胃癌单链抗体与免疫毒素scFv-TCS的制备工艺及抗肿瘤效能研究

胃癌单链抗体与免疫毒素scFv-TCS的制备工艺及抗肿瘤效能研究一、引言1.1研究背景与意义胃癌作为全球范围内高发的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命健康。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，当年全球胃癌新发病例约108.9万例，死亡病例约76.9万例，其发病率和死亡率在各类恶性肿瘤中均位居前列。在我国，胃癌同样是一个沉重的公共卫生负担，由于饮食习惯、幽门螺杆菌感染率较高等因素，我国胃癌的发病率和死亡率一直居高不下，严重影响患者的生活质量和生存预期。目前，临床上针对胃癌的主要治疗手段包括手术切除、化疗、放疗以及近年来兴起的免疫治疗和靶向治疗等。手术切除是早期胃癌的主要治疗方法，对于部分患者可达到根治的效果，但对于中晚期胃癌，手术往往难以彻底清除肿瘤细胞，且术后复发率较高。化疗是胃癌综合治疗的重要组成部分，然而化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞产生毒副作用，导致患者出现恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等不良反应，严重影响患者的生活质量和治疗依从性。放疗虽然能够局部控制肿瘤生长，但同样存在对正常组织的损伤以及放疗抵抗等问题。新兴的免疫治疗和靶向治疗在部分胃癌患者中取得了一定的疗效，但也面临着适用人群有限、耐药性以及高昂的治疗费用等挑战。单链抗体（single-chainfragmentvariable，scFv）作为一种基因工程抗体，具有分子量小、组织穿透性强、免疫原性低、制备成本低等优点，在肿瘤诊断与治疗领域展现出巨大的潜力。它由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段柔性连接肽（linker）连接而成，能够特异性地识别并结合肿瘤细胞表面的抗原，从而为肿瘤的靶向治疗提供了有力的工具。免疫毒素scFv-TCS则是将单链抗体与具有细胞毒性的天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）通过基因融合技术连接而成的一种新型生物治疗药物。TCS是从中药天花粉中提取的一种核糖体失活蛋白，能够抑制蛋白质合成，从而发挥细胞毒性作用。将scFv与TCS连接后，scFv-TCS可以利用单链抗体的靶向性，将TCS特异性地输送到肿瘤细胞表面，实现对肿瘤细胞的精准杀伤，同时减少对正常细胞的损伤。因此，开展胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的制备和抗肿瘤作用研究，对于开发新型、高效、低毒的胃癌治疗药物具有重要的理论意义和临床应用价值。通过深入研究scFv和scFv-TCS的制备方法、表达特性以及抗肿瘤作用机制，有望为胃癌的治疗提供新的策略和手段，提高胃癌患者的治疗效果和生存率，改善患者的生活质量。1.2国内外研究现状在单链抗体的研究领域，国外起步较早，技术相对成熟。自20世纪80年代末单链抗体概念提出以来，国外科研团队在其结构优化、制备工艺改进以及作用机制探究等方面取得了众多成果。例如，美国和欧洲的一些实验室通过对抗体基因的定点突变和密码子优化，显著提高了单链抗体在大肠杆菌、酵母等表达系统中的表达量和活性。在肿瘤治疗的临床前研究中，针对多种肿瘤抗原的单链抗体展现出良好的靶向性和抗肿瘤活性，部分已进入临床试验阶段，为肿瘤的精准治疗提供了新的思路和方法。国内在单链抗体研究方面也紧跟国际步伐，在胃癌单链抗体的研究上取得了一定进展。众多科研团队致力于构建高效的胃癌单链抗体库，利用噬菌体展示技术从胃癌患者的淋巴细胞或杂交瘤细胞中筛选出特异性高、亲和力强的单链抗体。如北京大学的研究人员通过优化噬菌体展示技术平台，成功筛选出针对胃癌细胞表面特异性抗原的单链抗体，该抗体在体外实验中能够特异性地结合胃癌细胞，并有效抑制胃癌细胞的增殖。同时，国内在单链抗体的表达系统优化方面也开展了大量工作，通过对表达宿主、诱导条件等因素的优化，提高单链抗体的表达水平和可溶性，降低生产成本，为其临床应用奠定基础。在免疫毒素scFv-TCS的研究方面，国外主要聚焦于优化免疫毒素的构建策略和提高其靶向性。通过合理设计连接肽的长度和氨基酸组成，增强单链抗体与TCS之间的连接稳定性，同时减少对两者活性的影响。此外，对免疫毒素的作用机制进行深入研究，揭示其在肿瘤细胞内的摄取、转运以及发挥细胞毒性的分子通路，为进一步优化免疫毒素的设计提供理论依据。部分免疫毒素在动物模型中展现出显著的抗肿瘤效果，为其临床转化提供了有力的实验支持。国内在免疫毒素scFv-TCS的研究也取得了一些成果。浙江大学的研究团队通过基因融合技术成功构建了免疫毒素scFv-TCS，并在大肠杆菌和毕赤酵母中实现了表达。体外实验表明，该免疫毒素对胃癌细胞具有显著的细胞毒性，能够有效抑制胃癌细胞的生长；体内实验在裸鼠移植性人胃癌模型中也显示出对胃癌生长的抑制作用。宁夏医科大学的科研人员通过IPTG诱导大肠杆菌表达系统表达抗胃癌单链抗体免疫毒素基因重组质粒，经包涵体纯化、变性、复性后，获得的免疫毒素可与胃癌细胞MGC803特异结合，并有一定的细胞毒性。尽管国内外在胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的研究上取得了诸多成果，但仍存在一些不足之处。一方面，单链抗体和免疫毒素的表达量和活性有待进一步提高，现有的表达系统和制备工艺仍存在成本高、产量低、活性不稳定等问题，限制了其大规模生产和临床应用。另一方面，免疫毒素在体内的药代动力学特性和安全性研究还不够深入，其在体内的分布、代谢以及对正常组织的潜在毒性等问题尚未完全明确，需要进一步开展相关研究以评估其临床应用的可行性和安全性。此外，对于免疫毒素与肿瘤细胞相互作用的分子机制研究还不够透彻，需要深入探究以更好地指导免疫毒素的设计和优化。本研究将针对这些不足，开展深入的研究工作，旨在提高胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的制备效率和抗肿瘤活性，为胃癌的治疗提供更有效的手段。1.3研究目的与内容本研究旨在攻克胃癌治疗难题，通过一系列科学严谨的实验和分析，制备具有高特异性和亲和力的胃癌单链抗体以及免疫毒素scFv-TCS，并深入探究其抗肿瘤作用机制，为胃癌的临床治疗提供新的有效策略和理论依据。具体研究内容如下：胃癌单链抗体的制备与优化：利用本实验室已有的抗胃癌单链抗体库，运用分子生物学技术，将单链抗体基因插入合适的表达载体，分别在原核表达系统（如大肠杆菌）和真核表达系统（如毕赤酵母）中进行表达。对不同表达系统中的诱导条件，如诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等进行优化，以提高单链抗体的表达量和可溶性。采用亲和层析、离子交换层析等蛋白纯化技术，对表达后的单链抗体进行纯化，获得高纯度的单链抗体蛋白。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质免疫印迹（Westernblot）等方法，对纯化后的单链抗体进行活性和特异性鉴定，确保其能够特异性地结合胃癌细胞表面的抗原。免疫毒素scFv-TCS的构建与表达：通过基因融合技术，设计合适的柔性连接肽，将筛选得到的单链抗体基因与具有细胞毒性的天花粉蛋白（TCS）基因连接，构建免疫毒素scFv-TCS的重组基因。将重组基因插入原核和真核表达载体，转入相应的宿主细胞（如大肠杆菌BL21(DE3)、毕赤酵母GS115）中进行表达。同样对表达条件进行优化，提高免疫毒素的表达量和稳定性。对表达后的免疫毒素进行纯化和复性处理，采用高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）等技术对其纯度和结构进行鉴定，确保获得正确折叠且具有活性的免疫毒素scFv-TCS。体外抗肿瘤作用研究：采用细胞增殖实验，如MTT法、CCK-8法等，检测胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS对不同胃癌细胞系（如人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞、人胃癌BGC-823细胞等）的生长抑制作用，计算半抑制浓度（IC50），评估其细胞毒性。通过细胞凋亡检测实验，如AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术，观察免疫毒素对胃癌细胞凋亡的诱导作用，分析凋亡相关蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase-3等）的表达变化，探讨其诱导细胞凋亡的分子机制。利用细胞迁移和侵袭实验，如Transwell实验，研究免疫毒素对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响，检测相关分子（如基质金属蛋白酶MMPs、上皮-间质转化相关蛋白等）的表达，揭示其抑制肿瘤转移的作用机制。同时，以人正常胃上皮细胞（如GES-1细胞）作为对照，评估免疫毒素对正常细胞的毒性，分析其选择性杀伤肿瘤细胞的特性。体内抗肿瘤作用研究：建立裸鼠移植性人胃癌模型，将人胃癌细胞皮下接种于裸鼠体内，待肿瘤生长至合适大小后，随机分组，分别通过尾静脉注射、瘤内注射等方式给予不同剂量的胃癌单链抗体、免疫毒素scFv-TCS以及对照药物（如生理盐水、单纯的TCS等）。定期测量肿瘤体积和裸鼠体重，绘制肿瘤生长曲线，观察免疫毒素对肿瘤生长的抑制效果。实验结束后，处死裸鼠，取出肿瘤组织，进行称重、拍照，并进行组织病理学分析，如苏木精-伊红（HE）染色，观察肿瘤组织的形态学变化；免疫组织化学染色检测肿瘤组织中增殖相关蛋白（如Ki-67）、血管生成相关因子（如VEGF）等的表达，进一步评估免疫毒素的抗肿瘤作用机制。此外，还需对裸鼠的主要脏器（如心、肝、脾、肺、肾等）进行组织学检查，评估免疫毒素对机体正常组织和器官的毒性和安全性。1.4研究方法与技术路线基因工程技术：从本实验室已有的抗胃癌单链抗体库中获取单链抗体基因，运用PCR技术对其进行扩增，确保基因的完整性和准确性。利用分子克隆技术，将扩增后的单链抗体基因插入原核表达载体（如pET-30a）和真核表达载体（如pPIC9K）中，构建重组表达质粒。在构建免疫毒素scFv-TCS时，通过基因融合技术，设计富含甘氨酸和丝氨酸的柔性连接肽（如(GGGGS)3），将单链抗体基因与天花粉蛋白（TCS）基因连接，再插入相应的表达载体。对构建好的重组质粒进行测序验证，确保基因序列的正确性，为后续的表达实验奠定基础。细胞培养技术：培养多种胃癌细胞系，如人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞、人胃癌BGC-823细胞等，以及人正常胃上皮细胞GES-1作为对照。使用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO₂的培养箱中进行细胞培养，定期更换培养基，观察细胞的生长状态，待细胞生长至对数期时，用于后续实验。蛋白表达与纯化技术：将构建好的重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达。对于单链抗体，设置不同的诱导条件，如IPTG浓度（0.1mM、0.5mM、1mM）、诱导时间（3h、6h、9h）和诱导温度（25℃、30℃、37℃），通过SDS分析表达情况，确定最佳诱导条件；对于免疫毒素scFv-TCS，同样优化诱导条件。表达后的蛋白若以包涵体形式存在，采用8M尿素进行变性溶解，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，通过梯度透析法进行复性，获得可溶性蛋白。在真核表达系统中，将重组表达质粒线性化后电转化导入毕赤酵母GS115，利用甲醇进行诱导表达。通过优化甲醇浓度（0.5%、1%、2%）、诱导时间（24h、48h、72h等），提高蛋白表达量。采用亲和层析、离子交换层析等方法对真核表达的蛋白进行纯化，并用SDS、Westernblot等技术鉴定蛋白的纯度和正确性。活性与功能检测技术：采用ELISA法检测单链抗体与胃癌细胞表面抗原的结合活性，以正常细胞作为阴性对照，分析其特异性。利用MTT法、CCK-8法检测胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS对胃癌细胞和正常胃上皮细胞的生长抑制作用，设置不同的药物浓度梯度，作用一定时间后，检测细胞活力，计算IC50值。通过AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术，检测免疫毒素对胃癌细胞凋亡的诱导作用；采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测凋亡相关蛋白的表达变化。运用Transwell实验检测免疫毒素对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响，通过检测基质金属蛋白酶（MMPs）、上皮-间质转化相关蛋白等的表达，探讨其抑制肿瘤转移的机制。动物实验技术：选取4-6周龄的BALB/c裸鼠，在无菌条件下，将对数生长期的人胃癌MGC-803细胞以3×10⁶个/只的密度皮下接种于裸鼠右腋皮下，建立裸鼠移植性人胃癌模型。待肿瘤体积生长至约100-150mm³时，将裸鼠随机分为对照组（生理盐水组、单纯TCS组）、单链抗体组和免疫毒素scFv-TCS组，每组6-8只。分别通过尾静脉注射、瘤内注射等方式给予相应药物，定期用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。实验结束后，处死裸鼠，取出肿瘤组织和主要脏器（心、肝、脾、肺、肾），进行称重、拍照，并进行组织病理学分析。肿瘤组织进行HE染色，观察肿瘤细胞形态变化；免疫组织化学染色检测肿瘤组织中增殖相关蛋白（如Ki-67）、血管生成相关因子（如VEGF）等的表达。对主要脏器进行组织学检查，评估免疫毒素对机体正常组织和器官的毒性和安全性。本研究的技术路线如图1所示：首先从抗胃癌单链抗体库获取单链抗体基因，经PCR扩增后构建原核和真核重组表达质粒，分别在大肠杆菌和毕赤酵母中表达，优化表达条件并纯化单链抗体；同时通过基因融合构建免疫毒素scFv-TCS的重组基因，同样进行表达和纯化。对纯化后的单链抗体和免疫毒素进行活性鉴定，随后在体外进行细胞实验，检测其对胃癌细胞和正常细胞的作用；最后建立裸鼠移植性人胃癌模型，进行体内抗肿瘤实验，全面评估胃癌单链抗体和免疫毒素scFv-TCS的抗肿瘤作用及安全性。[此处插入技术路线图，技术路线图应清晰展示从获取基因到体内外实验的整个流程，各步骤之间用箭头连接，标注关键操作和检测指标]二、相关理论基础2.1胃癌概述胃癌是一种起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，在全球范围内具有较高的发病率和死亡率，严重威胁人类健康。其发病机制复杂，涉及多种因素的相互作用。环境因素在胃癌的发生发展中扮演重要角色，饮食因素尤为关键。长期食用高盐、腌制、熏制食物，如咸菜、腊肉、熏鱼等，这些食物中含有大量的亚硝酸盐、多环芳烃等致癌物质，在胃酸等作用下，可转化为具有强烈致癌性的亚硝胺类化合物，增加胃癌发生风险。流行病学研究显示，日本、韩国等国家，由于居民传统饮食中此类食物摄入较多，胃癌发病率相对较高。新鲜蔬菜水果摄入不足，会导致机体缺乏维生素C、维生素E、β-胡萝卜素等抗氧化剂，这些抗氧化剂能够清除体内自由基，抑制致癌物质的形成，缺乏时会削弱机体的抗氧化防御系统，使胃黏膜更容易受到损伤和致癌物质的攻击。感染因素中，幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）感染与胃癌的关系最为密切。Hp是一种革兰氏阴性菌，能够在胃内酸性环境中生存，它通过尿素酶分解尿素产生氨，中和胃酸，为自身创造适宜的生存环境。Hp感染引发的慢性炎症反应，会导致胃黏膜上皮细胞增殖和凋亡失衡，促进癌基因激活和抑癌基因失活。研究表明，全球约50%的人口感染Hp，而在胃癌患者中，Hp感染率可高达70%-90%。此外，EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）感染也与部分胃癌的发生相关，EBV可通过潜伏膜蛋白、EB病毒编码的小RNA等干扰细胞的正常生长和凋亡信号通路，参与胃癌的发病过程。遗传因素在胃癌发病中也具有重要作用，约10%的胃癌患者具有家族遗传倾向。遗传性弥漫型胃癌（HDGC）是一种常染色体显性遗传疾病，由E-cadherin（CDH1）基因突变引起，携带该基因突变的个体，一生中患胃癌的风险高达70%-80%。此外，一些其他基因的突变，如TP53、APC、KRAS等，也与胃癌的遗传易感性相关，这些基因参与细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞增殖与分化等过程，突变后会导致细胞生长失控，增加胃癌发生风险。从流行病学特征来看，胃癌的发病率和死亡率在全球范围内存在明显的地域差异。在东亚地区，如中国、日本、韩国等国家，胃癌发病率和死亡率较高，这可能与上述提及的饮食习惯、Hp感染率高等因素有关。在中国，胃癌发病率居恶性肿瘤第3位，死亡率居第2位。在性别方面，男性胃癌发病率和死亡率普遍高于女性，约为女性的2-3倍，这可能与男性吸烟、饮酒等不良生活习惯更为普遍，以及激素水平差异等因素有关。此外，胃癌的发病年龄多在50岁以上，但近年来，年轻患者的比例有逐渐上升的趋势，可能与生活方式改变、环境污染等因素有关。根据组织病理学分类，胃癌主要包括腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、未分化癌等类型，其中腺癌最为常见，约占胃癌的90%以上。腺癌又可进一步分为乳头状腺癌、管状腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和印戒细胞癌等亚型。不同亚型的胃癌在生物学行为、治疗反应和预后等方面存在差异，例如，印戒细胞癌和低分化腺癌恶性程度较高，侵袭性强，预后相对较差；而乳头状腺癌和管状腺癌恶性程度相对较低，预后相对较好。临床上，早期胃癌患者多无明显症状，或仅有一些非特异性症状，如消化不良、上腹部隐痛、饱胀不适等，容易被忽视。随着病情进展，患者可出现上腹部疼痛加剧、食欲不振、消瘦、呕血、黑便等症状。晚期胃癌患者还可能出现远处转移，如肝转移、肺转移、骨转移等，导致相应器官功能受损，出现黄疸、咳嗽、咯血、骨痛等症状。目前，胃癌的治疗方法主要包括手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等。手术治疗是早期胃癌的主要治疗手段，包括根治性手术和姑息性手术。根治性手术的目的是彻底切除肿瘤组织及周围可能受侵犯的淋巴结，以达到治愈的效果；姑息性手术则主要用于缓解患者的症状，如解除幽门梗阻、控制出血等，适用于晚期无法根治的患者。化疗是胃癌综合治疗的重要组成部分，可分为术前新辅助化疗、术后辅助化疗和晚期姑息化疗。术前新辅助化疗可以缩小肿瘤体积，降低肿瘤分期，提高手术切除率；术后辅助化疗则可以消灭残留的肿瘤细胞，降低复发风险；晚期姑息化疗主要用于缓解症状，延长患者生存期。常用的化疗药物包括氟尿嘧啶、铂类、紫杉醇、伊立替康等，这些药物通过不同的作用机制，抑制肿瘤细胞的DNA合成、干扰细胞分裂或诱导细胞凋亡。放疗主要用于局部晚期胃癌或术后局部复发的患者，通过高能射线照射肿瘤组织，破坏肿瘤细胞的DNA，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。然而，放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对周围正常组织造成一定的损伤，引起放射性胃炎、放射性肠炎等不良反应。近年来，靶向治疗和免疫治疗为胃癌的治疗带来了新的突破。靶向治疗药物能够特异性地作用于肿瘤细胞表面的靶点或细胞内的信号传导通路，阻断肿瘤细胞的生长、增殖和转移，具有疗效高、副作用小的特点。例如，抗人表皮生长因子受体2（HER2）靶向药物曲妥珠单抗，对于HER2阳性的胃癌患者，与化疗联合使用可显著提高患者的生存期。免疫治疗则是通过激活机体自身的免疫系统，增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，达到治疗肿瘤的目的。程序性死亡受体1（PD-1）及其配体（PD-L1）抑制剂是目前临床上常用的免疫治疗药物，在部分胃癌患者中取得了较好的疗效。然而，这些治疗方法也存在一定的局限性，如靶向治疗药物仅对特定靶点阳性的患者有效，且容易出现耐药；免疫治疗并非对所有患者都有效，且可能引发免疫相关不良反应。因此，开发新型的胃癌治疗药物和方法具有重要的临床意义和迫切需求。2.2单链抗体单链抗体（single-chainfragmentvariable，scFv）作为基因工程抗体领域的重要成员，在生物医学研究，尤其是肿瘤研究中展现出独特的价值和应用潜力。单链抗体的结构较为独特，其分子量约为25-30kDa，由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段15-25个氨基酸的柔性连接肽（linker）首尾相连而成。VH和VL各自包含3个互补决定区（CDR），即CDR1、CDR2和CDR3，这6个CDR共同构成了抗体的抗原结合部位，决定了单链抗体识别和结合抗原的特异性。由于CDR区域氨基酸组成和排列顺序的高度多样性，单链抗体能够形成众多具有不同抗原结合特异性的分子，以应对复杂多样的抗原。连接肽通常富含甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser），如(GGGGS)3，这种氨基酸组成赋予连接肽一定的弹性和柔韧性，使其能够在VH和VL之间起到桥梁作用，确保两者在空间上正确折叠并配对，形成稳定的抗原结合位点。同时，连接肽还具有一定的蛋白酶抗性，能够抵抗体内蛋白酶的降解，维持单链抗体结构和功能的完整性。目前，制备单链抗体的方法有多种，其中噬菌体展示技术应用最为广泛。该技术的基本流程如下：首先从免疫动物（如小鼠、兔子等）的脾脏、淋巴结或外周血淋巴细胞中提取总RNA。由于淋巴细胞在受到抗原刺激后会产生相应的抗体基因转录产物mRNA，因此从这些免疫细胞中提取的RNA包含了丰富的抗体基因信息。随后，通过逆转录酶将RNA逆转录成互补DNA（cDNA），以cDNA为模板，利用聚合酶链式反应（PCR）技术分别扩增抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。在PCR扩增过程中，需要设计特异性引物，引物的设计要考虑到后续与噬菌粒载体的连接以及扩增片段的准确性和完整性。为了提高扩增效率和特异性，通常会进行两轮PCR扩增。第一轮PCR扩增可以初步获得VH和VL基因片段，第二轮PCR扩增则在第一轮的基础上，进一步优化扩增条件，提高基因片段的产量和纯度。将扩增得到的VH和VL基因通过特定的Linker序列连接起来，形成完整的单链抗体基因。连接过程通常利用DNA连接酶，将带有互补粘性末端或平末端的VH、VL和Linker基因片段连接在一起。连接后的单链抗体基因被插入到噬菌粒载体中，构建成表达载体。噬菌粒载体包含启动子、终止子、复制原点等元件，这些元件能够确保单链抗体基因在宿主细胞中正确转录和翻译。将构建好的表达载体转化到宿主细胞中，常用的宿主细胞为大肠杆菌，如TG1、XL1-Blue等。转化后的大肠杆菌在含有抗生素的培养基中培养，只有成功导入表达载体的大肠杆菌才能在选择压力下生长繁殖。在大肠杆菌培养过程中，通过加入辅助噬菌体（如M13KO7），辅助噬菌体能够提供噬菌体外壳蛋白，帮助噬菌粒载体包装成噬菌体颗粒。这些噬菌体颗粒表面展示有单链抗体，形成了噬菌体展示文库。利用固相化的抗原与噬菌体展示文库孵育，只有表面展示有能够特异性结合抗原的单链抗体的噬菌体才能与抗原结合。通过几轮的洗涤、洗脱、扩增过程，不断富集特异性结合抗原的噬菌体，从而筛选出具有高亲和力和特异性的单链抗体。从筛选出的单链抗体库中挑选阳性克隆，进行测序分析，验证测序结果是否与预期的单链抗体基因序列一致。单链抗体具有一系列显著的特点，使其在肿瘤研究和治疗中具有独特的优势。单链抗体分子量小，仅为完整抗体的1/6-1/8，这一特点赋予其良好的组织穿透性。在肿瘤组织中，由于肿瘤细胞的快速增殖和血管生成异常，肿瘤组织内部往往存在高间质压力和复杂的微环境，完整抗体难以有效穿透进入肿瘤深部。而单链抗体能够更容易地穿透肿瘤组织的毛细血管壁和细胞外基质，到达肿瘤细胞表面，实现对肿瘤细胞的有效靶向。同时，小分子量也使得单链抗体在体内的清除速度较快，能够降低药物在体内的蓄积，减少潜在的毒副作用。单链抗体仅保留了抗体的抗原结合片段，不含有Fc片段，大大降低了其免疫原性。在体内应用时，完整抗体的Fc片段可能会引发机体的免疫反应，导致抗药抗体的产生，影响治疗效果。而单链抗体由于免疫原性低，能够减少机体对其的免疫排斥，提高治疗的安全性和有效性。此外，单链抗体的制备过程基于基因工程技术，可以通过对抗体基因的操作，如定点突变、密码子优化等，对单链抗体的结构和功能进行改造和优化。还可以方便地将单链抗体与其他功能分子，如细胞毒素、荧光蛋白、放射性核素等进行融合，构建成具有多种功能的融合蛋白，拓展其在肿瘤诊断和治疗中的应用。同时，单链抗体可以在多种表达系统中高效表达，包括原核表达系统（如大肠杆菌）和真核表达系统（如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等），这为其大规模生产提供了便利，降低了生产成本。在肿瘤研究中，单链抗体已被广泛应用于多个方面。在肿瘤诊断领域，单链抗体可与荧光蛋白、放射性核素等标记物融合，用于肿瘤的早期诊断和定位。例如，将单链抗体与荧光素偶联，通过荧光成像技术，可以实现对肿瘤组织的无创、实时检测，提高肿瘤的早期诊断率。利用放射性核素标记的单链抗体进行正电子发射断层扫描（PET）或单光子发射计算机断层扫描（SPECT），能够精确地定位肿瘤病灶，为肿瘤的诊断和分期提供重要依据。在肿瘤治疗方面，单链抗体可以与化学毒素、细胞因子等相连形成免疫毒素或融合蛋白，进而靶向并杀死肿瘤细胞。如本研究中的免疫毒素scFv-TCS，就是利用单链抗体的靶向性，将具有细胞毒性的天花粉蛋白（TCS）特异性地输送到肿瘤细胞表面，实现对肿瘤细胞的精准杀伤。单链抗体还可以连接到T细胞上，构建成嵌合抗原受体T细胞（CAR-T），用于癌症的治疗。CAR-T细胞能够特异性识别肿瘤细胞表面的抗原，激活T细胞的杀伤活性，对肿瘤细胞进行杀伤。此外，单链抗体还可以作为肿瘤疫苗的组成部分，通过激发机体的免疫反应，增强对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤能力。在肿瘤发病机制研究中，单链抗体也发挥着重要作用。通过制备针对肿瘤相关抗原的单链抗体，可以深入研究肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学过程，以及肿瘤细胞与微环境之间的相互作用，为揭示肿瘤发病机制提供有力的工具。2.3免疫毒素scFv-TCS免疫毒素是一类具有独特结构和强大功能的生物分子，在癌症治疗领域展现出巨大的潜力。它主要由靶向片段、毒素片段和连接片段这三个关键部分组成。靶向片段通常为抗体或抗体片段，如单链抗体（scFv），其作用是凭借自身高度的特异性，精准识别并紧密结合靶细胞表面的特定抗原。在肿瘤治疗中，它就像是一枚精确制导的导航系统，能够将免疫毒素引导至肿瘤细胞处，实现对肿瘤细胞的靶向定位。毒素片段则是具有强大细胞毒性的蛋白质或多肽，其主要功能是对靶细胞进行杀伤，可通过多种机制发挥作用，如抑制靶细胞的蛋白质合成，阻断细胞代谢过程，诱导细胞凋亡等，从而有效抑制肿瘤细胞的生长和增殖。连接片段在免疫毒素中起到桥梁作用，它将靶向片段和毒素片段以共价键的形式稳定连接起来，确保整个免疫毒素分子结构的完整性和功能的有效性。连接片段的设计和选择至关重要，合适的连接片段不仅要保证靶向片段和毒素片段之间连接的稳定性，还要尽量减少对两者活性的影响，以维持免疫毒素的高效性。免疫毒素发挥作用的机制较为复杂，涉及多个关键步骤。免疫毒素凭借靶向片段，与靶细胞表面的特异性受体或抗原进行高度特异性的结合。以胃癌细胞为例，免疫毒素scFv-TCS中的单链抗体（scFv）能够特异性地识别并结合胃癌细胞表面高表达的特定抗原，如癌胚抗原（CEA）、人表皮生长因子受体2（HER2）等。这种特异性结合使得免疫毒素能够精准地定位于肿瘤细胞，避免对正常细胞的非特异性损伤。在与靶细胞表面抗原结合后，免疫毒素通过受体介导的内吞作用进入细胞内。这一过程涉及到细胞表面受体与免疫毒素的相互作用，以及细胞膜的内陷和包裹，形成内吞小泡，从而将免疫毒素带入细胞内部。进入细胞内的免疫毒素，其毒素片段开始发挥作用。对于许多免疫毒素而言，毒素片段会抑制癌细胞的蛋白质合成过程。例如，本研究中的天花粉蛋白（TCS）是一种核糖体失活蛋白，它能够作用于核糖体，使核糖体的大亚基或小亚基失活，从而阻断蛋白质合成的延伸步骤，导致细胞无法合成生命活动所需的各种蛋白质，最终引发细胞死亡。免疫毒素还可能通过激活重要的凋亡蛋白，如Caspase家族蛋白，启动细胞凋亡信号通路，诱导肿瘤细胞发生凋亡。免疫毒素scFv-TCS是一种将单链抗体（scFv）与天花粉蛋白（TCS）通过基因融合技术连接而成的新型免疫毒素。从结构上看，它以单链抗体作为靶向部分，单链抗体由抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过柔性连接肽（linker）连接而成。VH和VL上的互补决定区（CDR）共同构成了抗原结合位点，赋予了scFv-TCS对特定抗原的高度特异性识别能力。在本研究中，scFv针对胃癌细胞表面的特异性抗原，能够精准地识别并结合胃癌细胞。连接肽通常富含甘氨酸和丝氨酸，如(GGGGS)3，具有良好的柔韧性和稳定性，能够确保VH和VL在空间上正确折叠并配对，维持抗原结合位点的活性。TCS作为毒素部分，通过基因融合与scFv连接在一起。TCS是从中药天花粉中提取的一种核糖体失活蛋白，其具有独特的空间结构和氨基酸序列。TCS的活性中心能够特异性地作用于核糖体，对其进行修饰，从而抑制蛋白质合成。在scFv-TCS中，TCS在scFv的引导下，被特异性地输送到胃癌细胞内，发挥其强大的细胞毒性作用。scFv-TCS在癌症治疗，尤其是胃癌治疗中具有诸多显著优势。它具有高度的靶向性，能够利用单链抗体对胃癌细胞表面抗原的特异性识别能力，将具有细胞毒性的TCS精准地递送至胃癌细胞，实现对肿瘤细胞的精准杀伤。这种靶向性大大提高了治疗的特异性，减少了对正常细胞的损伤，降低了传统化疗药物常见的全身性毒副作用，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等。scFv-TCS具有较强的细胞毒性。TCS作为一种高效的核糖体失活蛋白，能够迅速抑制胃癌细胞的蛋白质合成，导致细胞代谢紊乱，进而诱导细胞凋亡或坏死。在体外细胞实验和体内动物实验中，scFv-TCS对胃癌细胞的生长抑制作用显著，能够有效降低肿瘤细胞的活力，抑制肿瘤的生长和转移。单链抗体分子量小，使得scFv-TCS具有良好的组织穿透性。在肿瘤组织中，由于肿瘤细胞的异常增殖和血管生成异常，肿瘤组织内部存在高间质压力和复杂的微环境，传统的大分子抗体或药物难以有效穿透进入肿瘤深部。而scFv-TCS能够更容易地穿透肿瘤组织的毛细血管壁和细胞外基质，到达肿瘤细胞表面并进入细胞内，发挥其杀伤作用。scFv-TCS的制备基于基因工程技术，可通过对基因序列的操作，如定点突变、密码子优化等，对其结构和功能进行优化和改造。还可以方便地与其他功能分子，如荧光蛋白、放射性核素等进行融合，构建成多功能的融合蛋白，进一步拓展其在肿瘤诊断和治疗中的应用。同时，基因工程技术使得scFv-TCS能够在多种表达系统中高效表达，为其大规模生产提供了便利，降低了生产成本，有利于其临床推广应用。三、胃癌单链抗体的制备3.1实验材料与仪器菌株与质粒：大肠杆菌DH5α感受态细胞，用于基因克隆和质粒扩增；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，作为原核表达宿主菌，其具有T7RNA聚合酶基因，能够高效表达T7启动子驱动的外源基因。原核表达载体pET-30a，含有T7启动子、His标签等元件，便于单链抗体基因的表达和后续蛋白的纯化；真核表达载体pPIC9K，适用于在毕赤酵母中表达外源基因，其具有甲醇诱导型AOX1启动子、α-因子信号肽序列等，可实现目的蛋白的分泌表达。工具酶与试剂：限制性内切酶NdeI、XhoI，用于酶切表达载体和目的基因，以便进行连接反应；T4DNA连接酶，催化目的基因与表达载体的连接，形成重组质粒。DNAMarker，用于确定DNA片段的大小，在琼脂糖凝胶电泳中作为分子量标准；ProteinMarker，在蛋白质电泳中用于指示蛋白分子量大小。PrimeSTARHSDNAPolymerase，高保真DNA聚合酶，用于PCR扩增单链抗体基因，确保扩增产物的准确性和完整性。dNTPMix，包含四种脱氧核糖核苷酸，是PCR反应的原料。IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），作为原核表达的诱导剂，能够诱导T7启动子控制下的基因表达；甲醇，用于诱导毕赤酵母中AOX1启动子驱动的基因表达。质粒小提试剂盒，用于从大肠杆菌中快速提取重组质粒；胶回收试剂盒，用于从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段；PCR产物纯化试剂盒，用于纯化PCR扩增产物。Ni-NTA亲和层析树脂，用于纯化带有His标签的单链抗体，利用His标签与Ni离子的特异性结合实现蛋白的分离纯化。BCA蛋白浓度测定试剂盒，用于测定纯化后单链抗体的蛋白浓度。细胞株：人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞、人胃癌BGC-823细胞，用于检测单链抗体的活性和特异性；人正常胃上皮细胞GES-1，作为阴性对照细胞，用于评估单链抗体对正常细胞的结合情况。实验动物：4-6周龄的BALB/c裸鼠，体重18-22g，用于建立裸鼠移植性人胃癌模型，研究单链抗体的体内抗肿瘤作用。动物购自[供应商名称]，饲养于屏障环境动物房，温度控制在22-25℃，相对湿度为40%-70%，12h光照/12h黑暗交替，自由摄食和饮水。仪器设备：PCR仪，用于单链抗体基因的扩增，通过精确控制温度变化，实现DNA的变性、退火和延伸反应。高速冷冻离心机，用于细胞、菌体的离心收集以及蛋白样品的分离，可在低温条件下进行高速离心，减少蛋白的降解和变性。恒温摇床，用于细菌、细胞的培养，提供适宜的温度和振荡条件，促进细胞的生长和代谢。超净工作台，为实验操作提供无菌环境，防止微生物污染。CO₂培养箱，用于细胞培养，提供稳定的37℃温度和5%CO₂浓度，维持细胞生长所需的环境。凝胶成像系统，用于观察和记录琼脂糖凝胶电泳和蛋白质电泳结果，通过对核酸和蛋白条带的成像分析，判断实验结果的准确性。酶标仪，用于ELISA实验中检测吸光度值，定量分析单链抗体与抗原的结合活性。Westernblot转膜仪和电泳仪，用于蛋白质免疫印迹实验，将电泳分离后的蛋白质转移到膜上，并进行后续的抗体杂交和检测。超声波细胞破碎仪，用于破碎细菌细胞，释放细胞内表达的单链抗体。冷冻干燥机，用于对纯化后的单链抗体进行冻干处理，便于保存和运输。3.2单链抗体基因的获取本研究主要从本实验室已有的抗胃癌单链抗体库中获取单链抗体基因。该抗体库是前期通过噬菌体展示技术构建而成，其构建过程基于抗体基因的多样性和噬菌体展示系统的高效筛选能力。首先，从胃癌患者的外周血淋巴细胞中提取总RNA。胃癌患者由于机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫应答，其外周血淋巴细胞中包含了针对胃癌相关抗原的B淋巴细胞，这些B淋巴细胞能够产生特异性的抗体基因转录产物mRNA。使用TRIzol试剂等方法，能够有效地从淋巴细胞中提取总RNA，该试剂通过裂解细胞，使RNA与蛋白质、DNA等其他生物大分子分离，再经过氯仿抽提、异丙醇沉淀等步骤，获得纯度较高的总RNA。以提取的总RNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）合成互补DNA（cDNA）。逆转录过程使用逆转录酶，如M-MLV逆转录酶，在引物（通常为oligo(dT)引物或随机引物）的引导下，以RNA为模板合成cDNA。随后，以合成的cDNA为模板，利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。针对VH和VL基因，设计特异性的兼并引物。这些引物根据抗体基因的保守序列设计，能够扩增出多种不同的VH和VL基因片段。在PCR反应体系中，加入PrimeSTARHSDNAPolymerase高保真DNA聚合酶、dNTPMix、引物、模板cDNA等成分，通过PCR仪精确控制反应温度，经过变性、退火、延伸等多个循环，实现VH和VL基因的扩增。变性步骤通常在94-95℃下进行，使DNA双链解开；退火温度根据引物的Tm值而定，一般在55-65℃之间，确保引物与模板DNA特异性结合；延伸步骤在72℃下进行，由DNA聚合酶催化dNTP按照模板序列合成新的DNA链。为了进一步提高扩增效率和特异性，通常会进行两轮PCR扩增。第一轮PCR扩增可以初步获得VH和VL基因片段，第二轮PCR扩增则在第一轮的基础上，进一步优化扩增条件，如调整引物浓度、反应时间等，提高基因片段的产量和纯度。经过两轮PCR扩增后，获得了大量的VH和VL基因片段。采用重叠PCR（SOE-PCR）技术，将扩增得到的VH和VL基因通过一段富含甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）的柔性连接肽（如(GGGGS)3）连接起来，形成完整的单链抗体基因。在SOE-PCR反应中，首先将VH、VL基因片段和连接肽引物进行混合，经过数轮PCR反应，使VH和VL基因片段通过连接肽引物在重叠区域进行碱基互补配对，再通过DNA聚合酶的作用，将它们连接成完整的单链抗体基因。连接后的单链抗体基因经过PCR产物纯化试剂盒纯化，去除反应体系中的引物、dNTP、酶等杂质，获得纯净的单链抗体基因，用于后续的表达载体构建和表达实验。3.3表达载体的构建将获取的单链抗体基因分别插入原核表达载体pET-30a和真核表达载体pPIC9K，构建重组表达质粒，具体步骤如下：3.3.1原核表达载体构建使用限制性内切酶NdeI和XhoI对原核表达载体pET-30a进行双酶切。将适量的pET-30a质粒与NdeI、XhoI限制性内切酶、10×Buffer、ddH₂O按照一定比例混合，总体积为50μL。在37℃的恒温金属浴中孵育3-4h，使限制性内切酶充分作用，切割pET-30a质粒的特定序列，产生粘性末端。酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，在120V的电压下电泳30-40min。利用凝胶成像系统观察电泳结果，在紫外灯下，可见线性化的pET-30a质粒条带，用干净的手术刀从凝胶中切下含有线性化pET-30a质粒的凝胶块，放入1.5mL离心管中。按照胶回收试剂盒的操作说明书，对切下的凝胶块进行胶回收，获得纯化的线性化pET-30a质粒。同样使用NdeI和XhoI对单链抗体基因进行双酶切。将单链抗体基因与限制性内切酶、10×Buffer、ddH₂O混合，体系为50μL。在37℃恒温金属浴中孵育3-4h，使单链抗体基因两端产生与线性化pET-30a质粒互补的粘性末端。酶切后的单链抗体基因通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收获得纯化的单链抗体基因片段。将纯化后的线性化pET-30a质粒与单链抗体基因片段按照摩尔比1:3-1:5的比例混合，加入T4DNA连接酶和10×T4DNALigaseBuffer，总体积为20μL。在16℃的恒温金属浴中连接过夜，T4DNA连接酶催化单链抗体基因与线性化pET-30a质粒的粘性末端连接，形成重组表达质粒pET-30a-scFv。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。从-80℃冰箱中取出DH5α感受态细胞，置于冰上解冻。取5-10μL连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。将离心管放入42℃水浴锅中热激90s，迅速取出后冰浴2-3min。向离心管中加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养1h，使转化后的大肠杆菌复苏并表达抗性基因。将复苏后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上，用无菌涂布棒均匀涂布，37℃倒置培养过夜。次日，从平板上挑取单菌落接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒pET-30a-scFv。将提取的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系和条件与构建时相同。酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现与预期大小相符的单链抗体基因片段和线性化pET-30a质粒条带，则初步证明重组质粒构建成功。对酶切鉴定正确的重组质粒进行测序，将测序结果与原始单链抗体基因序列进行比对，确保基因序列的正确性和读码框的准确性。3.3.2真核表达载体构建采用限制性内切酶EcoRI和NotI对真核表达载体pPIC9K进行双酶切。将适量的pPIC9K质粒与EcoRI、NotI限制性内切酶、10×Buffer、ddH₂O混合，总体积为50μL。在37℃恒温金属浴中孵育3-4h，使pPIC9K质粒被酶切线性化。酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收获得纯化的线性化pPIC9K质粒。以同样的方法，使用EcoRI和NotI对单链抗体基因进行双酶切。将单链抗体基因与限制性内切酶、10×Buffer、ddH₂O混合，体系为50μL。在37℃恒温金属浴中孵育3-4h，使单链抗体基因两端产生与线性化pPIC9K质粒互补的粘性末端。酶切后的单链抗体基因通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收获得纯化的单链抗体基因片段。将纯化后的线性化pPIC9K质粒与单链抗体基因片段按照摩尔比1:3-1:5的比例混合，加入T4DNA连接酶和10×T4DNALigaseBuffer，总体积为20μL。在16℃恒温金属浴中连接过夜，形成重组表达质粒pPIC9K-scFv。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化步骤与原核表达载体构建时相同。将复苏后的菌液涂布在含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。次日，从平板上挑取单菌落接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒pPIC9K-scFv。对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系和条件与构建时相同。酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现与预期大小相符的单链抗体基因片段和线性化pPIC9K质粒条带，则初步证明重组质粒构建成功。对酶切鉴定正确的重组质粒进行测序，将测序结果与原始单链抗体基因序列进行比对，确保基因序列的正确性和读码框的准确性，为后续在毕赤酵母中的表达实验提供可靠的重组表达质粒。3.4单链抗体在大肠杆菌中的表达与纯化将构建正确的重组质粒pET-30a-scFv转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。从-80℃冰箱取出BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上解冻，取5-10μL重组质粒加入到100μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴热激90s，迅速冰浴2-3min。向其中加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养1h，使细胞复苏并表达抗性基因。将复苏后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。次日，挑取单菌落接种于5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，作为种子液。按照1%的接种量，将种子液接种到50mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至对数生长期（OD600值达到0.6-0.8）。向培养基中加入IPTG，使其终浓度分别为0.1mM、0.5mM、1mM，设置诱导温度为25℃、30℃、37℃，诱导时间为3h、6h、9h，进行诱导表达。每个条件设置3个生物学重复。诱导结束后，将菌液转移至50mL离心管中，4℃、6000r/min离心10min，收集菌体。弃上清，用预冷的PBS缓冲液重悬菌体，4℃、6000r/min离心10min，重复洗涤2-3次，去除培养基中的杂质。向菌体沉淀中加入适量的裂解缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl，1mg/mL溶菌酶），冰浴30min，使菌体充分裂解。采用超声波细胞破碎仪对菌液进行破碎，设置功率为300W，工作时间为3s，间歇时间为5s，总破碎时间为10min，在冰浴条件下进行，以防止蛋白变性。破碎后的菌液4℃、12000r/min离心30min，分别收集上清液和沉淀（包涵体）。将沉淀用包涵体洗涤缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl，2M尿素，0.5%TritonX-100）重悬，4℃、12000r/min离心30min，重复洗涤2-3次，去除包涵体表面的杂质。将洗涤后的包涵体用8M尿素变性缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，8M尿素）溶解，室温振荡1-2h，使包涵体充分溶解。将溶解后的包涵体溶液通过0.45μm的滤膜过滤，去除不溶性杂质，得到澄清的包涵体蛋白溶液。采用Ni-NTA亲和层析法对包涵体蛋白进行纯化。将Ni-NTA亲和层析树脂用平衡缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，500mMNaCl，8M尿素）平衡3-5个柱体积。将包涵体蛋白溶液缓慢上样到Ni-NTA亲和层析柱上，控制流速为0.5-1mL/min，使蛋白与树脂充分结合。用10-15个柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱，去除未结合的杂质。用洗脱缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，500mMNaCl，8M尿素，250mM咪唑）进行洗脱，收集洗脱峰，每个洗脱峰收集1mL。用SDS检测洗脱峰中蛋白的纯度和分子量，确定目的蛋白的洗脱位置。将纯化后的蛋白进行复性处理。采用梯度透析法，将蛋白溶液依次透析到含有6M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素、0.5M尿素的复性缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl，1mM还原型谷胱甘肽，0.1mM氧化型谷胱甘肽）中，每个梯度透析4-6h，最后透析到不含尿素的复性缓冲液中，4℃透析过夜。复性后的蛋白溶液4℃、12000r/min离心30min，去除不溶性杂质，收集上清液，即为复性后的单链抗体溶液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定复性后单链抗体的蛋白浓度。将蛋白溶液稀释适当倍数，按照试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上测定562nm处的吸光度值，根据标准曲线计算蛋白浓度。用SDS和Westernblot对复性后的单链抗体进行鉴定。SDS采用12%的分离胶和5%的浓缩胶，上样量为10-20μg，在120V电压下电泳1.5-2h，电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色液染色30-60min，再用脱色液脱色至背景清晰，观察蛋白条带。Westernblot将SDS分离后的蛋白转移到PVDF膜上，在250mA电流下转膜1.5-2h。转膜结束后，将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1-2h，以封闭非特异性结合位点。用TBST缓冲液（20mMTris-HCl，pH7.6，150mMNaCl，0.1%Tween-20）洗涤PVDF膜3次，每次5min。加入抗His标签的一抗（1:1000稀释），4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000稀释），室温孵育1-2h。用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min。加入ECL化学发光底物，在凝胶成像系统中曝光，观察目的蛋白条带，验证单链抗体的表达和纯化效果。3.5单链抗体在毕赤酵母中的表达与纯化将测序正确的重组表达质粒pPIC9K-scFv用SacI限制性内切酶进行线性化处理。将适量的重组质粒pPIC9K-scFv与SacI限制性内切酶、10×Buffer、ddH₂O混合，总体积为50μL。在37℃恒温金属浴中孵育4-6h，使质粒在特定序列处被酶切线性化。酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在120V电压下电泳30-40min。利用凝胶成像系统观察电泳结果，若出现与预期大小相符的线性化pPIC9K-scFv条带，则表明酶切成功。将线性化的重组质粒pPIC9K-scFv电转化导入毕赤酵母GS115感受态细胞中。从-80℃冰箱取出毕赤酵母GS115感受态细胞，置于冰上解冻。将5-10μL线性化的重组质粒加入到80-100μL毕赤酵母GS115感受态细胞中，轻轻混匀，转移至预冷的0.2cm电击杯中。设置电转参数：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，进行电穿孔操作。电转结束后，立即向电击杯中加入1mL冰预冷的1mol/L山梨醇，将细胞悬液转移至1.5mL离心管中。30℃、200r/min振荡培养1-2h，使细胞复苏。将复苏后的细胞涂布在MD（MinimalDextrose）固体培养基平板上，30℃倒置培养2-3d，直至长出转化子菌落。挑取MD平板上的单菌落，接种到含有不同浓度G418（0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL）的YPD（YeastExtractPeptoneDextrose）固体培养基平板上，30℃培养3-5d，筛选高拷贝转化子。随着G418浓度的升高，只有整合了多个拷贝外源基因的毕赤酵母转化子才能在高浓度G418平板上生长，从而筛选出高表达单链抗体的转化子。挑取在高浓度G418平板上生长良好的单菌落，接种到3mLBMGY（BufferedMinimalGlycerol）液体培养基中，30℃、250-300r/min振荡培养过夜，使细胞生长至对数生长期。将过夜培养的菌液以1%-2%的接种量转接至20mLBMGY液体培养基中，30℃、250-300r/min振荡培养至OD600值达到2-6。4℃、3000-4000r/min离心5-10min，收集菌体。弃上清，用BMMY（BufferedMinimalMethanol）液体培养基重悬菌体，使OD600值调整为1.0左右。将菌液转移至500mL三角瓶中，以3层灭菌纱布封口，30℃、250-300r/min振荡培养。每24h向培养基中添加甲醇，使其终浓度为0.5%-2%，诱导单链抗体表达。分别在诱导0h、24h、48h、72h、96h、120h时，取1mL菌液，4℃、12000r/min离心5min，收集上清，用于检测单链抗体的表达情况。采用Ni-NTA亲和层析法对表达上清中的单链抗体进行纯化。将Ni-NTA亲和层析树脂用平衡缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，20mM咪唑）平衡3-5个柱体积。将表达上清通过0.45μm的滤膜过滤后，缓慢上样到Ni-NTA亲和层析柱上，控制流速为0.5-1mL/min，使单链抗体与树脂充分结合。用10-15个柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱，去除未结合的杂质。用洗脱缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，250mM咪唑）进行洗脱，收集洗脱峰，每个洗脱峰收集1mL。用SDS检测洗脱峰中蛋白的纯度和分子量，确定目的蛋白的洗脱位置。将纯化后的单链抗体用超滤管进行浓缩，根据超滤管的规格和说明书进行操作，将单链抗体浓缩至所需浓度。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓缩后单链抗体的蛋白浓度。将蛋白溶液稀释适当倍数，按照试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上测定562nm处的吸光度值，根据标准曲线计算蛋白浓度。用SDS和Westernblot对浓缩后的单链抗体进行鉴定。SDS采用12%的分离胶和5%的浓缩胶，上样量为10-20μg，在120V电压下电泳1.5-2h，电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色液染色30-60min，再用脱色液脱色至背景清晰，观察蛋白条带。Westernblot将SDS分离后的蛋白转移到PVDF膜上，在250mA电流下转膜1.5-2h。转膜结束后，将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1-2h，以封闭非特异性结合位点。用TBST缓冲液（20mMTris-HCl，pH7.6，150mMNaCl，0.1%Tween-20）洗涤PVDF膜3次，每次5min。加入抗His标签的一抗（1:1000稀释），4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000稀释），室温孵育1-2h。用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5min。加入ECL化学发光底物，在凝胶成像系统中曝光，观察目的蛋白条带，验证单链抗体在毕赤酵母中的表达和纯化效果。3.6结果与分析在单链抗体表达量方面，大肠杆菌表达系统中，通过对IPTG浓度、诱导时间和诱导温度的优化，发现当IPTG终浓度为0.5mM，30℃诱导6h时，单链抗体的表达量相对较高，每升菌液可获得约50-60mg的包涵体蛋白。然而，包涵体蛋白需要经过复杂的变性、复性过程才能获得可溶性蛋白，在复性过程中，蛋白会有一定程度的损失，最终获得的可溶性单链抗体产量约为10-15mg/L。在毕赤酵母表达系统中，通过优化甲醇浓度和诱导时间，当甲醇终浓度为1%，诱导72h时，单链抗体的表达量达到较高水平，分泌到培养基中的单链抗体浓度约为20-30mg/L。虽然毕赤酵母表达系统表达的单链抗体为可溶性蛋白，无需复性过程，但从表达量上看，在本实验条件下，大肠杆菌表达系统在优化后获得的包涵体蛋白量相对较高，若能进一步优化复性条件，提高复性效率，其最终获得的可溶性单链抗体产量可能会超过毕赤酵母表达系统。从单链抗体的纯度来看，大肠杆菌表达系统中，利用Ni-NTA亲和层析法对包涵体蛋白进行纯化，经SDS分析，在27kDa左右出现单一的蛋白条带，表明纯化后的单链抗体纯度较高，可达90%以上。毕赤酵母表达系统中，同样采用Ni-NTA亲和层析法对分泌到培养基中的单链抗体进行纯化，SDS结果显示，在27kDa处也有明显的单一蛋白条带，纯度也能达到90%左右。两种表达系统通过亲和层析纯化后，均能获得较高纯度的单链抗体。在单链抗体的活性方面，通过ELISA检测，以人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞和人正常胃上皮细胞GES-1为抗原，结果显示，大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统获得的单链抗体均能特异性地与MGC-803细胞表面抗原结合，而与GES-1细胞的结合较弱，表明两种表达系统表达的单链抗体均具有良好的特异性。进一步通过Westernblot检测，使用抗His标签的抗体进行杂交，在27kDa处均出现特异性条带，与预期的单链抗体分子量相符，再次验证了单链抗体的特异性和表达的正确性。将两种表达系统获得的单链抗体作用于MGC-803细胞，采用MTT法检测细胞活力，结果显示，单链抗体能够抑制MGC-803细胞的增殖，且抑制效果随着单链抗体浓度的增加而增强。在相同浓度下，大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统获得的单链抗体对MGC-803细胞的抑制率无显著差异（P>0.05），表明两种表达系统表达的单链抗体在抑制胃癌细胞增殖的活性方面相当。四、免疫毒素scFv-TCS的制备4.1实验材料与仪器菌株与质粒：除了用于单链抗体表达的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)感受态细胞和原核表达载体pET-30a，真核表达载体pPIC9K外，还需要用于基因克隆和扩增的大肠杆菌JM109感受态细胞。新构建的重组质粒pET-30a-scFv-TCS和pPIC9K-scFv-TCS，分别用于在大肠杆菌和毕赤酵母中表达免疫毒素scFv-TCS。工具酶与试剂：除了构建单链抗体表达载体时使用的限制性内切酶NdeI、XhoI（用于原核表达载体构建），EcoRI、NotI（用于真核表达载体构建），T4DNA连接酶外，还需要TaqDNA聚合酶，用于扩增天花粉蛋白（TCS）基因。高保真DNA聚合酶如PrimeSTARHSDNAPolymerase，用于后续的PCR反应，确保基因扩增的准确性。dNTPMix，提供PCR反应所需的脱氧核糖核苷酸。DNAMarker和ProteinMarker，分别用于确定DNA片段大小和蛋白分子量。IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），作为原核表达的诱导剂，用于诱导免疫毒素在大肠杆菌中的表达；甲醇，用于诱导毕赤酵母中免疫毒素的表达。质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒，分别用于提取重组质粒、回收DNA片段和纯化PCR产物。Ni-NTA亲和层析树脂，用于纯化带有His标签的免疫毒素；SephadexG-25凝胶层析柱，用于去除免疫毒素中的小分子杂质，进一步提高其纯度。BCA蛋白浓度测定试剂盒，用于测定免疫毒素的蛋白浓度。细胞株：人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞、人胃癌BGC-823细胞，用于检测免疫毒素scFv-TCS的活性和细胞毒性；人正常胃上皮细胞GES-1，作为阴性对照细胞，用于评估免疫毒素对正常细胞的毒性。实验动物：4-6周龄的BALB/c裸鼠，体重18-22g，用于建立裸鼠移植性人胃癌模型，研究免疫毒素scFv-TCS的体内抗肿瘤作用。动物购自[供应商名称]，饲养于屏障环境动物房，温度控制在22-25℃，相对湿度为40%-70%，12h光照/12h黑暗交替，自由摄食和饮水。仪器设备：除了单链抗体制备过程中使用的PCR仪、高速冷冻离心机、恒温摇床、超净工作台、CO₂培养箱、凝胶成像系统、酶标仪、Westernblot转膜仪和电泳仪、超声波细胞破碎仪、冷冻干燥机外，还需要高压灭菌锅，用于对实验器具和培养基进行灭菌处理，保证实验的无菌环境。蠕动泵，在蛋白纯化过程中，用于控制溶液的流速，确保层析柱的正常运行。分光光度计，用于测量核酸和蛋白溶液的浓度，以及检测细胞的生长状态。4.2scFv-TCS基因的融合构建为构建免疫毒素scFv-TCS，需将单链抗体（scFv）基因与天花粉蛋白（TCS）基因进行融合。首先，从本实验室保存的天花粉蛋白基因文库中调取TCS基因。该基因文库是前期通过对天花粉总RNA进行逆转录，再利用PCR技术扩增TCS基因，并将其克隆到相应的载体中构建而成。使用特异性引物，通过PCR技术对TCS基因进行扩增。引物设计时，在TCS基因的5'端引入与scFv基因互补的序列，以便后续通过重叠PCR（SOE-PCR）技术进行基因融合。引物序列为：上游引物5'-[与scFv基因互补序列]ATGGCTGCTGCTGCTGCTGCTCCCAAGCAGGAGAACATCAAG-3'，下游引物5'-TTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTAT