（正式版）DB22∕T 1978-2013 《野鲤种质鉴定 微卫星法》

备案号：40168-2014野鲤种质鉴定微卫星法吉林省质量技术监督局发布本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省水利厅提出并归口。本标准起草单位：吉林省水产科学研究院。本标准主要起草人：郑伟、闫春梅、毛瑞鑫、陈伟强、王战蔚、王文兰、杜晓燕、李忠强、李秀颖、常淑芳、李永利。工野鲤种质鉴定微卫星法25.3N,N,N',N′—四甲基乙二胺(TEMED):4℃5.4TaqDNA聚合酶：-20℃保存。5.5分子量标准(Markers):D5.9300g/L丙烯酰胺溶液：20mL水中融解29g丙烯酰胺，1g甲叉双丙烯酰胺，定容至100mL,4℃保存。5.105×Tris硼酸(5×TBE)电泳缓冲液：Tris27g,硼酸13.75g,加蒸馏水400mL溶解后，加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)10mL,补充蒸馏水定容至5.11100g/L过硫酸铵：8mL水中溶解1g过硫酸铵，加水至10mL,4℃保存，现用现配。5.121g/L硝酸银(AgNO₃)染色液：将AgNO₃0.5g溶于超纯水450mL,加ddH₂O定容至500mL,现用现配。5.15提取液：Tris饱和酚+氯仿+异戊醇(25+24+1,体积比)。5.16乙醇溶液：乙醇+水(7+3,体积比)。5.18阳性对照品：30尾野鲤DNA提取物，用TE(pH8.0)溶解至50ng/μL,4℃保存备用。5.19阴性对照品：30尾建鲤DNA提取物，用TE(pH8.0)溶解至50ng/μL,4℃保存备用。5.20微卫星引物：参见附录A。6.1电子天平：精度0.0001g。6.4水浴恒温震荡器：温控范围RT-100℃,控温精度±1℃。6.8凝胶成像分析系统。7取样将活体中直接采集的鳞片或鳍条样品浸泡在乙醇溶液中，-38.1DNA提取取20mg鳍条加入0.6mL裂解液，55℃温育1-2h,并不时轻摇至组织块完全消化，取上清液用提取液抽提3次，加入无水乙醇1ml于-20℃过夜沉淀，离心，弃去上清液，再用0℃预冷的乙醇溶液洗8.2DNA测定8.2.1DNA纯度测定8.2.2DNA浓度测定X——被测样品DNA浓度，单位为微克每L——比色池厚度，单位为厘米(cm);8.3微卫星引物配制取附录A所列17种微卫星引物用水配制成浓度为50pmol溶液，4℃保存备用。8.4PCR扩增8.4.1PCR反应体系4反应体系正向引物(2pmol/μL)反向引物(2pmol/μL)时间1230个循环348.5PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶检测5确保玻璃板无水印。再将两片玻璃板(其中胶液凝固。15μLTEMED,用搅棒混匀溶液(不得有气泡),将制好的胶板斜放45度角，然后用玻棒引流缓缓灌用或保存于室温达24h。缓慢移去胶板底端的塑料封口槽，将胶板带凹口面向内装到电泳槽上，用弹簧夹夹紧胶模。用1×加完后，在预留的样品槽点入DL2000markers,将电源连接，120V恒压电泳。当指示剂跑到胶板底部时，结束电泳，将电源电压调至为“O”,再关闭电源开关。取下凝胶板，小心去掉胶板两侧的隔板后在蒸馏水中轻轻撬开两片玻璃板取下凝胶，用蒸馏水洗胶30s,再将凝胶置于1g/L硝酸银染色液中染色10min,倒去染色液，用蒸馏水洗胶1min后将凝胶置于显色液中显色15s,型(如AA,AB,AC或BB等),建立各个群体的等位基因型数据阵列。利用群体遗传学分析软件专业(PopGene3.2版本),按照共显性二倍体数据模型，进行遗传距离的分析和计算，并用UPGMA做基于Nei's69鉴定结果评价对形态学上初步判定为野鲤的样本，根据软件分析结果所得的遗传距离树形图，获得样本与阴性对照组和阳性对照组的遗传距离判断样本的亲缘关系。与阴性对照Nei's遗传距离≥0.12,同时与阳性对照的Nei'