城市森林可培养空气微生物浓度特征分析

引言1.1研究背景在我国城镇化日益增加的今天，人们持续收到各种恶劣城市环境问题以及疲惫的快节奏生活的困扰，风景林能够满足人们对自然、纯净生活的向往，在城市发展中拥有越来越重要的地位。通过KDDILocationAnalyzer（一种基于人口普查和智能手机定位数据估算推断人口的网络应用程序）的数据分析发现自然步道游客在2020年急剧增加，城市公园的重复访问量同样有所增加，而这一趋势在2021年更加明显，突出显示了公众在疫情期间和之后对城市森林的持续青睐和更频繁的使用（Kimetal,2023）。因此，城市森林的开发和保护是城市可持续发展的生态基础，也是公共健康和福祉的重要保障。生物气溶胶是由生物材料或生物过程的副产物组成的，主要包括细菌、真菌、古菌、病毒、花粉、微生物片段和代谢产物（如内毒素、霉菌毒素和DNA）（Louetal,2023;张旭,2016）。每平方米空气中约含有几千至几百万的微生物，其组成浓度不稳定，种类丰富多样，能够以不具有生存能力的形式、处于休眠状态的形式或是以利用有机质主动进行代谢活动的形式存在（冯思宁,2022）。悬浮于空气中的微生物可形成各种各样的微生物气溶胶，并随气溶胶的流动进行传播和转移（Songetal,2021），不仅具有极其重要的生态功能，同时还与空气污染，人体健康密切相关，漂浮在空气中的细菌，真菌和病毒被吸附在与颗粒物相对应的细粉尘上，造成疾病的机会性病原体可以通过空气传播到人类的肺部和其他器官（唐小兰,2015;高梦珂等,2024）。空气微生物的来源呈现出明显的多样性特征（方建波,2018;方治国,2005）。人类活动会改变空气中悬浮颗粒物的大小，影响微生物在空气中的停留时间，从而间接改变空气中微生物的数量。人类生产活动如污水处理、垃圾处理、农业活动中的发酵过程等与大气微生物气溶胶密切相关（杨稀淇等,2023;饶滢等,2022）。最近的研究表明，城市森林结构和功能对空气微生物群落的形成和分布有着极其重要的影响并且景观格局、植物种类、土壤性质和人类活动也能够强烈的影响细菌和真菌种群。Li等人发现，在马尾松覆盖率超过30%的地区，细菌和真菌病原体丰度显著较低（Lietal,2021）。这表明森林组成是在影响空气微生物群落和减缓生物气溶胶相关健康风险的重要影响因素和决定因素。城市森林面临二氧化碳增加、气候变暖、干旱、野火、虫害爆发和氮沉降等挑战，而微生物介导森林对上述挑战的响应体现在真菌和细菌（Baldrianetal,2023）。同时，森林许多功能因全球变暖等因素在退化（Forzierietal,2022）。而气候条件的变化会直接和间接地影响微生物，影响空气中微生物的因素包括温度、湿度、PM2.5、空气负离子和气压，这些因素能够改变空气环境中的细菌和真菌群落组成。温度可以显著影响细菌群落的季节动态（Bowersetal,2011），同时，能够通过改变宿主植物的代谢率和挥发性化合物释放（Fröhlich-Nowoiskyetal,2016）间接影响真菌的季节性分布。在较低的湿度下也会增加增强气溶胶的电荷，从而有助于细菌的长距离传播（Lighthart,1997）。PM2.5还可以通过吸附和输送微生物成为其载体，从而有利于细菌群落的形成（Gaoetal，2017）。空气负离子可以通过静电中和破坏微生物细胞膜，从而显著降低空气中的细菌浓度（Jiangetal,2018）。此外，它们还促进了微生物气溶胶的凝结和沉降，降低传播风险（Kolaržetal,2023）。大气压力也起着作用——低压条件时会增加空气湍流，将地表微生物运送到更高的海拔高度（Santl-Temkivetal,2017），而高压条件时，则稳定大气并限制了垂直扩散，从而延长了高海拔地区的水平传输过程（DasSarmaPandDasSarmaS,2018）。了解这些相互作用将有助于在森林管理和减缓气候变化之间进行有效的协调（Ibáñezetal,2023）。生物和非生物因素影响空气中的微生物群落，使得这些群落表现出独特的生态和地理特征，它们的分布格局是由生物因素和非生物因素的共同驱动的（Šantl-Temkivetal,2022）。季节性气候变化是驱动城市森林中微生物群落长期空间和时间变化的主要因素（Núñezetal,2021），同时影响着空气质量。然而，关于影响城市绿地微生物组成和结构的关键因素的研究仍然有限，需要进一步调查以找到微生物层面的气候变化缓解策略。城市森林的建设和保护越来越受到重视（Uçaretal,2020），对城市森林中可培养微生物的相关研究也是大势所趋。长期以来，微生物的动态及其对人类健康的影响一直以来都备受关注（McSpaddeandWeller,2001;Zhangetal,2015），但很少有研究探讨可培养空气微生物的浓度特征及其与气候因子关系的相关性。本研究从微生物浓度特征入手，通过针对中国江苏省扬州市的茱萸湾风景区6种林分类型进行抽样分析，探究可培养空气微生物的浓度特征与气候因子的相关性，将为城市森林在城市环境中的重要功能提供更多的认知,并有助于更好地理解空气中微生物在气候和公共卫生中的作用。1.2研究目的和意义通过探究空气微生物，可以更全面、更深入的认识到生态系统的功能和运行原理，可以了解生态系统中最复杂的微生物相互关系和作用规律，也可以为城市绿地的建设提供创新思路和科学依据，根据不同植被对空气微生物的影响，选择能够有效调节空气微生物群落结构，减少有害微生物，改善空气质量的植被进行种植，以此调整城市森林的生态功能，改善城市居民的环境质量。位于江苏省扬州市的茱萸湾风景区是城市森林生态胜地，具有丰富的湿地资源以及多样的植物群落，是理想的科学研究基地。本研究以扬州市茱萸湾内的城市森林生态区为研究区域，选取区内具有代表性的6种城市森林植被类型——松柏林、杂交阔叶灌木林、杂交阔叶乔木林、山茱萸林、水杉林和竹林，进行月度取样检测，探讨城市森林可培养空气微生物的生物量和分布格局，同时分析影响城市森林可培养空气微生物的气候因子，从而为城市森林理想树种的确定提供理论依据。2材料与方法2.1研究区域概况本研究地点为江苏省扬州市广陵区的茱萸湾风景区，是江苏省扬州市国家城市生态系统定位观测研究站之一（Tangetal,2024）。地处北纬32.43°、东经119.48°，处于亚热带湿润季风气候与温带季风气候的过渡带，属于北亚热带湿润气候。根据多年气象观测数据显示，该地区的年平均气温为15.8℃，年平均降水量为864mm。为保证样本的多样性和代表性，选取了风景区内极具典型性的6种不同的林分作为样地：松柏林（SBL）、杂交阔叶灌木林（ZKG）、杂交阔叶乔木林（ZKQ）、山茱萸林（SZY）、水杉林（SSL）和竹林（ZL），它们的面积分别为8×10m、10×5m、10×8m、8×8m、8×8m、8×8m，平均树龄分别为5年、10年、8年、5年、5年和8年。2.2空气微生物采集本研究采用FA-1采样器（青岛聚创有限公司）收集可培养的空气微生物，包括真菌和细菌。改采样器分为6级，每级有400孔，从F1-F6的孔径逐渐缩小，空气流速逐级增大，从而将空气中的微生物粒子按不同大小捕获在各级的培养皿上。以28.3L/min的气流速度分级收集空气中的颗粒，具体分级如下：Ⅰ级（≥7.0µm）；Ⅱ级（4.7-7.0µm）；Ⅲ级（3.3-4.7µm）；Ⅳ级（2.1-3.3µm）；Ⅴ级（1.1-2.1µm）；Ⅵ级（0.65-1.1µm），采样时间大约为每次5min，并设置平行样（Xiuetal,2023）。采用9cm培养皿培养，采样前24h将培养皿进行灭菌处理（121℃，30min），然后加入30ml培养基，待采样完成后，迅速取出培养皿、并加盖倒置于培养箱内。细菌采用Luria-Bertani培养基，在37℃恒温培养箱内培养48h；真菌使用BengalRos培养基，在28℃恒温培养箱内培养72h。为防止交叉感染，在每一个林分采集样本完毕后，使用5%漂白剂和75%乙醇溶液对采样器进行彻底清洁。2.3可培养微生物浓度培育后，计数每个平板上的菌落形成单位（CFU），样品浓度以每立方米空气中的CFU（CFU/m3）表示。菌落的叠加是不可避免的，其是由于微生物颗粒在通过相同的筛孔冲击培养皿上同一位置导致的，因此使用式（1）对菌落数的计算进行了调整（Louetal,2023）。使用等式（2）计算采样器每个阶段（第1阶段到第6阶段）的细菌浓度；使用等式（3）计算采样器每个阶段（第1阶段到第6阶段）的真菌浓度；用等式（4）计算细菌的总浓度；用等式（5）计算真菌的总浓度；等式（6）计算微生物的总浓度；等式（7）计算细菌-真菌比例；等式（8）计算真菌-细菌比例。Pr=N[1/N+1/（N-1）+1/（N-2）+…+1/（N-r+1）] （1）BCi(CFU/m3)=（BTi×1000）/（t×F） （2）FCi(CFU/m3)=（FTi×1000）/（t×F） （3）BC=BC1+BC2+…+BC6 （4）FC=FC1+FC2+…+FC6 （5）TC=BC+FC （6）BP=BC/TC×100% （7）FP=FC/TC×100% （8）在方程（1）中，Pr表示每个阶段修正的菌落数，N是每个阶段的筛孔数，r是列举的菌落数。在等式（2）、（3）、BCi和FCi分别为采样器不同阶段（阶段1至6）的细菌和真菌浓度，FTi和BTi分别为不同阶段真菌和细菌的修正菌落数;i的范围是1到6。F是采样流速，单位为L/min，t是采样时间。在等式（4）、（5）、（6）、（7）、（8）、TC、BC和FC分别代表微生物、细菌和真菌的总浓度，而BC1至BC6是第1至第6阶段的细菌浓度。FC1到FC6代表阶段1到6的真菌浓度，而BP和FP是细菌和真菌浓度的比例。2.4小气候环境和数据收集在景区核心位置布设自动观测设备，从而对茱萸湾风景区的城市微气候进行观测。设备的进气口设置在离地面3m的地方，传感器实时收集气候数据。在研究期间，对可能影响可培养空气微生物的5个关键气候因子进行密切监测——空气温度、空气湿度、PM2.5、空气负离子浓度和气压。观测设备根据预设程序每小时自动收集一次气候数据，并将数据存储在系统中。对原始数据进行预处理，并使用R编程语言筛选和删除异常值和缺失值，以确保后续分析的可靠性。2.5统计分析使用R编程语言绘制了不同月份和不同林分的细菌计数、真菌计数和微生物总浓度的条形图。通过Kruskal-Wallis检验分析数据的正态性以及方差的同质性。此外，方差分析用于比较同一林分内不同月份的微生物浓度差异，以确定统计学意义。还使用R编程语言绘制了显示全年5个气候因子（空气温度、空气湿度、PM2.5、空气负离子浓度和气压）变化的密度分布图。使用统计软件计算颗粒物浓度、负离子、气压、空气温度、空气湿度、总微生物浓度、真菌浓度和细菌浓度等关键变量之间的相关系数，并分析其显著性水平（Nietal,2022）。每对变量之间的关系通过散点图直观地表示出来。最后，采用偏最小二乘路径建模（PLS-PM）来探索空气微生物与5个气候因子之间的相互关系，为气候条件如何影响空气微生物群落提供了见解。3结果与分析3.1不同林分空气微生物中细菌的比例分析分析了茱萸湾风景区各林分空气微生物中细菌计数的比例（图1）。结果表明，不同月份的细菌比例存在显着的季节性变化。SSL林分中的细菌比例于9月达到峰值95%，但在1月及4月的比例相对较低；SZY林分于1月份达到最大83%，而在3月比例却下降至10%；ZL林分最高比例达到了95%，在4月份比例迅速下降至5%；SBL林分的4月细菌比例为10%，在5月份增长至92%；ZKG林分中的细菌比例波动，整体维持相对较低，4月份为12%，6月份达到83%；ZKQ林分的细菌比例一般在30%以下，9月份是最低的为17%。SZY林分的细菌比例与其它林分差异显著，ZL林分与其它林分差异不显著。相比之下，ZKQ林分的大多数月份中一贯表现出显着较低的细菌比例，表明该林分中的空气有相对较少的细菌微生物。3.2不同林分空气微生物中真菌的比例分析本研究对茱萸湾风景区6个林分空气微生物中真菌的比例进行了分析。结果显示出明显的季节性变化（图2）。在SSL林分中，真菌比例在全年中波动很大，在1月和11月达到峰值，但从4月到9月保持较低水平。在SZY林分中，真菌比例在3月达到最高，12月又达到另一高峰，而1月和4月真菌比例较低。在ZL林分中，真菌比例较高的是7月份，其他月份真菌比例均较低且变化不大。在SBL林分中，真菌比例在1月和3月达到最高，而在今年的其他时间都保持较低且较稳定。在ZKG林分中，真菌比例在3月和12月最高，其他月份有细微变化。在ZKQ林分中，真菌比例在5月到9月一直保持较高水平且相对稳定，与其他月份有显著差异。经对比得出，SSL林分的真菌比例最显著。在SZY林分、ZKG林分和ZKQ林分中，真菌比例有明显爆发和周期性变化特征，而ZL林分受影响较小，一年中真菌比例都较为稳定。3.3不同林分空气微生物的总浓度分析不同林分中空气微生物的总浓度变化均显著，不同季节之间的变化差异明显（图3）。在SSL林分，空气微生物总浓度范围在47CFU/m3和3557CFU/m3之间，微生物浓度的最高值和最低值的差异较大。在SZY林分，微生物浓度在4月、6月、8月较高，表面存在间歇性的高峰生长期。在ZL林分，6月份的微生物浓度明显高于其他月份，在全年其余时间内微生物浓度较低且相对稳定。在SBL林分，微生物浓度维持相对稳定的状态，有小范围的波动。在ZKG林分，微生物浓度全年波动，但整体保持较低水平。在ZKQ林分，微生物浓度波动较大，6月达到最高，2月和12月浓度相对较低。3.4气候因子的变化通过观察AM、AT、NAI、PM2.5和AP可以发现，AM通常会维持在90%以上，尤其实在夏季，而到了冬季通常保持在50%左右，在某些情况下甚至会下降（图4a）。AT一般而言在夏季比较高，并且通常超过25℃，但在冬季会显著下降，一般接近0℃（图4b）。NAI在4月至5月和9月至10月表现出相对较高的峰值，而在其他月份则处于较低水平（图4c）。PM2.5的浓度在冬季呈上升趋势，但在夏季依旧维持较低水平（图4d）。AP全年都维持在一个相对稳定的水平，除了在1月记录的数值较高，7月至8月观察到的数值较低（图4e）。3.5相关性分析研究了8个因子（PM2.5、NAI、AP、AM、AT、TC、FP和BP）之间的关联性（图5），结果表明，这些因子之间存在不同程度的正相关。总微生物浓度（TC）与NAI在0.05的显著性水平上呈显著正相关，相关系数为0.388，表明存在中度共变异趋势。细菌总浓度（BP）与PM2.5在0.01显著性水平上呈显著正相关，相关系数为0.460。此外，BP与AP显著性水平上表现出很强的正相关性，相关系数为0.479，表明BP、PM2.5和AP之间存在密切关系。真菌总浓度（FP）与AP在0.01显著性水平上呈正相关，相关系数为0.445。FP在0.01显著性水平下与PM2.5表现出更强的相关性，相关系数为0.457，表明FP、PM2.5和AP之间也存在密切关系。3.6气候因子、细菌浓度、真菌浓度和总微生物浓度之间的关系采用偏最小二乘路径建模（PLS-PM）对气候因子、FP和BP进行建模，以更好地分析可培养的空气微生物的影响（图6）。结果表明，PM2.5、AP、AT、AM、NAI均与气候因子显著相关。其中AM的显著性与气候因子的相关性最强，这表明AM是影响气候条件的重要因素。气候因子对TC有显著的正向影响，通径系数为0.8849，这表明气候因子对微生物的调控有着重要的作用。同样，气候因子对FP和BP都具有强烈的影响，强调了气候因子在影响微生物浓度的作用。4讨论研究分析了不同林分类型中可培养空气微生物的浓度特征和变化趋势，以及气候因子与空气微生物之间的相关性。从真菌和细菌数量的比例方面，ZKG林分在夏季呈现出较高的细菌数量比和较低的真菌数量比，而在冬季则是呈现出较高的真菌数量比和较低的细菌数量比。相比之下，ZKQ林分呈现出与ZKG林分相反的季节动态。该季节动态表明ZKG林分和ZKQ林分能更好地适应城市气候条件的变化（NúñezAetal,2021），从而为微生物群落结构在季节动态变化中能够保持相对稳定的环境，此外，气候因子的季节性变化对微生物浓度和空气质量变化有着重要影响。研究表明，由阔叶树和针叶树组成的混交林具有很强的抗菌作用，是改善空气质量和保护公众健康的良好选择（Chenetal,2019）。ZKG林分和ZKQ林分的季节动态变化可能与其混交林组成的抗菌特性密切相关，这一特性有利于调节空气中的微生物浓度，进而提高城市环境的生态系统服务。虽然ZKG林分和ZKQ林分是有前途的城市林业树种，但必须在考虑城市功能分区、空间格局以及小气候特点的情况下，规划并建设适宜的城市森林（GodefroidandKoedam,2003）。研究表明，城市森林恢复计划能显著增加城市老年人的福利，并最终提高他们减轻压力和忧郁的能力，提升生活质量。与细菌和真菌浓度逐月动态变化，结果证明了微环境尺度上的不同林分对森林生态系统中的微生物浓度和微生物群落的动态变化起着至关重要的调节作用，表明存在明显的异质性。同时，鉴于其适应不同气候条件和独特的代谢特征，微生物多样性也在减轻气候变化的不利影响方面发挥重要作用。微生物及其生物成分可通过提供适应性反应来抵消这些影响（Elshafei,2022）。此外，某些微生物菌株有助于森林的生长和恢复力（Valiullinetal,2023）。微生物在应对全球气候变化方面有着巨大的潜力，但也存在诸多挑战。JustinV.Remais认为，在全球变暖以及其他气候变化的影响下，空气传播病原体的复制、老化和传播率会被波及，病原细菌、原生动物、病毒和真菌对这些变化的响应会出现显著变化（Hutchinsetal,2019）。森林在气候调节中发挥至关重要的作用（CanadellandRaupach,2008），同时菌根真菌、腐生真菌、细菌和真菌性植物病原体的表现和平衡是影响森林未来发展的关键因素（Baldrianetal,2023）。在本研究中，我们观察了不同林分中细菌和真菌相对丰度的动态消长波动。例如，在1月份，SSL林分中的细菌浓度较低，而真菌浓度相对较高，但在2月份，细菌浓度较高，真菌浓度较低。该现象说明，即使在同一地点，空气微生物群落也会因季节变化而变化（Calderón-Ezquerroetal,2021）。这些变化可能与气候因子和微生物之间的相互作用密切相关（Greilingeretal,2020）。这一结论得到了PLS-PM结构方程模型的进一步支持，该模型表明气候因子直接影响细菌和真菌的浓度。结果表明空气微生物浓度在很大程度上受气候因子变量的影响，多种因素共同作用影响着不同微生物类型。气候因子控制着微生物的产生、释放、扩散和沉积，对空气中生物颗粒的多样性和丰度产生制约作用（Zhaietal,2018）。研究表明，无论地理位置或主要气候条件如何，空气温度（AT）和空气湿度（AM）都是影响大气中干孢子浓度的重要参数（PyrriandKapsanaki-Gotsi,2017），这一发现与我们的研究结果一致。具体而言，AM（0.9378）和AT（0.8546）表现出与气候因子的最强相关性，间接表明AM在微生物中起着关键的调节作用。虽AT对此也有贡献，但并不是主要决定因素。此外，微生物浓度受多种因素的综合影响，AM会比AT产生更复杂的重要影响（Zhangetal,2023）。与此同时，城市特征也会