隐孢子虫病诊断技术

本文件规定了隐孢子虫病的临床诊断、样品采集/保藏和运送、饱和蔗糖漂浮卵囊富集，隐孢子虫病的病原学、免疫学、分子生物学诊断技术及其综合判本文件适用于动物隐孢子虫病的诊断和流行病学调查及检疫、检验GB/T6682分析实验室用水规格和NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范6-ROX：6-羧基-X-罗丹明(6-Carboxy-XELISA：酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)HRP：辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase)PBS：磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSalinPCR：聚合酶链式反应(PolymeraseChainReactiorpm:每分钟转速（RevolutionsPerMinute）SSUrRNA：小亚基核糖体RNA(SmallSubunitTAE：Tris-乙酸电泳缓冲液(Tris-acetate-EDTABu5.1流行特点5.1.1可感染牛、羊、猪和禽等多种动物，以犊牛、羔羊、仔猪和雏鸡等幼龄动物的发病5.1.2隐孢子虫没有严格的宿主特异性，可通过被感染动物粪便污染的食物和饮水而经5.1.4卵囊对绝大多数消毒剂有较强的抵抗力，持续的热蒸汽处理和强烈的紫外线可以杀死卵5.1.6隐孢子虫感染禽类宿主超过30种，包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌5.2临床症状5.2.1家畜肠型隐孢子虫病：微小隐孢子虫是犊牛、羔羊、仔猪等断奶前幼龄家畜腹泻的最多数动物肠型隐孢子虫病，症状轻重程度不一，多表现为轻度腹泻或未有明显症状。5.2.2家畜胃型隐孢子虫病：虫体在皱胃进行内生发育，主要由安氏隐孢子虫引起，主要感染5.2.4禽肠型隐孢子虫病：多见于火鸡，主要5.3病理变化5.3.1家畜肠型隐孢子虫病，主要引起小肠远端肠绒毛萎缩、融合，表面上皮细胞转变为低柱形细胞，肠细胞变性或脱落，肠绒毛变短，有炎性细胞浸润5.3.2家畜胃型隐孢子虫病，主要引起胃腺增生，隐窝扩张，黏膜固有层显著的炎性细胞浸5.3.3禽呼吸道型隐孢子虫病：主要引起呼吸道上皮细胞肥大、增生、黏膜增厚、黏液细渗出5.3.4禽肠型隐孢子虫病：回肠绒毛萎5.4结果判定6.1仪器设备6.2.60.5mL、1mL、2mL6.3样本的采集6.3.2确定采血部位，在颈静脉或尾静脉处，使用真空抗凝采血管分别采集3mL~5进行局部消毒，采血过程中应避免样本污染，全血采集后，采用自然凝固方法进行血清的分离。6.3.3每份样本标记编号、名称、动物来源、品种、年龄、健康状况、采样时间、采集地点及采集人和6.4样本的保存和运送6.4.1样本采集、保存和运输按照NY6.4.2采集的粪便样本在2℃~8℃的条件下保存应不超过72h；长期保存的样本需加入等体积5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器内于4℃保存。经检测为阳性的粪便样本应在发出报告后立即按相关生物安全要6.4.3血清长期保存需分装后置于6.4.4样本运送应放在不透水、防泄漏的容器内，保证完全密封。将上述容器置于结实、不透水和防泄7.1仪器设备7.2试剂材料7.3粪便样本预处理烧杯中，加入30mLPBS，搅拌均匀7.3.3剩余滤液以3000rpm离心10min，弃上清。沉淀加入等体积的5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器7.4涂片制备与固定品悬浮液平铺于载玻片上，制备厚度适中的标本涂片（），7.4.2固定：用滴管吸取2-3滴的固定液（甲醇溶液均匀地滴加于粪液涂片上7.7质控标准7.8结果判定7.8.2阴性：在涂片标本中未观察到隐孢子虫卵囊，则判为隐孢子8.1仪器设备8.2试剂材料8.3卵囊富集8.3.2用玻璃棒彻底搅拌混合均匀至无颗粒物存在，使沉淀完全乳化，以3000rpmg离心2min。8.4显微镜检查8.5质控标准8.6结果判定），9.1仪器设备9.2试剂材料9.2.9底物显色液，按A.109.3操作步骤9.3.1待检血清灭活：待检动物血清用稀释液按1:5稀释后置于60℃水浴灭活30min。9.3.2抗原包被：用包被液稀释可溶性全虫抗原至浓度为2.5μg/mL，包被到酶标板，100μL/孔，4℃孵9.3.3第一次洗涤：将酶标板甩干，每孔加入洗涤液300μL9.3.6加样：在相应的孔中分别加入样品9.3.8加入酶标二抗：加入相应的HRP标记的兔抗牛或羊IgG（H+L）二抗（按照说明书标注浓度范围），9.3.11终止：用微量移液器每孔加入50OD450-PC——阳性对照样品在波长450OD450-NC——阴性对照样品在波长450nm处的平均O9.4结果判定9.4.1当OD450-PC＞1.0，OD450-NC＜0.4，试验成立。10.2.6粪便基因组DNA提取体积(μL）Mg2+1），10.8.1待检样品在相应目的片段（830bp10.8.2在相应目的片段处无特异性条带或扩增条带片段大2检测任一结果为阳性者，判定为隐孢子虫感A15%重铬酸钾溶液称取重铬酸钾5.00g，加蒸馏水定容至100mL，在1配制0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液所用试剂如下：——0.39gNaH2PO4•H2O；——1.93gNa2HPO4•7H2O；将称取好的上述试剂加入800mL蒸馏水，搅拌均匀使其充分溶解，用稀盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值至7.2，加蒸馏水定容至1000mL，在1.0A.3强石炭酸品红2000mL。使用沃特曼1号滤纸过滤后，A.40.4%孔雀绿将孔雀绿加入去离子水中，搅拌至完全溶解，使用沃特曼1号滤纸过滤即可。A.6饱和蔗糖溶液将蔗糖加入去离子水中，加热至完全溶解，冷却后取上清置于4℃备A.7包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，——2.93g碳酸氢钠NaHCO——1.59g碳酸钠Na2CO3；将称取好的上述试剂加入800mL蒸馏水，搅拌均匀使其充分溶解，用稀盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值至9.6，在1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌30min，4℃保存备用。A.820×洗涤液（pH7.4）——5.0gNa2HPO4•12H2O；——70.0gNaH2PO4•2H2O；将称取好的上述试剂或溶液加入800mL蒸馏水，使用pH计测量溶液的pH值钠溶液微调pH值至7.4，加蒸馏水定容至1000mA.9封闭液——1.60g柠檬酸C6H8O7；——0.95g柠檬酸C6H8O7；A.11终止液（2mol/LH2SO4）——11.10mL浓硫酸H2SO4；——37.2gNa2EDTA•2H2O；加蒸馏水800mL搅拌均匀使其充分溶菌30min，保存于室温。使用时加蒸馏水稀释成1×TAE缓冲液。将称取好的溴化乙锭加蒸馏水定容至100mL，磁力搅拌充分溶解后，棕色瓶内室温保存。B.1改良抗酸染色过程中红色椭圆形或圆形，直径5μm~10μm的隐孢子虫卵囊见图B.1B.2饱和蔗糖溶液漂浮法粉红色椭圆形或圆形，直径约5μm~10μm的隐孢子虫卵囊见图B图B.2微小隐孢子虫卵囊（左图）和安氏隐孢子虫卵囊（右图400×)C.1饱和蔗糖溶液漂浮检查法制作的特质吊环，用于蘸取液