病理特殊染色PAS结果异常？颜色浅、背景深、染不均先按这张表排查

病理特殊染色PAS结果异常？颜色浅、背景深、染不均，先按这张表排查最近一直在做糖尿病肾病基底膜PAS染色切片，可结果总不尽人意。要么整张切片泛红、背景杂质重，根本分不清阳性区域；要么整体着色太浅，基底膜和细胞膜边界模糊，完全没法判读。明明都是按标准流程一步步操作，可镜下观察总是出问题。后来查了不少文献，也请教了师兄师姐才发现：染色翻车未必是染液本身的问题，更多是出在组织固定、脱蜡、氧化、梯度水洗这些细节步骤里。其实做PAS染色遇到异常，没必要一上来就换试剂、盲目改孵育时间。更靠谱的做法是：先根据镜下的染色表现，判定故障类型，再一步步逐项溯源排查诱因。我把这段时间实操总结的PAS染色常见翻车问题和对应解决办法整理好了，分享给做病理的小伙伴们参考。觉得实用的话，完全可以存下来或是打印贴在冰箱上，随时对照避坑。一、出问题后，先看对照：别一上来就改参数当PAS染色结果出现异常时，我们首先要做的不是换试剂，也不是调整时间，而是要先看阳性对照的染色情况。如果阳性对照也异常，那可能是染色体系存在问题，我们需要优先查看过碘酸、Schiff等试剂是否过期、颜色是否正常，然后再核查水洗、复染等过程是否存在问题。如果阳性对照正常，但染色背景普遍偏深，这时我们就要重点排查切片厚度、脱蜡水化程度及水洗、Schiff反应的时间了。如果阳性对照正常而实验样本异常，我们要重点检查样本的取材位置、固定方式、糖原或黏液阳性物质含量等过程了。所以，我们要先把问题分清楚，才能避免后面的调整不会变成“盲改”。二、PAS染色异常快速排查表建议大家先收藏这张表格。下次遇到颜色浅、背景深、染色不均、掉片等问题时，可以按照此表进行排查。异常结果优先排查解决方案染色浅氧化不足、Schiff试剂活性低、目标物质流失检查试剂；优化氧化或显示时间，过碘酸氧化时间增加5min，或者Schiff染色延长10min；检查样本固定、脱蜡等操作流程背景深Schiff反应偏长、水洗不足、切片偏厚、脱蜡不彻底缩短反应时间，降至10min；加强水洗，流水冲洗5-10min；切片应3-5μm；增加二甲苯处理时间，使切片完全脱蜡染色不均干片、染液覆盖不足、脱蜡水化不完全规范操作，避免切片裸露；滴染约100-200μL/片，完全覆盖切片核染色深苏木素复染时间偏长、分化不足缩短复染时间，30s-2min；延长分化时间3-5s切片脱落烤片不当、冲洗过猛使用防脱片；充分烤片，60℃烤片30-60min；温和冲洗样本阴性样本目标物质少、取材或固定问题查样本处理过程；核对样本阳性物质表达水平三、染色浅：要先考虑氧化时间我们常说的PAS染色颜色浅，是指本应紫红色的基底膜、黏液、糖原或真菌细胞壁，只呈现出淡淡的粉红色，甚至看不见。遇到这种情况，我们可能会一上来就怀疑Schiff染液失效了，直接将反应时间延长10min。但是这样做有点“简单粗暴”了。我们知道造成染色弱的原因有3个：氧化不足、Schiff活性差以及样本本身问题。所以排查思路应先看阳性对照的结果，如果其同样浅，则优先排查氧化和染色过程。如果阳性对照正常，则要重点查样本阳性物质含量、取材、固定这些因素了。在排查染色过程时，我们需要先查看过碘酸和Schiff试剂是否过期、变质。Schiff需要避光保存，且在使用前要恢复到室温。过碘酸将糖类结构氧化出醛基是PAS染色的关键，氧化时间不足、过碘酸浓度过低，都会影响染色结果。我们一般使用1%高碘酸氧化15min。四、背景深：先排查水洗操作理想的PAS切片应该是阳性物质清晰、背景干净、层次分明，但是我们的切片常常会“红的发紫”，阳性物质和周围组织没有“边界”，背景一塌糊涂。排查因素怎么判断如何解决水洗不充分水洗时间不足1min，背景脏流水冲洗5minSchiff染色时间过长超过30min可降到15min氧化时间偏长超过15min控制在10-15min五、染色不均：重点查是否干片你们是否碰到过这样的切片呢？同一张切片边缘颜色深、中间浅，或者局部颜色深浅不一，拍照时难选择合适的视野。遇到这种切片，我们可以按照下面的表格逐一排查：排查因素怎么判断如何解决干片操作过程中切片裸露超出1min，表面液体蒸发在整个操作过程中，组织区域不要干燥，裸露时间不超过1min染液覆盖不足染液只覆盖中央一般组织区域100—200μL/片，完全覆盖组织，并超出组织边缘脱蜡水化不完整局部染不上、颜色不匀二甲苯脱蜡要充分，每次10-15min六、染色浅：苏木素复染别超过2分钟正常的PAS染色结果呈紫红色，但是现在的切片整体偏蓝紫色，阳性物质不突出。这时需要我们进行如下的排查：排查因素怎么判断如何解决苏木素复染时长复染时间不应超过2min从30s-2min开始摸索苏木素是否新开新配或新开的苏木素染色更快缩短复染时间分化不足或返蓝过度核染深，背景偏蓝紫增加盐酸酒精分化时间，镜下观察复染整个过程时间较短，我们在操作时不应照搬别人的时间。因为不同实验室用的苏木素品牌、浓度不同，染色强度存在差异，我们应该先做预实验，摸索适合自己的染色时间。七、切片脱落：先看烤片过程是否达标在染色过程中，我们最担心的事情就是出现组织卷边、破碎甚至脱落。好不容易完成取材和切片，却在染色时掉片了。频繁掉片，建议先查一下烤片操作。常规石蜡切片需要在60℃烤片30-60min。易脱组织可延长至1-2h，但不建议长时间高温处理，以免影响组织结构。切片的厚度也是需要考虑的，常规切片为3-5μm。此外，水洗的方式也很关键。流水不要直接冲击组织区域，应该让水流沿着玻片边缘缓慢流下。同时也可以使用防脱载玻片。八、对照正常但样本不显色：别再反复换试剂我们是否也碰到这样的情况呢？同一批的切片中，阳性对照染色结果很好，但实验样本不显色或明显弱于预期。这说明染色体系大概率是不存在问题的，更换Schiff试剂、延长氧化时间是解决不了问题的。这时，我们需要确认样本阳性物质含量是否本就较低、取材是否包含目标区域、固定过程中是否造成阳性物质流失，糖原、黏液等受取材时间、代谢状态和固定方式影响较大。样本前处理不稳定，后面染色再标准，也可能看不到理想结果。结语总之，PAS