高三生物二轮复习课件微专题-引物

二轮微专题难点突破引物与PCR一、PCR/DNA复制为何需要引物？体内DNA复制和PCR中的引物有何区别？DNA聚合酶无法从头开始合成新的DNA链，只能将单个脱氧核苷酸（dNTP）添加到已有核酸链的3'端，因此必须依赖引物提供一个游离的3'-OH基团作为起始点来延伸DNA链。‌

体内DNA复制：一小段RNA片段，多种PCR：一小段DNA片段（20-30个bp），通常是两种引物过长会导致其延伸温度提高,不适于耐高温的DNA聚合酶进行反应;引物过短特异性差,可导致引物与模板链随机结合。PCR中使用的引物应具备的特点:①引物能与DNA模板的碱基进行互补配对。②2种引物之间不能有互补的碱基序列,避免引物形成双链,导致扩增失败。③某一引物不能存在局部碱基序列互补配对,避免自身出现折叠配对,无法和模板DNA结合。④多数情况需要在2种引物的5'端添加不同限制酶识别的碱基序列,扩增出的DNA片段可以使用相应限制酶切割后与载体正向连接。⑤引物不能太短,以防扩增出非特异性DNA片段(非目的基因)。二、引物设计的依据：一段已知的目的基因的碱基序列1.已知：已知该生物的该基因（序列数据库）

已知亲缘关系较近物种的该基因（序列数据库）例：苏云金芽孢杆菌中含有一种抗虫基因（Bt基因），通过产生苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，培育了抗虫棉，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。回答下列问题：可利用PCR技术获取并扩增Bt基因，前提是要有一段Bt基因的核苷酸序列，这是因为

。答案：利用PCR技术获取并扩增Bt基因需要2种引物，合成引物的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列（1）两端例：2021年11月24日，南非首次报告了新冠奥密克戎变异株的感染病例，此后迅速传播至全球多个国家和地区。与其他新冠病毒相比，奥密克戎具有高度的传染性，是因为刺突蛋白(S蛋白)变异多达43处，但因奥密克戎在肺部等组织中不易繁殖，所以致病性较弱。S蛋白是新冠病毒(+RNA病毒)识别宿主细胞受体的一种关键蛋白。请回答：据图1分析，要获取大量S蛋白基因应选择的引物是

。通过电泳鉴定PCR的产物，结果如图2所示。

2.一段已知的目的基因的碱基序列例：（2023合肥二模）干扰素在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病及多种癌症，传统生产干扰素的方法是从人体的白细胞内提取，产量极低。1993年，我国批准生产由侯云德院士研究和开发的药物重组人干扰素a-1b，它是我国第一个具有自主知识产权的基因工程药物，通过转基因的大肠杆菌来生产，产量得到大幅度的提高。回答下列问题:(1)从中国人体脐带血白细胞中提取干扰素基因的mRNA，通过

的方法合成目的基因，再通过PCR技术扩增。扩增时，引物与模板链的

端碱基互补配对。逆转录3’例：（2020江苏高考）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoRI酶切为例）：（2）中间②④例：为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1～4结合位置如图所示，→表示引物5'→3'方向）。回答下列问题：（3）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验①和④的作用是

。②无扩增产物，原因是

，③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是

。（3）

作为对照（鉴定反应体系是否有模板污染）Po不含与引物1和引物2互补的碱基序列

目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段三.温度设定例：研究发现，某些植物的种子脱水数十年后复水仍能够恢复活性，原因是细胞中积累了海藻糖。科研人员拟将酵母菌的海藻糖合成酶基因（TPS）转入小麦中，培育具备抗旱特性的小麦。下图标注了载体、TPS基因的酶切位点和预期的基因表达载体的结构，表格列举了限制酶的识别序列。(1)为了扩增TPS基因，并使其能与图中质粒正确连接，需根据_________、_________设计两种引物。进行PCR扩增时引物的作用是_________。据图分析，选出合适的引物序列_________。A.5′-GGATCCGAATCGAACGATTAGCAACT-3′B.5′-GGATCCAGCCTAACGTACAAGTTCGT-3′C.5′-GAGCTCAGCCTAACGTACAAGTTCGT-3′D.5′-GAGCTCGAATCGAACGATTAGCAACT-3′(2)PCR扩增产物可根据_________不同，用_________技术进行鉴定。检测结果表明，在目的基因对应的条带之外，仍存在其他杂带，可能的原因有_________（答出2点即可）。(1)TPS基因两端的核苷酸序列BamHI和Sacl识别核苷酸序列使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核糖核苷酸AC(2))DNA分子的大小和构象(大小、形状、电荷）琼脂糖凝胶电泳引物特异性不强、退火温度过低、模板DNA污染(三个答案中任取两个）1.Tm值：指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，亦即DNA变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度。Tm值是衡量引物与其互补序列之间结合强度的一个指标。对于PCR而言，Tm值决定了引物与模板DNA结合的最佳温度--复性温度。2.复性温度过高

扩增效率降低：引物与模板DNA结合困难，导致扩增产物量少，电泳条带不清晰甚至无条带。虽然能减少非特异性结合，但过高的温度可能使引物无法与模板有效结合，导致实验失败。3.复性温度过低

非特异性扩增增加：引物易与模板DNA的非特异性位点结合，产生大量杂带，电泳图谱中条带模糊、弥散。除目标片段外，还包含大量非特异性扩增产物，影响后续分析的准确性。例：（2024合肥二模）环境DNA（eDNA）是指生物体经由体表、排泄物或细胞死亡裂解等释放到环境中的DNA片段。借助eDNA技术可以检测样品中是否存在目标生物，相关技术流程如图1所示。研究人员利用该技术对某地区不同水体的福寿螺分布情况进行了调查。回答下列问题：(1)采集到的水样经过滤后可获取eDNA，为防止污染，所用器材在使用前均需进行____处理并分开存放，且每个样点需使用等体积的____作为阴性对照。(2)对提取到的eDNA进行PCR扩增，需根据福寿螺线粒体的特有基因设计引物。如要扩增图2所示的DNA片段，下表中适合的引物是____（填序号）。设置PCR仪的循环程序时，①62℃，30s；②72℃，60s；③95℃，10s三组参数，在每一轮循环中依次经历的顺序是____（填序号）。（1）灭菌

无菌水

（2）①⑧③①②引物设计需要在扩增特异性和高效性之间取得平衡--复性温度变性（90℃以上）、复性（50℃左右）、延伸（72℃左右）

复性温度的主要影响因素：1.Tm值：一般为Tm值减去5～10℃2.引物的长度和碱基组成：（1）长度：较长的引物通常具有更高的Tm值，复性温度也会相应较高。一般引物长度在20~30个核苷酸之间。

（2）碱基组成：富含GC碱基的引物，由于GC对之间形成三个氢键，结合更稳定，Tm值较高，复性温度也需相应提高；而AT含量较高的引物，Tm值较低，复性温度也较低。（3）复杂性：模板DNA序列越复杂，非特异性结合的可能性越大。

（4）浓度：高浓度的模板DNA可能增加非特异性结合的风险，此时可适当提高复性温度，以提高结合的特异性变性（90℃以上）、复性（50℃左右）、延伸（72℃左右）

延伸温度的主要影响因素：1.PCR延伸温度的设定主要取决于DNA聚合酶的来源和特性，因为不同来源的酶具有不同的最适活性温度范围。例如，Taq酶通常需要72°C左右的温度以保持高效催化活性，而其他耐热聚合酶（如Pfu酶）可能要求更高或更低的温度。‌2.引物和模板特性也会影响延伸温度的选择。‌引物的长度和GC含量通过熔解温度（Tm）间接影响，较长或高GC含量的引物需要更高的复性温度以确保特异性结合，这可能要求延伸温度相应调整以维持模板-引物复合物的稳定性；此外，扩增片段的长度和复杂性（如二级结构）会影响延伸时间，但温度需与酶活性匹配。‌3.反应体系的离子浓度和pH值是关键因素。‌Mg²+浓度作为DNA聚合酶的辅助因子，直接影响酶活性和特异性；Mg²+浓度过高或过低会改变酶对温度的敏感性，通常需通过实验优化以确保延伸效率。‌4.抑制物的存在可能干扰延伸过程。‌样本中的内源性或外源性抑制物（如血红蛋白、肝素）可能通过失活酶或干扰模板结合来间接影响温度需求，需通过纯化或添加辅助因子来缓解[2021·天津·16](1)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG,且能通过双酶切以正确方向插人质粒,需设计引物1和2。其中引物1的5'端序列应考虑：

和

。包含BamH的识别序列

将GTG改为ATG四.引物修饰例：科研人员获取了PHB2蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），利用基因工程的方法使大肠杆菌表达该蛋白，以便进一步检测PHB2蛋白抑制肿瘤细胞增殖和扩散的效果。下图1是phb2基因编码区序列以及两端需添加的、能被相关酶识别的序列，图2为研究所用表达载体示意图，表格为有关的限制酶种类及识别序列和切割位点。回答下列问题：(1)在利用PCR扩增phb2基因时，为了使PCR产物能被限制酶切割，以便构建基因表达载体，可以考虑在引物的_____________（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列。据图可推断，扩增α链时需添加的限制酶识别序列以及所用引物的碱基序列是5'__________3'。已知AUG为PHB2蛋白合成的起始密码子，则构建符合要求的表达载体所用的工具酶有PvitⅡ、SpeI____________________________。(2)将符合要求的基因表达载体导入工程菌后，可用____________技术检测PHB2蛋白是否合成，通过提取、分离和纯化，从发酵液中获得该蛋白。为防止PHB2蛋白在工程菌细胞中被降解，在发酵过程中应选用________________________缺陷型工程菌作为受体细胞，且在发酵结束后的纯化过程中应添加蛋白酶抑制剂。(1)5’端CAGCTGTCATTTXbaI、T4DNA连接酶(2)抗原-抗体杂交

蛋白酶在引物的5’端添加限制酶的识别序列添加酶切位点、加标记荧光、引入突变位点、缺失突变序列、启动子序列等五.引物种类例：谷蛋白含量低的稻米适合肾病患者食用。自然条件下，野生型水稻中基因B1与B2之间以及B2的DNA片段发生部分缺失，会形成低谷蛋白水稻LGC-1，机理如图1所示。在研发、鉴定低谷蛋白水稻时，使用的PCR技术仅能扩增2kb以内的片段。回答下列问题：(1)产生LGC-1的变异类型属于______。已知基因B1与B2的序列相同，而LGC-1中基因B2失去了______，导致转录得到的mRNA内部形成互补的双链结构，从而影响了该基因的______过程，谷蛋白合成量减少。在鉴定野生型植株和LGC-1时，若选用引物______（填字母）进行PCR，出现阳性结果的只有LGC-1。基因突变

终止子

翻译

LKNL(2)科研人员构建基因编辑载体，对水稻细胞内基因B1、B2的DNA片段进行剪切，研发同类型低谷蛋白水稻。研发中，可选择限制酶______对图2所示的基因编辑载体和Ti质粒进行酶切，利用______酶将酶切产物连接，形成重组Ti质粒；再将其导入______处理过的农杆菌；然后，利用含重组Ti质粒的农杆菌侵染野生型水稻愈伤组织，在含有______的培养基上筛选。基因编辑载体在水稻细胞内表达，生成的产物能特异性识别并剪切Spl、Sp2序列，使水稻DNA断裂，细胞自身对DNA断裂处进行修复的过程中可能会丢失DNA片段。(2)BamHI、HindⅢ

DNA连接酶

氯化钙

潮霉素经基因编辑处理，基因B1、B2的DNA段中存在不同程度的缺失，形成了多种突变体。若要筛选出图3所示类型的突变体，需选用引物______（填字母）进行PCR,经电泳验证，结果为阳性。为了进一步鉴定该植株是否具备目标性状，还需要测定______，并与野生型、LGC-1相对比。两种一种多种(3)M、N

水稻籽粒谷蛋白含量PCR技术不仅可以扩增目的基因，还可用于定点诱变目的基因等。大引物PCR就是一种定点突变技术。大引物PCR需要用到引物进行两次PCR，其操作步骤如图∶

在第一次PCR反应中，形成图示双链DNA至少要经过_____次复制。第一次PCR产物DNA的_____条链作为第二次PCR所用的引物。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是____________________________________。1

目的性强、突变概率高Ca22六.不同的PCR类型1.大引物PCR总共需要设计三种引物六.不同的PCR类型例：IKK激酶由IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR

定点诱变技术获得突变基因，并培育出SCID模型小鼠。图1为定点诱变获得突变基因的过程。(1)在定点诱变获取突变基因时，在引物A、B、C、大引物a、b中PCR₁中使用的引物有__________，PCR₂中使用的引物有____________。(2)PCR

在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95℃数分钟进行预处理，其目的是增加大分子模板DNA彻底_____的概率。由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR₂复性过程中应采取的措施是适当______________退火温度。1.大引物PCR引物A、引物C引物B、引物b变性、提高2.逆转录PCR：提高RNA检测的灵敏度，广泛用于遗传病的诊断，可定量检测某种RNA的含量，比如新型冠状病毒的检测例：反转录PCR又称逆转录PCR(RT-PCR)，是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是（）A．若将②过程形成的双链cDNA进行10次循环，则需要211-2个引物B．通过RT-PCR，在基因工程操作中可以依据产物量的多少来检测目的基因的转录水平C．经过引物P1扩增后得到的产物是mRNA-cDNA杂交链，此杂交链若进行①过程，还需要高温变性D．引物P1和P2连接在模板链的3'端，子链延伸时4种脱氧核苷酸要加到引物的5'端

D

需要用到引物进行4次PCR，其操作步骤如图。图中所示的4次PCR如何选择引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若不选用该引物则划“×”）。

引物A引物B引物C引物DPCR1

PCR2

PCR3

PCR4

√√√√√√××××××××××3.重叠延伸PCR如何通过PCR技术，构建融合基因？3’3’5’5’

例：磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图。（1）无缝连接时，过程①中使用T5核酸外切酶目的是____。过程③所需的酶有____。沿着5’→3’的方向水解DNA形成黏性末端

DNA聚合酶和DNA连接酶（2）PCR技术分别扩增PABD和GFP基因时，配制的两个反应体系中不同的有模板和引物。引物R1的设计需依据____的核苷酸序列。据图分析引物F1和R2分别为____（填序号）。A.5’-TCCGGACTCAGATAGC-3’B.5’-AGGCCTGAGTCTATCGTTATGTCCGGACTCAGATAGC-3’C.5’-GCTATCTGACTCCGGACTTGTACAGCTCGTCGTCTCA-3’D.5’-TCCGGACTCAGATAGCTATCGATGCGCAGCTGACGA-3’载体一端和PABD基因一端

AC例：In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15～20bp），然后用In-Fusion酶（能识别双链线性化DNA片段5'→3'末端16个碱基，并使其降解）处理即可实现无缝连接。如下图所示，它的操作步骤大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒的同源区域在In-Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题：

重叠延伸PCR和无缝克隆技术的核心区别在于：‌重叠延伸PCR通过引物设计实现基因片段的体外拼接，而无缝克隆则依赖酶切和重组实现载体与片段的高效连接‌。具体差异如下：无缝克隆和同源重组的核心区别在于：‌无缝克隆是体外酶促反应，而同源重组依赖细胞内重组酶‌。具体差异如下：一、技术原理‌无缝克隆‌：通过Gibson组装（T5核酸外切酶+DNA聚合酶+DNA连接酶）在体外完成DNA片段组装，需设计15-25bp同源臂。‌同源重组‌：依赖细菌重组酶（如RecA）在细胞内完成，通过同源序列配对实现精准连接。二、操作流程‌无缝克隆‌：PCR扩增片段→混合线性化载体与重组酶→转化感受态细胞。‌同源重组‌：设计同源臂引物→PCR扩增→重组酶反应→转化筛选。三、适用场景‌无缝克隆‌：适合多片段组装、多位点突变，但阳性率较低（易脱靶）。‌同源重组‌：阳性率>95%，适合大片段（50bp-10kb）克隆，避免细菌基因组插入风险。例：（2025安徽卷）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。（1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是________。（1）稀释涂布平板法

分离不同条件下生长的内生放线菌

（2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。

采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落________（填序号），出现菌落④的可能原因是________。（2）指数级扩增

②

重组质粒通过（单交换）同源重组整合到了内生放线菌的基因组中

4.实时荧光PCR：一对引物和一个探针早期诊断，灵敏度高和特异性强例：科研人员提取大肠杆菌的基因组DNA，并根据大肠杆菌菌群相对保守的uidA基因序列，设计特异性引物，建立实时荧光定量PCR反应体系，成功检测出不同水域单位体积水体中大肠杆菌uidA基因数。荧光定量PCR技术的原理如图所示，同一探针上的淬灭基团会抑制报告基团发光。实时荧光定量PCR反应系统实现了荧光信号的累积与PCR产物形成的完全同步。下列说法错误的是（）（注：Ct值是指PCR扩增过程中，缓冲液中的荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。）A．扩增大肠杆菌基因组中的哪个基因片段是由引物决定的B．探针完整时有荧光，TaqDNA聚合酶移动至探针处时探针被切断，荧光消失C．模板中uidA基因的数量越多，Ct值越小D．若用cDNA作模板，荧光定量PCR技术可用于检测某基因的表达水平B5.反向PCR：扩增已知序列两端的未知序列例：反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的是（）A．应选择引物1和引物4进行PCR扩增B．设计的引物中GC碱基含量越高，复性时需要的温度越低C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶A6.巢式PCR：两对引物--第二次PCR确保了扩增的特异性例：为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们在常规PCR技术的基础上进行了改良，发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，首先利用第一对引物（外引物）对目的基因所在DNA进行15-30个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物（内引物或巢式引物）进行15-30个循环扩增，具体过程如图所示。下列叙述错误的是（

）A．巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，但扩增产物比常规PCR特异性更强B．两套引物需进行两次PCR，由于和两套引物都互补的靶序列较少，因此大大提高了扩增的特异性C．内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定D．如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会增加D7.不对称PCR：制作DNA探针例：不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（

）A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计B．据图可知，最后大量获得的ssDNA、与图中甲链的碱基序列相同C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5'端、非限制性引物的3'端延伸D．因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离C六.不同的PCR类型重叠延伸PCR：四种引物--定点突变逆转录PCR：提高RNA检测的灵敏度，广泛用于遗传病的诊断，可定量检测某种RNA的含量，比如新型冠状病毒的检测实时荧光PCR：一对引物和一个探针早期诊断，灵敏度高和特异性强反向PCR：扩增已知序列两端的未知序列巢式PCR：两对引物--第二次PCR确保了扩增的特异性小范围建构不对称PCR：制作DNA探针大引物PCR：定点突变，三种引物（突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物）---同时扩增载体和目的基因[2023·山东·25]科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。

F1和R2

或F2和R1

a链

七.引物的选择3’5’(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（