T-SDYY 251-2026‘美红’苹果主要病毒病快速鉴定与高效脱除技术规程

ICS65.020.20CCSB05SDYYTechnicalcodeforrapididentificationandefficienteliminationofmajorviralIT/SDYY251—2026本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东园艺学会提出并归口。本文件起草单位：山东农业大学、山东省果树研究所、山东省烟台市农业科学研究院、山东烟富农业科技有限公司、烟台大为苗木有限公司、烟台市蓬莱区果业技术推广中心。本文件主要起草人：王楠、徐同尧、于蕾、刘文军、邹琦、陈学森、张宗营、尹成苗、李林光、王海波、何晓文、宋来庆、赵玲玲、王平、马明德、孙英杰、王继秋、徐月华、季兴禄。2T/SDYY251—2026‘美红’苹果主要病毒病快速鉴定与高效脱除技术规程本文件规定了‘美红’苹果的病毒病快速鉴定技术、病毒病高效脱除技术以及无毒苗木繁育的技术要求。本文件适用于‘美红’苹果无病毒苗木的培育和生产活动。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。NY329-2006苹果无病毒母本树和苗木NY/T1085-2006苹果苗木繁育技术规程NY/T2719-2015苹果苗木脱毒技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语与定义。4病毒病快速鉴定技术4.1病毒病类型苹果病毒病可划分为潜隐性与非潜隐性两大类型。生产实践中，针对‘美红’苹果需重点检测的病毒种类包括锈果类病毒（Applescarskinviroid，ASSVd）、坏死花叶病毒（Applemosaicvirus，ApMV）、褪绿叶斑病毒（Applechloroticleafspotvirus，ACLSV）、茎沟病毒（Applestemgroovingvirus，ASGV）及茎痘病毒（Applestempittingvirus，ASPV）。4.2待测样品总RNA的提取利用植物总RNA提取试剂盒提取待检测样品的总RNA。4.3RT-PCR引物设计按照附录A的序列进行引物设计。4.4RT-PCR扩增体系3T/SDYY251—2026ddH2O9.5μL。4.5RT-PCR反应程序95℃预变性30s，变性15s；茎痘病毒54℃、茎沟病毒58℃、褪绿叶斑病毒59℃、锈果类病毒58℃、坏死花叶病毒58℃退火15s，72℃延伸30s循环35次；72℃延伸10min。4.6琼脂糖凝胶电泳检测检测过程中同步设置阳性与阴性对照，具体操作如下：采用浓度为1%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，上样体积5µL～8µL，电泳缓冲液选用1×TAE体系；电泳时将仪器调至恒压模式，电压设置为154V，电泳时长保持在18min～25min，借助凝胶成像系统拍照记录电泳结果。结果判定标准为：若样品条带与阳性对照目的条带一致，则为阳性，携带病毒；若样品未出现对应目的条带，则为阴性，表明样品未携带病毒。5病毒高效脱除技术5.1离体植株无菌体系的建立按照NY/T2719-2015的规范要求进行幼芽脱毒处理；将处理后的幼芽接种至灭菌的初代培养基中，配方为MS+5.1g/L～5.3g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值调至5.8；接种后置于人工气候室培养，培养条件为温度25±2℃、光照强度3000lx、光照时长16h/d。培养约20d后，外植体即可萌动生长，以此建立离体植株的无菌营养繁殖体系。5.2继代培养在无菌条件下，将成功入瓶的试管苗转移至继代培养基中，配方为：MS+0.1mg/LIBA+0.5mg/L6-BA+琼脂5.1g/L～5.3g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，经过30d后可产生大量丛生芽。5.3超低温处理将继代培养的带毒离体植株转接至MS+6-BA1.0mg/mL+IBA0.2mg/mL培养基中，培养20～25d，选取再生芽中的单芽进行病毒检测，明确植株的带毒状态。选取株高1.0～2.0cm再生芽，在超净工作台上分割为单芽后，接种至含MS+0.4mol/L蔗糖+0.4mol/L甘油的培养基中，进行2d预培养。随后在解剖镜下剥取茎尖，放入60%玻璃化溶液PVS2中，于25℃条件下处理20min；随即转入经配方优化的玻璃化溶液PVS2（成分为MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4M蔗糖，pH调至5.8在0℃环境中处理100min，期间更换1次PVS2溶液；之后迅速投入液氮中保存70min。4T/SDYY251—2026从液氮中取出茎尖，立即置于40℃水浴中90s，再用1.2M蔗糖培养液处理10min，洗涤1次，直至茎尖漂浮于培养液表面即可。5.4病毒抑制剂处理将洗涤后的茎尖放置含利巴韦林20ug/L~25ug/L茎尖分化培养基上暗培养7d，然后转移至光照强度3000lx培养。30d后根据茎尖生长情况更换带有病毒抑制剂的培养基。待苗长至3cm时，取叶片进行病毒RT-PCR检测。经检测不含病毒后，该植株即可确定为无病毒母株。5.5无病毒母株生根培养将无病毒母株转接至生根培养基中培养，配方为1/2MS+IAA1.5mg/L+IBA0.2mg/L+5.3g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值调至5.8。培养20d～25d，待组培苗根系长度达1.0cm～2.0cm、根数不少于3条时，即可开展炼苗操作。5.6无病毒母株炼苗炼苗流程：先将生根组培苗置于自然光环境下炼苗2d；第3d拧松组培瓶瓶盖，第4d完全揭开瓶盖，每日早、中、晚各喷施清水1次；第5d用镊子取出组培苗，放入清水中清洗培养基残留。炼苗全程需置于室内背阴处，避免阳光直射及强通风环境。5.7无病毒植株的移栽经炼苗的无病毒组培苗，先用70%甲基托布津800倍液浸泡30s，再以湿润水草包裹组培苗基部1cm处，移栽至72孔育苗穴盘，将穴盘移入温室内的小拱棚中，棚顶覆盖塑料薄膜并加盖遮阳网，棚内湿度保持在65%～70%、温度维持在25±3℃。培育2周后拆除塑料薄膜和遮阳网，让幼苗适应棚内环境。再经3d适应性培养，将成活的组培苗转入50孔加深育苗穴盘，置于温室培