多克隆抗体制备专家讲座

多克隆抗体制备第1页多克隆抗体制备方法动物选择动物免疫血清采集抗体纯化第2页动物选择一、选择制备多克隆抗体(抗血清)动物种类应考虑关键点:需要制备抗血清质量;供给蛋白质抗原动物与免疫动物之间种系关系;免疫动物产生抗体特征（针对不一样性质免疫原选取对应动物）。二、动物年纪、性别和数量反抗体制备影响优先选取青壮年动物；雌性动物免疫应答情况,不论是细胞性还是体液性免疫都比雄性个体强烈。第3页家兔家兔是最适合制备抗体动物。其体型适中,成年体重为2～6kg,一次采血量可达25～50ml,全放血量则达100～180ml;性格驯顺,易于操作和采血;寿命相对较长,为5～8年;能生产足够量高效价和高亲和力抗血清；通常适合用于制备抗啮齿类和人蛋白质抗体；家兔仅一型IgG而无亚型。用家兔IgG很轻易制备Fc、Fab和F(ab′)2等片段第4页鸡鸡种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白质抗体含有独特优点。鸡IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物补体成份C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡IgY稳定性不如家兔IgG,不过,鸡IgY在鸡蛋内可保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件下则可保留多年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价Fab或Fab′等片段。鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中,从鸡蛋中收获抗体可防止采取损伤性搜集伎俩。第5页免疫剂量剂量：免疫原适当剂量选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5～1mg/只，小动物约0.1～0.6mg/只。如无免疫佐剂可适当提升免疫剂量（10-20倍）。乳化：普通抗原与免疫佐剂体积比1:1混合。首次免疫采取完全佐剂，加强免疫采取不完全佐剂。（1）延长抗原释放时间；（2）增加抗原表面积；（3）佐剂能刺激吞噬细胞反抗原处理；（4）增强辅助T细胞作用；（5）刺激致敏淋巴细胞分裂和浆细胞产生抗体。使无免疫原性物质变成有效免疫原；（6）改变抗体产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。第6页免疫方式注射路径：免疫注射路径也很主要。普通采取多点注射，一只动物注射总数约为8～10点，包含足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引发细胞免疫反应，对提升抗体效价有利第7页免疫方式间隔与免疫时间：第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。普通以间隔10～20天为好。二次以后每次间隔普通为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。免疫次数：依据抗体效价要求确定（抗血清滴度测定）第8页免疫应答机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列改变，并产生一定免疫效应过程。(一)感应阶段(inductivestage)称致敏阶段(sensitizationstage)，是抗原物质进入体内，抗原递呈细胞(APC)对其识别、捕捉、加工处理和递呈，以及抗原特异性淋巴细胞(T细胞和B细胞)反抗原识别阶段。(二)增生分化阶段(proliferativeanddifferentiativestage)又称反应阶段(reactivestage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化，进行增殖与分化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子过程。T细胞增殖分化为淋巴母细胞，最终成为效应T细胞(或称致敏T细胞)，并产生各种细胞因子；B细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部分T、B淋巴细胞在分化过程中成为记忆细胞(Bm和Tm)。在此阶段，有各种细胞间协作和各种细胞因子参加。(三)效应阶段(effectivestage)此阶段是由活化效应细胞(CTL与TD或TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫效应过程。这些效应细胞和效应分子共同作用去除抗原异物。第9页第10页首次应答(primaryresponse)机体首次接收适量抗原刺激后，引发体内抗体产生过程称为首次应答，主要特点为：①机体首次接触抗原后，需经一定潜伏期血清中才能出现抗体，潜伏期长短取决于抗原性质、抗原进入机体路径、所用佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体对数上升期，抗体含量直线上升，然后为连续期，抗体产生和排出相对平衡，最终为下降期；②首次应答最早产生抗体为IgM，可在几天内到达高峰，然后开始下降，接着才产生IgG，IgG抗体产生潜伏期比IgM长，假如抗原剂量少，可能仅产生IgM，IgA产生最迟，而且含量少；③首次应答产生抗体总量较低，维持时间也短，通常以IgM为主，且抗体平均亲和力较低。

第11页再次应答(secondaryresponse)机体再次接触相同抗原时，体内产生抗体过程称为再次应答或回想应答(anamnesticresponse)，主要特点为：①潜伏期显著缩短，约为首次应答潜伏期二分之一；②抗体含量大幅度上升，比首次应答多几倍到几十倍，而且维持时间长；③诱发再次应答所需抗原剂量极小；④再次应答产生抗体主