可选的限制酶为MfeⅠ、HindⅢ。图2中选用Mfe

Ⅰ会破坏W基因,故只能选择同尾酶EcoRⅠ,因此选用EcoRⅠ、HindⅢ切割图2中的DNA。典例1

(2024全国甲,38节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回

答下列问题。(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其

中DNA双链打开成为单链的阶段是

,引物与模板DNA链碱基之间的化学键是

。(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质

粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在

(答出2点即可);使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是

。变性氢键

避免载体自连,保证目的基因连接方向正确T4DNA连接酶

(3)将重组质粒转入大肠杆菌前,通常先将受体细胞处理成感受态,感受态细胞的特点是

。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,简要的实验思路和预期结果是

。收外源DNA分子提取质粒,用特异性引物进行PCR,电泳出现目的条带解析

(1)PCR过程中,变性是通过高碱基之间的氢键,使双链DNA解聚为单链。

引物(核苷酸序列)与模板DNA键结合,本质是两条核苷酸链之间的碱基通过氢键相

连。(2)用酶a单酶切目的基因和质粒时,目的基因与质粒两端形成的黏性末端相同,在

连接时容载体自连及目的基因反向连接到质粒上的情况。用酶a和酶b双酶切

目的基因和质粒时,目的基因及质粒两端形成的黏性末端不同,避免载体自连,保证目的

基因连接方向正确。T4DNA连接酶既可以高效“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以高效“缝合”双链DNA片段的平末端,由题图可知,酶c切割DNA产生的是平

末端,故使用酶c单酶切构建重组质粒时应该用T4DNA连接酶。(3)感受态细胞的通透

性变大,处于一种能吸收境中DNA分子的生理状态。与普通质粒相比,重组质粒

中含有目的基因,因此可以通过检验大肠杆菌中目的基因的存在与否,验证大肠杆菌中

是否含有重组质粒。具体见答案。

变式1

(同考法不同角度)(T-DNA的酶切分析)(2022湖北,24节选)(3)如图1、2是载体

的限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)酶谱和S基因的cDNA。为了成功构建重组

表达载体,确保目的基因插入载体中方向正确,最好选用

酶切割S基因的

cDNA和载体。

图1XbaⅠ和HindⅢ

解析

(3)为确保目的基因和载体正向连接,最好用两种限制酶切割,因此不宜选用

EcoRⅠ;观察S基因,不能选用BamHⅠ,会切断S基因;观察载体,不能选用SalⅠ(不在启动

子和终止子之间)。综合分析,选用的两种限制酶为XbaⅠ和HindⅢ。2.基因表达载体的构建分析基因表达载体是基因工程中常用的一种载体,除目的基因、标记基因外,还必须含有启

动子、终止子等。构