GB-T47486-2026《血管芯片技术要求》

1本文件界定了血管芯片的术语和定义，规定了技术要求，质控设置，标识、标签和随行文件以及包装、运输和贮存，描述了相应的试验方法。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T2423.23环境试验第2部分：试验方法试验Q:密封GB/T9969工业产品使用说明书总则中华人民共和国药典(2025年版)3术语和定义微流控芯片microfluidicchip以硅、玻璃、金属材料、高分子聚合物等材料为基材，利用微纳加工、精密注塑等加工技术加工而成的生物芯片。注：包括一个或多个微管道、微阀、微泵、微反应池(腔室)等功能单元，能够完成芯片内液体、气体流动的精准操控，从而实现某种特定的生化反应功能。[来源：GB/T41407—2022,3.3,有修改]透光率luminoustransmittance透过试样的光通量与射到试样上的光通量之比。2密封性leaktightness血管芯片vasculature-on-a-chip能在微流控芯片中生成具有可灌注性、屏障功能、生化分泌活性的三维脉管网络的微型培养器件。生物相容性biocompatibility各种材料与生物体之间相互作用后产生的各种复杂的生物、物理、化学等反应及其对生物反应过程和反应结果的影响的性能。灌注性perfusability微流控芯片生成的血管内皮脉管腔在压力梯度驱动下，允许流体通过相互连接的管腔进行灌注的能力。血管屏障功能vascularbarrierfunction微流控芯片形成的血管内皮脉管腔能够限制管腔内部与间质之间水分子、蛋白质、脂质及细胞等的选择性交换。血管壁面剪切应力vascularwallshearstress由相邻流体层之间的速度梯度所产生的、方向平行于血管壁的摩擦力。4技术要求4.1.2功能结构区域应无影响产品质量特征的明显划痕、破损或其他明显可见缺陷。4.2细胞来源构建血管芯片的细胞组成应以血管内皮细胞为主体，在成纤维细胞的支持下促进血管内皮脉管腔的生成，并可进一步引入平滑肌细胞与周细胞等提升其结构与功能的完整性。细胞来源可通过人体组织分离与提取、干细胞定向诱导分化以及细胞系培养等方式获得。4.3.1透光率微流控芯片中用于血管内皮脉管腔培养的各独立腔室之间以及芯片及其附属部分的任何部位，均3不应发生试剂串扰或泄漏。4.3.3工作温度耐受性间应不少于1.2倍的正常试验条件工作时间，外观应无形变、无破损，密封性测定结果应符合4.3.24.3.4生物相容性应选用对血管内皮细胞或组织无细胞毒性的材料作为微流控芯片的基片及附属材料。4.4生物性能4.4.1血管壁面剪切应力应明确血管芯片中流体壁面剪切应力的大小。壁面剪切应力值的参考范围在0.1Pa～1Pa。血管芯片中的血管内皮细胞应具备自组装能力，形成相互连接、分支丰富、细胞间具有紧密连接的中空管状结构。所形成的脉管结构应具备清晰的腔面边界，网络连续且无大面积缺损，并完整覆盖预设的通道或三维基质区域，从而构成一个高度组织化的微血管网络结构。应明确血管芯片中脉管网络能够模拟生理条件下血管中的内皮细胞功能，能够实现一氧化氮(NO)等活性物质的正常分泌与及时清除。采用硝酸还原酶法进行检测时，其NO分泌峰值应不低于4.4.4脉管组织可灌注性及流动性a)所构建血管芯片中脉管内皮腔具有一种或多种紧密连接蛋白(如ZO-1等)的表达；b)在显微镜下观察到紧密连接蛋白的表达；c)紧密连接蛋白呈现连续的环状表达，而非斑片状分布。5质控设置应从连续生产的三批血管芯片产品中，每批随机抽取10张芯片作为样本。所有样本应在重复性条件下进行独立检测，其性能指标检测结果应符合4.1～4.4的要求。产品出厂前，应按照《中华人民共和国药典》(2025年版)的要求，进行包括细菌、真菌、支原体及特定病毒在内的病原微生物检测，所有检测项目结果均应合格。4按GB/T2423.23—2013的第6章进行密封性试验(具体检测方法见A.3)。试验条件如下：a)试验温度：在微流控芯片最高工作环境温度以上1℃~5℃;微流控芯片在偏离工作温度±20.0℃的条件下(时间不小于1.2倍正常试验时长),检测其是否渗5将血管内皮细胞与支持细胞(如成纤维细胞等)按特定比例混合，并包裹于纤维蛋白或胶原蛋白等水凝胶中。将该细胞-凝胶复合物注入微流控芯片的血管培养腔室，并在灌注通道中持续灌注包含血管内皮生长因子的培养基。在动态培养条件下(通常为5d～7d),血管内皮细胞在基质中迁移、增殖并自组装，最终形成具有分支和贯通管腔的三维微血管网络。可通过活细胞成像与免疫荧光染色等方式对形成的网络进行形态与功能验证(具体检测方法见A.6)。6.8生物组织活性通过构建一个由泵、储液器与血管芯片组成的循环灌流系统，可对血管芯片内的三维血管脉管施加设定的流体剪切力。在力学刺激下，脉管内皮细胞会分泌NO等活性物质。继而收集循环培养基，检测其中NO等目标物质的浓度，即可量化内皮细胞在剪切力刺激下的特异性释放水平，以评估其功能响应(具体检测方法见A.7)。6.9脉管组织可灌注性及流动性采用灌注示踪法评估血管芯片中脉管组织的可灌注性与流动性。向脉管组织灌注荧光微球或可溶性染料作为示踪剂，利用延时显微成像技术实时捕捉其在脉管网络内的运动轨迹与空间分布。通过分析示踪剂的运移路径与填充情况，对脉管组织的灌注性与流动性进行评估(具体检测方法见A.8)。通过对紧密连接蛋白(如ZO-1等标志物)进行特异性染色来实现对血管芯片中脉管的屏障功能评估。在共聚焦显微镜下观察其在内皮细胞间的连续性、分布形态与结构完整性(具体检测方法见A.9)。7.2随行文件7.2.1产品的随行文件应包括说明书，说明书的编制应符合GB/T9969的有关规定。7.2.2随行文件应标明血管芯片培养腔室数量、培养腔室尺寸。8包装、运输和贮存产品的包装应满足如下要求：b)产品采用适宜的包装容器，且包装的密封条的任何损坏都清晰可见。68.2运输产品的运输应满足如下要求；a)按照制造商规定的运输包装要求对产品进行包装；b)按照制造商规定的密封条件、温度要求、防紫外线/防辐射等条件进行运输；c)在运输过程中避免碰撞或强烈震动。产品应根据制造商规定的要求进行贮存。7(资料性)检测方法目视检查。观察微流控芯片结构是否完整、组分是否齐全，是否无泄漏、无破损；功能结构区域，是否无划痕、破损或其他明显可见缺陷。A.2透光率A.2.1方法来源A.2.2检测对象微流控芯片中用于血管内皮脉管腔培养的空腔室。A.2.3主要仪器积分球式雾度计(配备C光源或A光源)。A.2.4方法原理使用积分球式雾度计，检测通过试样的总透射光通量和入射光通量，计算出透光率。对于每个试样，透光率按公式(A.1)计算，以百分数表示。式中：T₂———通过试样的总透射光通量；T₁——入射光通量。A.2.5试样要求试样表面应清洁，无划痕、无油污、无灰尘。试样尺寸应足够大，能完全覆盖积分球的入射光和出射光窗口。至少测试3个试样取平均值，精确到0.1%。A.2.6检测结果符合4.3.1的要求。A.3密封性A.3.1方法来源A.3.2检测对象用于血管内皮脉管腔培养的微流控芯片。8A.3.3检测条件检测温度设置应高于正常试验条件温度的10%,试验时间设置应不少于1.2倍的正常试验条件工作时间。A.3.4检测方法置于42℃空气循环干燥箱中保存9d。为确保有效性，试验期间需定期检查并维持各腔室染料溶液充A.3.5检测结果A.4工作温度耐受性A.4.1方法来源A.4.2检测对象用于血管内皮脉管腔培养的微流控芯片。A.4.3检测条件A.4.4检测方法具体检测方法包括如下方面。a)将微流控芯片置于57℃空气循环干燥箱中保存9d。试验结束后，目测微流控芯外观应无形变、无破损，密封性测定按照密封性测试方法(见A.3)进行。检测重复至少3次，且每个批次均应设置不少于3个平行试样。b)将微流控芯片置于17℃空气循环干燥箱中保存9d。试验结束后，目测微流控芯外观应无形变、无破损，密封性测定按照密封性测试方法(见A.3)进行。检测重复至少3次，且每个批次均应设置不少于3个平行试样。A.5生物相容性A.5.1方法来源A.5.2检测对象采用微流控芯片浸提液处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC),通过观察细胞形态变化并检测细胞活9性，综合评估其潜在细胞毒性。A.5.3检测方法A.5.3.1试验分组试验设立阴性对照组与阳性对照组作为参照。检测重复至少3次，且每个批次均应设置不少于3个平行试样。A.5.3.2浸提液制备按照GB/T16886.12的规定，在无菌条件下对微流控芯片进行纵向切割，充分暴露其内部密封的中间腔道(脉管培养腔室)及两侧的培养基腔道。将切割后的芯片片段按0.2g/mL(质量/体积)的终浓度与细胞培养基混合，置于37℃培养箱中浸提24h,以获取微流控芯片浸提液。A.5.3.3浸提液稀释使用经37℃预平衡24h的完全培养基作为稀释溶剂，将原浸提液(定义为100%浓度)依次稀释为A.5.4结果判定A.5.4.1形态学观察采用倒置显微镜观察细胞形态，并按照浸提液细胞毒性形态学定性分级标准进行判定。当毒性分级大于2级时，判定样品具有细胞毒性作用。A.5.4.2细胞活性分析通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活性。与阴性对照组相比，若实验组细胞活性下降幅度大于30%,则判定为存在细胞毒性。A.5.5检测结果A.6血管芯片中三维脉管网络的构建A.6.1方法原理A.6.2构建方法A.6.2.1细胞准备A.6.2.2细胞-凝胶复合物制备以构建120μL凝胶体系为例。在预冷的无菌离心管中，按以下顺序精确加入各组分，并使用移液器轻柔吹打混匀，全程注意避免产生气泡。HLF与HUVEC的共培养比例建议范围为2:1～4:1,HU-VEC的终密度约为1.0×10⁷cells/mL。b)纤维蛋白原工作液(15mg/mL):20μL。c)凝血酶工作液(100U/mL):1μL。A.6.2.3凝胶灌装与聚合使用预冷的移液器，将上述细胞与凝胶的混合物缓慢注入微流控芯片的血管内皮脉管培养腔室中，注意避免产生气泡。随后，将芯片置于37℃培养箱中，静置15min～30min,使纤维蛋白原充分聚合，形成包裹细胞的三维纤维蛋白水凝胶。A.6.2.4血管内皮脉管网络培养与形成向微流控芯片两侧的培养基通道中加入血管内皮细胞完全培养基。将微流控芯片置于37℃培养箱中连续培养3d～7d,培养基每12h更换一次。在此过程中，HUVEC将在水凝胶内发生自发性的迁移、增殖与细胞间连接，最终形成贯通的三维中空管状网络。A.6.3检测结果A.7基于闭合循环灌流系统的血管芯片一氧化氮释放检测A.7.1方法原理旨在模拟体内血液流动对血管内皮细胞的力学刺激，并定量评估其功能性响应。通过构建一个由泵、储液装置和血管芯片组成的闭合循环灌流系统，对芯片内的三维血管内皮脉管施加特定的壁面剪切应力。脉管含有的内皮细胞在流体剪切应力刺激下会分泌一氧化氮。通过收集循环培养基，并使用硝酸还原酶法测定其中NO浓度峰值，即可间接量化内皮细胞在力学刺激下的NO释放水平。A.7.2主要设备与试剂主要设备与试剂包括：a)血管芯片：已完成内皮细胞接种并成功形成三维、有管腔、屏障功能完善的脉管网络的微流控芯片；c)储液装置：无菌的培养基储液池或储液瓶；d)管路：生物相容性良好的无菌管(如硅胶管),内径与芯片接口匹配；e)内皮细胞培养基；f)硝酸还原酶法NO测定试剂盒；A.7.3系统连接详细步骤A.7.3.1计算目标流速灌注刺激。灌注结束后，收集循环培养基作为待测样品。A.7.3.2组装闭合循环系统以单个血管芯片为单位，按以下顺序连接各个组件，形成一个独立的闭合回路：储液装置→泵管→血管芯片的流体入口→血管芯片的流体出口→返回储液装置。A.7.3.3连接细节连接步骤包括：a)使用适当长度的管路，确保回路顺畅，无扭曲或压折；b)将所有接口处(管与芯片、管与储液装置)确保紧密连接，防止灌流过程中漏液或引入气泡；c)在系统组装完成后，可先用无菌PBS缓冲液进行短暂灌流，以排出管路和芯片腔道中的气泡，确保流体畅通。A.7.4系统初始化将闭合循环灌流系统置于37℃恒温环境(如细胞培养箱)。向储液装置注入预定体积(例如10mL)的预温培养基。系统启动时，应先以较低流速(如目标流速的50%)运行5min～10min,该步骤旨在使流体平稳过渡，从而有效排出血管网络中的气体，并确保其结构被培养基完全浸润，为后续实验建立稳定的初始条件。A.7.5灌注刺激与样品收集A.7.5.1施加刺激将闭合循环灌流系统的流速调整至6.6中计算得到的目标流速，开始正式灌注刺激。记录此时为T=0h。整个灌流过程在37℃环境下持续进行4h。A.7.5.2样品收集在T=4h,使用无菌移液器从储液装置中小心吸取一定体积(例如1mL)的循环培养基。将培养基作为待测样品，并立即置于-20℃或-80℃冰箱冻存，以备检测。A.7.6血管芯片中一氧化氮检测采用硝酸还原酶法测定样品中的NO浓度。实验同步设立空白组与标准组，与样品测定组一同检测吸光度值。最后，根据公式(A.2)计算3个独立血管芯片的一氧化氮浓度平均峰值。式中：CNo——样品中的NO浓度；A测定——测定组的吸光度值；A空白——空白组的吸光度值；A标准——标准组的吸光度值；N——样本测试前稀释倍数。A.7.7检测结果符合4.3.3的要求。A.8脉管组织可灌注性及流动性评估A.8.1检测原理本实验通过重力势差驱动下，将荧光标记的微球注入血管芯片的脉管腔网络中，利用延时显微成像技术实时追踪微球在脉管腔内的运动轨迹，从而直观地定性与评估血管脉管腔网络的连通性、整体可灌注性及腔内流体的流动性。A.8.2.1荧光示踪剂灌注将构建有脉管网络的微流控芯片从培养箱中移出，并置于倒置荧光显微镜的载物台上。通过显微操作器或精密注射针，将含有荧光微球等示踪介质的悬液自芯片的培养基腔室入口处注入。进而，通过精密调节芯片入口与出口的液柱高度产生压力差，以此驱动荧光示踪介质进入脉管腔内部。A.8.2.2实时成像与数据采集在荧光示踪剂开始流入网络的同时，启动显微镜的延时拍摄功能。使用低倍物镜(如4×或10×)定位并观察脉管网络的整体轮廓，然后切换至高倍物镜(如20×)重点观察目标区域的微球运动细节。设置合适的拍摄参数(如曝光时间、采样间隔和总持续时间),持续记录荧光微球在脉管腔内流动、穿过整个网络并从出口端流出的全过程。A.8.2.3数据分析A.8.3检测结果A.9血管芯片中免疫荧光染色方案A.9.1材料与试剂主要材料与试剂包括：b)PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.4);c)通透液：0.1%～0.5%TritonX-100;d)封闭液：1%～5%牛血清白蛋白(BSA)或10%正常山羊血清(溶于PBS缓冲液);e)使用针对ZO-1(或其他目标蛋白)的特异性一抗；f)使用带有荧光标记的二抗；g)抗荧光淬灭封片剂；h)移液器及无菌枪头。A.9.2设备主要设备包括：a)生物安全柜；b)共聚焦显微镜或高内涵成像系统；d)4℃冰箱、-20℃冰箱。A.9.3具体操作步骤A.9.3.1.1终止培养与清洗基及残留血清蛋白。此过程需重复1次～2次，且所有操作均应控制流速，旨在通过芯片流体入口缓慢加入4%PFA固定液，确保充满整个流体通道。在室温下避光固定A.9.3.1.3PBS缓冲液清洗固定结束后，缓慢吸出PFA,用PBS缓冲液清洗芯片内部3次，每次5min～10min,以彻底去除残留的固定剂。A.9.3.2通透与封闭A.9.3.2.1通透向芯片流体入口缓慢加入0.1%～0.5%TritonX-100通透液，室温作用10min～15min。通透结束后，用PBS缓冲液清洗3次，每次5min。A.9.3.2.2封闭向芯片流体入口加入足量的封闭液(如3%BSA),确保充满通道。将整个芯片放入湿盒中，在室温下封闭1h,或4℃下过夜。A.9.3.3.1配制一抗工作液用封闭液稀释ZO-1一抗。稀释比例需根据抗体说明书和预实验结果确定，常见的起始稀释比例为1:100～1:400。A.9.3.3.2孵育一抗缓慢吸出芯片内的封闭液。加入稀释好的一抗工作液，确保充满通道，避免产生气泡。将芯片放入湿盒，4℃下孵育过夜。A.9.3.4二抗孵育A.9.3.4.1清洗从4℃湿盒中取出芯片，恢复至室温。吸出一抗，用PBS缓冲液清洗芯片内部3次～4次，每次A.9.3.4.2配制二抗工作液用封闭液稀释荧光标记的二抗。稀释比例通常为1:500～1:1000。从这一步开始，后续所有操作都应在避光条件下进行，以防荧光淬灭。A.9.3.4.3孵育二抗吸出最后一次的PBS缓冲液。加入稀释好的二抗工作液，避光，室温下孵育1h～2h。A.9.3.5成像吸出二抗，用PBS缓冲液避光清洗芯片内部3次～4次，每次15min～20min。吸出最后一次的PBS缓冲液。向芯片流体通道内缓慢加入少量PBS缓冲液后立即使用共聚焦显微镜进行观察和图像采集。A.9.4显微镜观察使用共聚焦显微镜在多个随机视野下进行Z-Stack扫描，并获取血管内皮脉结构的高清三维图像，以展示ZO-1在内皮细胞细胞膜连接处的连续线性分布。A.9.5检测结果A.10无菌检测A.10.1方法