L-茶氨酸对脂多糖攻毒肉鸡肝脏抗氧化功能的影响

目录23759摘要 表1。表SEQ表\*ARABIC1基础饲粮组成和营养水平1)：预混料为每千克饲粮提供Thevitaminpremixprovidedthefollowingperkgofdiet:VA10000IU；VD34500IU；VE30IU;VK33mg;VB12mg;VB26mg;VB61mg;VB120.02mg;烟酸Niacin,10mg;生物素Biotin,0.12mg;泛酸Pantothenicacid,12mg;叶酸Folicacid,1.25mg；Cu,8mgasCuSO4·5H2O;Fe,100mgasFeSO4;I,0.7mgasKI;Zn,100mgasZnSO4;Mn,120mgasMnSO4;Se,0.3mgasNa2SeO3。2)：代谢能为计算值，其余为实测值。MEwasacalculatedvalue,whiletheothersweremeasuredvalues.2样品采集试验结束前，21日龄晚上8:00停止喂食至第二天早上8:00，所有腹腔注射的肉鸡分别称重并记录体重，选取五个重复，每个重复选取2羽，进行屠宰，放血，解剖测定样品，随后将样品血迹清洗干净称重，记录数据并计算器官指数。取肝脏组织液氮速冻，于-80℃保存。左叶用于抗氧化酶检测，右叶用于基因表达检测。第三章测定指标1肝脏抗氧酶活性测定称取约100mg肝脏组织液样本，按1:9比例加入生理盐水混合:按1:9体积比匀浆，采用3000rpm转速在4℃离心处理15分钟,取离心后的上清液，采用相应检测试剂盒对CAT、SOD、GR、GSH-ST和GPX进行活性分析，同时测定PC值，本实验采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，使用索莱宝科技(北京)的试剂盒测定上清液MDA水平，实验步骤完全依据试剂盒说明书实施，分析结果生成。2肝脏相关基因的测定对100mg肝脏组织液样本进行TRIzol试剂添加，按说明书规范步骤完成总RNA的提取，之后使用赛默飞世尔ND-1000紫外分光光度计测定RNA样品的纯度及浓度值，总RNA经HiScript®ⅢRTSuper-Mix试剂盒（诺唯赞）逆转录生成cDNA，使用ChamQSYBRqPCR预混试剂(诺唯赞生物科技)，根据制造商指南完成qRT-PCR实验，采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参，借助2-∆∆Ct方法量化靶基因mRNA的相对表达水平，表2载明了相关引物的序列。表2qRT-PCR引物序列注：Nrf2核因子E2相关因子2；HO-1血红素加氧酶1；NQO1醌氧化还原酶1；Keap1kelch样ECH关联蛋白1；GST谷胱甘肽S-转移酶；GPX谷胱甘肽过氧化氢酶；SOD超氧化物歧化酶；CAT过氧化氢酶第四章数据统计与分析初始数据使用Excel2019，应用SPSS25中单因素方差分析（One-WayANOVA），差异显著性用Duncan氏法进行多重比较，P<0.01为极显著，0.01<P<0.05为有表达趋势，P<0.05为差异显著。第五章结果与分析1L-茶氨酸对LPS肉鸡肝脏抗氧化指标的影响从表3可以看出，与CON组对照，L-茶氨酸处理显著提升了肉鸡肝脏中CAT与GSH-ST的酶活性（P<0.05），较CON组差异显著，检测显示PC及MDA含量极显著下降（P<0.01），各组间SOD、GR、GSH-ST及GPX酶活性差异不显著（P>0.05）；与对照组相比，LPS组肝脏CAT、SOD酶活显著降低（P<0.05），GR含量显著下降（P<0.05），GSH-ST酶活也明显降低（P<0.05），PC含量呈现极显著升高（P<0.01）。与LPS组相比，LPS+L-Theanine组肉鸡肝脏SOD酶活性显著增加（P<0.05），CAT含量、GSH-ST含量和GPX酶活性显著上升（P<0.05），PC含量极显著下降（P<0.01），MDA含量显著下降（P<0.05）。表3L-茶氨酸对LPS攻毒肉鸡的肝脏抗氧化指标的影响注：CAT过氧化氢酶；SOD超氧化物歧化酶；GR谷胱甘肽还原酶；GSH-ST谷胱甘肽转移酶；GPX谷胱甘肽过氧化物酶；PC蛋白质羰基化；MDA丙二醛2L-茶氨酸对LPS肉鸡肝脏抗氧化相关基因mRNA表达量的影响从表4可见，与对照组CON相比，L-茶氨酸显著上调了肉鸡肝脏组织Nrf2、SOD及GPX基因的转录水平（P<0.05），Keap1的mRNA水平极显著降低（P<0.01），检测显示GSTmRNA显著下降（P<0.05）；LPS干预导致Nrf2、SOD与GPX的mRNA转录水平急剧下降（P<0.01），Keap1的mRNA表达量急剧升高（P<0.01），HO-1及GST的mRNA转录量出现明显下降（P<0.05），较之LPS暴露组，添加L-Theanine后，LPS刺激下的细胞中Nrf2、HO-1、SOD、GPX和GSTmRNA表达量急剧上升（P<0.01），Keap1的mRNA表达量出现极显著下降（P<0.01）。表4L-茶氨酸对LPS攻毒肉鸡的肝脏抗氧化基因mRNA表达量的影响注：Nrf2核因子E2相关因子2；HO-1血红素加氧酶1；NQO1醌氧化还原酶1；Keap1kelch样ECH关联蛋白1；GST谷胱甘肽S-转移酶；GPX谷胱甘肽过氧化氢酶；SOD超氧化物歧化酶；CAT过氧化氢酶

第六章讨论1L-茶氨酸对LPS肉鸡肝脏抗氧化指标的影响肝脏在禽类生长中发挥着关键作用，起着代谢排毒的功能，所以常常以它为研究对象。氧化术语实为抗氧化自由基的缩略称谓，生物体内自由基的生成与呼吸活动、环境暴露及光辐射等因素密切相关，过量自由基与衰老、癌症等重大疾病存在显著关联REF_Ref860\r\h[5]，从实际表现看，禽类生长速度差异体现在肝脏抗氧化水平上。免疫应激作用期间，造成抗氧化防御能力降低，生物抗氧化防御体系由两个部分组成REF_Ref886\r\h[6]，作为酶抗氧化系统的组分，SOD、GPX和CAT等发挥关键作用，GSH-ST被归入非酶抗氧化防御体系REF_Ref32383\r\h[7]，自由基清除和过氧化物分解由SOD、CAT与GPX共同完成，GSH-ST所含巯基可有效清除体内多余自由基，实现抗氧化效果REF_Ref32651\r\h[8]，自由基伴随过氧化氢等活性氧诱发细胞脂质过氧化REF_Ref2564\r\h[9]，加速细胞老化及凋亡，且对红细胞的破坏性最强，严重时红细胞被破坏，继而出现溶血性贫血REF_Ref2571\r\h[10]。而解决自由基等氧化产物危害主要靠体内的抗氧化酶体系。SOD是生物体抗氧化酶体系中重要一员，它属于金属酶，是一种酸性蛋白质较稳定、耐热，能催化超氧自由基发生歧化，是体内氧化物的自然清除剂。SOD可以控制关节炎、急性气管炎等炎症发生，主要是通过其抗氧化作用；SOD对胃蛋白酶和胰蛋白酶均有很好的抑制作用。SOD是清除超氧阴离子（O₂⁻）的核心酶，其活性直接反映机体对抗自由基的初级能力REF_Ref4096\r\h[11]。本研究发现，LPS攻毒显著抑制肉鸡肝脏SOD活性，而L-茶氨酸干预后SOD活性显著上升（P<0.05）。此外，茶氨酸的酚羟基结构可直接清除O₂⁻，间接减少SOD的代谢负担REF_Ref4840\r\h[12]。CAT是机体防御系统中的起抗氧功能的酶，主要功能将H2O2分解，而不产生有害的OH-，为机体提供抗氧化防卫机理，肝脏中CAT含量尤其地高。CAT对其他细胞毒性物质也有影响，如甲醛及乙醇等。CAT负责分解SOD催化生成的过氧化氢（H₂O₂）为水和氧气。LPS攻毒导致H₂O₂积累，抑制CAT活性；而茶氨酸补充组CAT活性显著升高（P<0.05）。GR是动物体内氧化还原体系最重要的酶之一，它是利用细胞的其它成分将谷胱甘肽还原为原来的状态，能够继续发挥抗氧化功能。谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫转移酶（GSH-ST）清除脂质过氧化物（如MDA）REF_Ref7463\r\h[13]。L-茶氨酸显著提高GPX和GSH-ST活性（P<0.05）。研究表明，L-茶氨酸促进GSH合成（通过增加γ谷氨酰半胱氨酸合成酶活性）REF_Ref102896191\r\h[14]，维持GSH/GSSG比例，为GPX/GSH-ST提供充足还原力REF_Ref7642\r\h[15]。MDA是机体内游离基与脂类发生氧化反应的产物，是脂质过氧化的终产物。它使机体生命大分子物质结合一体，使细胞受到损伤。张曼研究发现LPS可增加小鼠肝脏MDA的含量，而日粮添加L-茶氨酸可降低MDA的含量REF_Ref8498\r\h[16]。MDA破坏细胞线粒体，使其无法为细胞提供能量；破坏细胞膜，无法在细胞提供保护作用；破坏蛋白质，使部分酶失去原有的功能。LPS攻毒组MDA含量显著升高（P<0.05），而L-茶氨酸降低MDA水平，李众擎发现其作用是通过清除活性氧ROS（如O₂⁻、OH⁻）减少脂质过氧化链式反应的启动。GPX活性升高加速脂质过氧化物的分解，从而减少MDA生成REF_Ref9540\r\h[17]。由此可见，MDA的水平能反应细胞的损伤程度，也能反应机体的损伤程度。PC是指体内蛋白质发生不可逆转化学反应，失去原有执行的功能，不在发挥运输、防御、代谢和构成生物体结构等作用。蛋白质是机体重要的生命大分子之一，体内蛋白质结构发生变化，其功能发生变化，而机体生命状态与蛋白质息息相关。羰基化会破坏蛋白质的活性位点或空间结构，导致酶失活（如SOD、CAT等抗氧化酶），从而加剧氧化应激的恶性循环REF_Ref11515\r\h[18]。蛋白质羰基化（PC）是氧化应激的关键指标，其水平变化直接反映蛋白质氧化损伤程度及抗氧化干预效果。在本研究中，L-茶氨酸通过多途径降低PC水平，证实其具有保护肝脏蛋白质免遭氧化破坏的作用，为天然抗氧化剂的开发提供了依据。肝脏的抗氧化酶活性高低以及脂质氧化终产物浓度高低是机体免疫水平高低的表现，根据实验结果得知，LPS组肝脏中CAT、GPX含量显著低于CON组，GR含量和GSH-ST含量无显著变化，PC含量极显著上升，MDA含量显著上升，LPS攻毒肉鸡后肝脏的抗氧功能受到影响，其肉鸡肝脏中关于分解过氧化物的酶含量的下降，导致肝脏抗氧功能下降。与LPS组相比，LPS+L-Theanine肉鸡肝脏中SOD含量极显著增加，CAT含量、GR含量、GSH-ST含量和GPX含量无明显变化，PC含量极显著下降，MDA含量显著下降。由此可见，饲粮中添加L-茶氨酸可以有效缓解LPS诱导应激对肉鸡产生的不良影响。2L-茶氨酸对LPS肉鸡肝脏抗氧化相关基因mRNA表达量的的影响本研究发现，LPS攻毒显著抑制Nrf2mRNA的表达并上调了Keap1mRNA的表达量，而L-茶氨酸干预后逆转了这一趋势（Nrf2mRNA表达量上升，Keap1mRNA表达量下降）。Keap1作为Nrf2的负调控因子，在氧化应激时释放Nrf2，使其易位至细胞核并激活抗氧化反应元件（ARE）。L-茶氨酸通过修饰Keap1蛋白的巯基，破坏Keap1-Nrf2复合体，促进Nrf2核转位，启动下游抗氧化基因转录。研究证实，L-茶氨酸可通过激活Nrf2增强小鼠肝脏抗氧化能力REF_Ref14853\r\h[19]。同时，通过抑制Keap1的表达，减少Nrf2的泛素化降解，增强其稳定性REF_Ref15313\r\h[20]。本实验进一步扩展至家禽领域，表明L-茶氨酸对肉鸡Nrf2/Keap1通路的调控具有物种普适性。L-茶氨酸显著提高LPS攻毒肉鸡肝脏中NQO1和HO-1的mRNA水平。使NQO1还原醌类物质，防止ROS生成，维持细胞氧化还原稳态REF_Ref16067\r\h[21]。同时催化HO-1降解血红素生成具有抗氧化活性的胆红素和CO，二者均为Nrf2的经典靶基因。L-茶氨酸可能通过Nrf2非依赖性途径（如直接清除自由基）增强SOD和CAT活性，协同清除超氧阴离子（O₂⁻）和过氧化氢（H₂O₂）REF_Ref16087\r\h[22]。第七章结论（1）LPS攻毒肉鸡导致肉鸡肝脏抗氧化功能下降，具体表现在SOD活性显著下降，PC含量和MDA含