基因HSV-TK过表达稳转肝癌细胞株构建

绪论肝癌作为全球发病率和死亡率均居前列的恶性肿瘤ADDINCNKISM.Ref.{7E837050DAC346b7908E3373CA948102}[1]，其中肝细胞癌（HCC）作为肝癌的一种重要类型，占原发性肝癌的90%并且致死率非常高ADDINCNKISM.Ref.{1F31332AA0954ce6B954BC9320295625}[2]。1990-2015年间，欧洲肝癌发病率增幅高达75%ADDINCNKISM.Ref.{66AB45BFF28243aaAB93D19B379D49F5}[1,3]，中国患者年龄标准化5年生存率仅为12.1%ADDINCNKISM.Ref.{01F611BC6BC944619E852E88EA0B0DBA}[4]，肝癌发病率的提高和生存率的低下都体现出推动肝癌治疗的严峻性。肝细胞癌的发生与多种因素相关，其中慢性肝损伤引发的肝脏纤维化能够体大提高肝癌的发生率。并且黄曲霉毒素暴露也被确认为独立危险因素ADDINCNKISM.Ref.{B03FADD4BA5644d4AA6D73DE69429AA6}[5]。乙型/丙型肝炎病毒感染也与肝癌发生密切相关ADDINCNKISM.Ref.{41C4383260C24971A4C44A69B00CE623}[6-9]，长期酗酒及代谢异常（含糖尿病）也被证实为明确风险因子ADDINCNKISM.Ref.{B593263CD6AA4d4a8220BDE846242437}[10-12]。手术、放化疗及靶向药是针对肝癌患者的主要疗法，但常因肝癌病情发展极具隐匿性，以及缺乏早期HCC的典型表现，患者容易错过了最佳治疗时机，大多数患者在诊断时已经进展到中晚期ADDINCNKISM.Ref.{11861003BCFD44b7B9A4DF44AFBB505E}[13]，只有30-40%的患者有可能接受传统的手术治疗。并且即使这些早期或者中期肝癌患者能够通过手术治疗，术后仍有很大的可能性复发ADDINCNKISM.Ref.{1E8CC3989C73419aB018D8ED026AE5AB}[14]，术后5年的生存率仅为40-50%ADDINCNKISM.Ref.{240CDD5308484c40ACDD6A4B65B15D49}[15]。手术治疗虽能显著延长患者的生存期，但其疗效还高度依赖术后辅助化疗的协同作用ADDINCNKISM.Ref.{25C2D2FD9B0F4dd597DB113ABA6540CF}[16]。目前，手术、化疗以及靶向治疗是治疗肝细胞癌的主要方法ADDINCNKISM.Ref.{7D7D7618A0174aa99BB8F0041407CE48}[17]。传统治疗模式存在显著局限性，化学药物治疗常引发剂量限制性毒性反应，以顺铂为代表的化疗方案虽然具有显著抗肿瘤效果，但约75%患者因严重恶心呕吐等消化道反应被迫减量或中断治疗ADDINCNKISM.Ref.{3B6328F675224b4a8F9F80DE6CAC2853}[16]；放射治疗则因骨髓抑制等并发症需反复暂停治疗，不仅延长住院周期加重经济负担ADDINCNKISM.Ref.{DA55E89271644f2dB2FCA14A63CA3A69}[18-19]，更可能造成肿瘤细胞获得射抵抗。当前化疗药物普遍采用静脉或口服全身给药方式，这种非靶向性递送系统导致药物在正常组织蓄积，既限制剂量强度又引发广泛毒副作用，而治疗获益仅体现为生存期数月的延长ADDINCNKISM.Ref.{E9EF2965311745fd85C9C0CDA0EB1711}[20]，晚期肝细胞癌一线治疗中索拉非尼与仑伐替尼虽能提升中位生存期约3个月，但会因为缺乏肿瘤靶向性而引发全身毒性反应，且多数患者3-6个月内就会产生耐药性，迫使后续治疗需要使用瑞戈非尼、帕博利珠单抗等二线方案ADDINCNKISM.Ref.{2E17037AAC5B4A9EC9C}[21]。放疗和化疗治疗手段是“低效高毒”，并且在治疗过程中病人需要遭受巨大的痛苦，这些困境也推动了基因治疗等精准靶向策略成为突破临床瓶颈的新方向。基因治疗是精准医学的重要实现形式，是通过病毒载体或物理化学递送系统将外源性功能核酸导入靶细胞，来纠正遗传缺陷或调控异常基因表达，从而治疗或者治愈疾病。在肿瘤治疗领域，基因治疗的策略主要包含三大作用机制。第一种就是通过递送p53等肿瘤抑制基因，补偿肿瘤抑制基因致癌突变。第二种运用siRNA通过RNA干扰机制沉默致癌基因。第三种就是导入HSV-TK等自杀基因系统，使癌细胞表达前药转化酶，再加入药物，进而触发凋亡级联反应。目前有多种体内基因治疗方案处于临床试验阶段，但美国FDA批准癌症基因疗法基本都是局限于体外修饰策略。2017年获批的Tisagenlecleucel（Kymriah®）率先将CAR-T细胞疗法应用于25岁以下复发难治性急性淋巴细胞白血病及成人弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）治疗，随后获批的Axicabtageneciloleucel（Yescarta®）进一步扩展适应症至原发性纵隔大B细胞淋巴瘤等DLBCL亚型ADDINCNKISM.Ref.{2B12BAA81AEC451491B39F98E5733126}[22]。这些药物的进展都标志着基因治疗正式进入肿瘤临床实践，但基因治疗过程中体外细胞制备的复杂工艺和潜在的细胞因子释放综合征风险仍等待进一步探索和优化。目前，为解决肿瘤这一大难题，已经探索了许多基因治疗的方案。其中就包括单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）自杀基因疗法，并且这已经成为治疗癌症的一种潜在新方法。HSV-TK基因编码的胸苷激酶可将无毒前药GCV转化为毒性代谢产物GCV-TP。GCV-TP通过竞争性抑制DNA聚合酶，取代鸟嘌呤-5’-三磷酸（dGTP）掺入DNA链，阻断DNA聚合酶活性，导致DNA链无法延伸，这一过程引发DNA单链或双链断裂最终引发肿瘤细胞死亡ADDINCNKISM.Ref.{DCEBCA6070054cb9A61DD5ABC744D435}[23]。实验显示，GCV处理后的HepG2细胞中γ-H2AX（DNA损伤标志物）表达量增加5倍，激活ATM/ATR通路并引发G2/M期阻滞ADDINCNKISM.Ref.{8209257971574acaB0673DF1C0BCC11C}[24-25]。同时，GCV-TP诱导线粒体膜电位下降，促进细胞色素C释放，激活Caspase-9/3级联反应。Bel-2家族蛋白（如Bax/Bcl-2比例失衡）也在此过程中起重要的调控作用ADDINCNKISM.Ref.{05E10537A2064b4682BBDE233FB39AF2}[26]。并且研究表明，GCV对HSV-TK阳性细胞的杀伤作用具有浓度和时间依赖性，在体外实验中可显著抑制肝癌细胞增殖ADDINCNKISM.Ref.{CE5858FC585C49f1B3F93837F42BF511}[27-28]。HSV-TK/GCV疗法呈现显著旁观者效应，转染TK基因的肿瘤细胞可诱导邻近未转染细胞死亡，表明了HSV-TK/GCV自杀基因治疗作用具有空间扩散特性。机制研究显示，TK阳性细胞生成的GCV三磷酸盐通过缝隙连接转移至邻近细胞，同时局部炎症反应与血管退化引发的通透性改变加速毒性代谢物扩散ADDINCNKISM.Ref.{47972D534DDF443984A5492AF76FC49B}[29]，共同强化旁观者效应。远端抗肿瘤效应早期被归因于免疫激活，而SCID小鼠模型中转移瘤的持续消退提示了VEGI等可溶性因子介导远程调控机制ADDINCNKISM.Ref.{E01220A81592412dB5AD8268C557D4FA}[30]。缝隙连接介导的毒性代谢物传递是依靠细胞间的连接蛋白（如Connexin43）来交换GCV-TP，从而扩大杀伤范围ADDINCNKISM.Ref.{0AC753D791514d0cAC910BEADDA14353}[23]。免疫激活是通过凋亡细胞释放炎性因子（如IL-12），招募免疫细胞从而增强抗肿瘤反应ADDINCNKISM.Ref.{1AD196B356914f79AD2E776D7A2A2EF4}[23,31]。局部炎症反应和去血管化则是肿瘤微环境中的内皮细胞损伤导致缺血性坏死ADDINCNKISM.Ref.{9AD14C93EAE14435BCF5D9829AA51F7C}[23]。并且有实验表明，丹参酮ⅡA等药物可通过增强缝隙连接提升旁观者效应，使杀伤效率出现明显的提高ADDINCNKISM.Ref.{C8FE3F3040A74a559E04C99CB8263635}[23]。相较于HSV-TK/GCV系统，另一研究广泛的自杀基因系统CD/5-FC则展现出更显著的旁观者效应，两者作用机制具有本质性差异。CD/5-FC系统的旁观效应不依赖细胞间直接接触，5-氟胞嘧啶（5-FC）在胞嘧啶脱氨酶（CD）作用下转化为5-氟尿嘧啶（5-FU），5-FU作为小分子代谢物可通过浓度梯度自由扩散至邻近肿瘤细胞，无需缝隙连接或凋亡小体介导ADDINCNKISM.Ref.{FA66A00490BD473eAE6DE28FC36D3647}[32]。CD/5-FC系统通过激活自然杀伤细胞（NK细胞）及CD4+/CD8+T细胞介导全身性抗肿瘤免疫ADDINCNKISM.Ref.{D3C8960E53F84eb185C51AFD939D3C21}[32]。而HSV-TK/GCV更侧重于局部微环境调控，HSV-TK/GCV系统因其可控的局部杀伤特性，可与肝移植（LT）联用，在清除术后微小残留病灶方面有显著优势。经门静脉灌注Ad-TK/GCV可提高移植肝中隐匿性肝癌细胞清除率ADDINCNKISM.Ref.{D69276A1FD5042de94276CC656369F89}[29]。当前“基因组时代”的快速发展揭示了人群癌症易感性的遗传异质性，通过全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出多种的关键突变ADDINCNKISM.Ref.{C710EB61595E4a718EB05B30817AD6EA}[33]。基于每个个体的分子特征，精准医学策略推动了靶向药物（如PARP抑制剂、EGFR-TKI）的研发，并且药物遗传学能够通过解析特定基因型（如CYP2D6多态性）与药效关联性，最终实现个体化用药指导ADDINCNKISM.Ref.{F3693587D0B94d03BFA31013188BAAB9}[34-36]。然而，现有疗法具有明显的局限性。比如，遗传易感性人群仅占癌症患者的有限比例，且致癌进化机制（如克隆选择、表观遗传重塑）可诱导耐药性，削弱对化疗及放疗敏感性ADDINCNKISM.Ref.{6EDCA7440C704af7A50EE66237742037}[37]。传统细胞毒药物（如铂类、蒽环类）虽具有广谱抗肿瘤活性，但对其他快速增殖的正常健康组织（如骨髓、消化道黏膜）会产生不可逆损伤严重。为解决目前的众多问题，新型靶向策略聚焦于癌细胞特异性干预，包括基因沉默（RNAi/miRNA）、细胞内抗体（如抗HER2scFv）、关键通路阻断（如PI3K抑制剂）及凋亡诱导（Caspase/DNase过表达）等方向。其中，自杀基因治疗凭借其“分子开关”特性成为研究热点，通过向癌细胞定向导入毒性基因（如CD/5-FC、HSV-TK/GCV系统），在局部药物激活下触发选择性凋亡，从而实现“精准清除”与“微环境调控”的双重优势，为克服肿瘤异质性及治疗毒性提供了创新解决方案ADDINCNKISM.Ref.{7D34A17C82EC48a1AAF208AAEDA47BA9}[38-40]。自杀基因治疗作为肿瘤基因治疗领域的突破性策略，通过将特定酶基因（如HSV-TK、CD）定向导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞具备将无毒前药（GCV、5-FC）转化为细胞毒性代谢产物的能力，从而实现对肿瘤的精准杀伤ADDINCNKISM.Ref.{1AD57DD0C55A452882DA8654840E570E}[38-40]。这种治疗方案的优势在于双重特异性,利用基因递送系统的靶向性（如病毒载体、纳米颗粒）来限制毒性基因在肿瘤微环境表达,促使药物只能够在转化部位才能被激活，避免了全身毒性。这种治疗方案已在肝癌、肺癌及胶质瘤等实体瘤中展现显著的疗效。在肝癌模型中，HSV-TK/GCV系统通过抑制DNA聚合酶活性诱导肿瘤细胞凋亡，使原位瘤体积明显缩小ADDINCNKISM.Ref.{60653D099D114b58A2180132400F30A4}[41-43]。针对化疗耐药的非小细胞肺癌，CD/5-FC系统通过5-FU干扰RNA合成，使耐药细胞系凋亡率大幅提升。此外，自杀基因治疗与放疗具有协同效应，其诱导的微环境调控（如血管正常化）可将放疗敏感度提高3倍，并有效抑制微转移灶的生长ADDINCNKISM.Ref.{16B7A2492FD34e3485014F4089FD247B}[44-45]。这一特点也为基因治疗和放疗联合治疗癌症提供了可能性。在肝细胞癌（HCC）治疗中，HSV-TK/GCV系统因可操作性高成为研究焦点。除了上述的优势以外，HSV-TK/GCV系统也存在着许多问题。临床前研究表明，经肝动脉注射Ad-TK/GCV可使大鼠HCC模型肿瘤负荷降低，但部分病例出现GCV诱导的肝炎，源于腺病毒对正常肝细胞的非特异性转导ADDINCNKISM.Ref.{5FFBFB67CFD943d18CE133A548C89A77}[46-47]。所以对于基因靶向运输载体的选择也是至关重要。为此，研究者也开发了多种靶向优化策略。比如，采用AFP启动子驱动TK基因表达，使肝癌细胞中转基因表达量较正常肝细胞高10倍ADDINCNKISM.Ref.{3473EC472D9549668AB18EA563F18804}[48-50]，以及探索慢病毒载体，其在静止期HCC细胞中的转染效率较逆转录病毒提升5倍，但需通过细胞周期同步化技术增强体内转导ADDINCNKISM.Ref.{60FDB4ABDC86451fAE07A2725E10E2DD}[51-52]。然而，现有载体仍面临免疫原性（腺病毒中和抗体发生率＞60%）及转染效率瓶颈（瘤内基因表达率＜40%），制约临床转化ADDINCNKISM.Ref.{609EBAFB9072415896E35D14094A68F4}[53-54]。肝癌自杀基因治疗研究需持续深化机制探索与技术革新。靶向特异性增强策略涉及抗体修饰脂质体载体开发与CRISPR激活系统（SAM-TK）应用，后者通过维持TK基因持续表达显著延长荷瘤小鼠生存周期。多模态治疗平台构建如TK/PD-L1siRNA共递送系统，实现肿瘤细胞凋亡诱导与免疫抑制微环境协同调控。当前需突破载体安全性瓶颈（基因组整合风险低于0.01%）及耐药逃逸难题（EpCAM+肿瘤干细胞清除效率不足50%），而肿瘤特异性启动子、智能响应型纳米载体与免疫联合疗法的协同发展将推动该技术成为肝细胞癌个体化治疗体系的核心组成。实验材料与方法2.1实验材料、试剂、耗材及仪器设备2.1.1实验材料1.piggy-bac质粒、HSV-TK质粒2.人肝癌细胞系SMMC-77212.1.2实验试剂PBS磷酸盐缓冲溶液PBS磷酸盐缓冲溶液可用于细胞的洗涤，使细胞保持良好的状态。①用电子天平称取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4。②溶于800mL蒸馏水中。③用HCl调节溶液pH至7.4。④加蒸馏水定容至1L，即配好0.01MPBS缓冲液。⑤121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。注：如果有PBS粉剂，则直接加如ddH2O，定容至1000ml，调节pH至7.4，再灭菌即可。细胞生长培养液临用前根据需要在基本培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数，加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100μg/mL，置于4℃冰箱保存。Polybrene助转染试剂用0.9％NaCl溶液配制成1mg/mL的储存液：①0.45gNaCl+50mL（0.9％Nacl溶液）；②Polybrene：0.05g；①②混合溶解，高温灭菌，4度保存。抗生素青霉素100U/mL链霉素100μg/mL抗生素直接购买，可以直接加入到培养基中，防止细胞被污染。培养基(1)基本培养基：直接购买(2)完全培养基：在基本培养基中添加小牛血清、抗生素等物质后，即为完全培养基。基本培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需添加天然培养基，常用的是牛血清，因为牛血清中含有促细胞增殖的各种生长因子和其他多种有利于细胞生存的物质。此外，为防止污染，培养液种还需加一定量的抗生素。其他1xTAEbuffer(pH8.5)、DL10000DNAMarker、6xLoadingBuffer、EB、无菌水；70%乙醇；脂质体（Lipofectamine3000、P3000）；核心质粒等。2.1.3实验耗材Eppendorf公司微量移液器(1mL,100μL,10μL)及对应的枪头；培养皿；锥形瓶；量筒；容量瓶；无菌涂棒；EP管；T25培养瓶；6孔板；24孔板；96孔板；离心管；针筒；针式滤器；冻存管等。2.1.4实验仪器设备表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s11实验所用设备及生产商设备名称生产厂商超净工作台SW-CJ-IF苏州安泰空气技术有限公司BS224S型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司超低温冰箱ThermoElectronCoporationAshevilleNCUSAMIS-3020型全自动高压灭菌锅SANYOElectricCo.Ltd.CO2培养箱美国赛莫公司PCR仪2720美国AppliedBiosystems公司恒温摇床美国赛莫公司小型离心机MICRO17美国赛莫公司电热恒温培养箱DNP-9082上海三发科学仪器有限公司精密电子天秤JA2003N上海精科公司冷冻离心机凯达科学仪器有限公司荧光倒置显微镜上海光学仪器细胞房南通大学2.2实验方法2.2.1细胞培养肝癌细胞SMMC-7721，培养基采用的是DMEM/F12，采购于。并加入10%的小牛血清，以及抗生素。2.2.2细胞传代当细胞生长达到培养面积的80%-90%，需要进行传代。首先吸走所有培养液，加入PBS进行洗涤2-3次，后加入胰酶消化液，等待5-10分钟，在显微镜下观察，大部分细胞变成圆形时，加入完全培养基终止消化，用移液枪进行吹打，帮助细胞从培养瓶上脱落，将悬液转移到离心管中，以1000r/min，进行5分钟的离心，弃去上清，加入细胞培养液，用移液枪进行吹打混匀，按照一皿传三皿的比例进行传代，传代结束后，在37℃培养箱进行培养，其中的适度为80%，CO2的浓度是5%。2.2.3细胞冻存当短时间内，用不到细胞时，可进行冻存。首先吸走培养液，用PBS进行洗涤，加入胰酶消化液，消化后转移至离心管中，以1000r/min，进行5分钟的离心，去上清，加入冻存液，混匀后转移至冻存管，标注好细胞名称、日期，放入-80℃超低温冰箱，一夜后，可将冻存管转移至液氮罐中。2.2.4细胞复苏提前将水浴锅的温度设为37℃，将冻存管放入，使液体融化。再将液体转移到离心管中，再加入适当细胞培养液，进行离心，去上清，加入细胞培养液，用移液枪吹打混匀，转移至培养容器中。2.2.5质粒的酶切和连接取一个EP管，依次加入1μg质粒DNA（含piggy-bac和HSV-TK），5μL购买的QuickCutBufffer，1μLQuickCut限制酶，然后将体系加至50μL。加入限制酶后，应立即将酶放回-20℃冰箱。将EP管放入37℃的水浴锅，1小时后酶切结束。将酶切产物与未经酶切的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，对酶切过程进行检验。称取0.45g的琼脂糖到锥形瓶中，加热至沸腾，待冷却至不烫手时，将其倒入到模具中，等待30分钟，让凝胶凝固。其凝固后，放入电泳槽中，并加入TAE，使液体淹没凝胶，在凝胶的泳道中加入酶切产物，进行电泳。电泳后切取进行EB染色，在凝胶成像仪中观察结果，根据marker可以判断酶切成功。通过核酸位置判断剩余凝胶中目的片段的位置，通过胶回收获得piggy-bac和HSV-TK片段。酶切成功后，需要进行连接。在EP管中依次加入1μL购买的T4DNALigasebuffer、14μLHSV-TK片段、4μLpiggy-bac片段。连接酶使用完后，也应立即放回冰箱。将EP管中的液体放入22℃的水浴锅，进行水浴2小时。连接反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测连接结果。成功后即获得piggy-bac-HSV-TK质粒。2.2.6细胞的准备取出前先在37℃、5%CO2培养箱内培养的肝癌细胞株SMMC-7721，在超净工作台将细胞进行PBS清洗3-5次后，准备进行脂质体转染。（细胞培养到70-80%左右开始转染,此时细胞状态一定要良好，这点很重要，并且无污染。）2.2.7细胞转染细胞置于T25培养瓶中培养，待细胞状态调整好之后传到6孔板（或12孔板），细胞密度不要太大，摇匀培养。待6孔板中的细胞贴壁，恢复活力，细胞铺展开来，但各个细胞之间还没有接触，有很大生长空间时，即可进行感染。感染前，在EP管中取3μg的质粒（参考：六孔板每孔的细胞数量对应3μg），在PCR仪上98℃放置5分钟，进行灭菌，后进入细胞房进行转染。转染时，取1.5ml灭菌新EP管，加入所有之前EP管中的所有质粒、250μL基本培养基、6μL购买的P3000试剂，用移液枪吹打混匀，再取一个1.5ml灭菌新EP管，加入7μL购买的Lipofectamine3000试剂和250μL基本培养基。再将两个EP管中的液体混合到一起，并且吹打混匀，静置20分钟。将6孔板中的培养基弃去，用PBS洗细胞3～5次，加入500μL的基本培养基，再将步骤3灭菌EP管中混匀的溶液加入孔中。加完后，将六孔板进行平推摇晃（不能用力太大，将培养基洒出）。将24孔板放入CO2培养箱。等待piggy-bac-HSV-TK质粒转染细胞，培养6～8h，更换培养液，加入适量的完全培养基，并且观察荧光。若无荧光或荧光强度弱，根据营养消耗情况补加适量完全培养基，继续培养24h后再次观察荧光。2.2.8细胞筛选被piggy-bac-HSV-TK质粒成功转染的SMMC-7721细胞在荧光显微镜下，可以观察到绿色荧光。在培养液中加入嘌呤霉素，筛选出含有HSV-TK基因的细胞。2.2.9加药检测首先复苏未经转染的SMMC-7721细胞，在6孔板中进行培养，等待其密度到达60%，同时调整转染成功的SMMC-7721细胞密度，使其也接近60%，加入更昔洛韦，等待48小时，观察细胞的状态。2.2.10细胞活力测试当SMMC-7721-HSV-TK稳转细胞株和SMMC-7721细胞加入更昔洛韦处理48小时后，收集细胞，传代到96孔板，加入购买的MTT，放入培养箱，4小时后，将培养液全部转移到离心管中，进行离心，除去3/4的上清，加入二甲亚砜，等待10分钟，使结晶充分溶解，在酶标仪下进行测量，测量570nm处吸光度值。结果绿色荧光蛋白示踪的HSV-TK/GCV系统重组质粒转染细胞后，于荧光倒置显微镜下观察到，细胞能被激发出绿色荧光，说明转染成功。GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强。通过嘌呤霉素筛选，获得稳转细胞株后加药，确定HSV-TK/GCV系统对于肝癌细胞的杀伤作用。目前，稳转株荧光检测筛选结果如下：图STYLEREF1\s3.SEQ图\*ARABIC\s11SMMC-7721-HSV-TK细胞荧光观测图（左：暗场，右：明场）图STYLEREF1\s3.SEQ图\*ARABIC\s12SMMC-7721-HSV-TK细胞加入GCV后48小时的观测图（左：处理，右：对照）图STYLEREF1\s3.SEQ图\*ARABIC\s13SMMC-7721-HSV-TK稳转细胞株和SMMC-7721细胞株分别加入GCV后48h的细胞活力检测根据图1，我们根据标记的荧光，发现稳转的细胞株筛选获得成功，并且显示出较多的荧光。根据图2，可以明显看出SMMC-7721-HSV-TK稳转细胞株在加入GCV后，转染了HSV-TK后的细胞数量减少，并且细胞状态下降，细胞逐渐从孔板底部脱落。根据图3，我们对GCV处理的SMMC-7721-HSV-TK稳转细胞株和SMMC-7721细胞株加入GCV后48h的细胞活力对比，SMMC-7721-HSV-TK稳转细胞株相比于SMMC-7721细胞株，活力明显下降。讨论基因治疗的核心是通过病毒或非病毒载体将治疗性核酸递送至靶细胞，以纠正遗传缺陷或赋予细胞新的生物学功能，从而能够解决疾病。在肿瘤治疗领域，自杀基因疗法通过病毒载体或非病毒载体将特定的酶基因（如HSV-TK）导入肿瘤细胞，使细胞具备将无毒药物转化为细胞毒性产物的能力，从而实现对肿瘤细胞的精准杀伤。以本实验研究的HSV-TK/GCV系统为例：HSV-TK基因编码的胸苷激酶能够将更昔洛韦（GCV）磷酸化为GCV单磷酸盐（GCV-MP），随后GCV-MP经过细胞内激酶进一步转化为GCV三磷酸盐（GCV-TP）。GCV-TP能够竞争性抑制DNA聚合酶活性，同时掺入到新生DNA链中，导致DNA复制终止及细胞凋亡级联反应,使细胞死亡，从而达到消灭肿瘤细胞的目的。尽管HSV-TK/GCV系统已在胶质瘤、肺癌等实体瘤中取得显著疗效，但其在肝细胞癌（HCC）中的应用仍面临多重挑战。比如，基因递送载体可能非特异性感染正常肝细胞，导致GCV代谢产物引发肝毒性。并且如果长期治疗可能诱导肿瘤细胞耐药性克隆扩增。因此，利用自杀基因治疗肝细胞癌还需要进一步提升疗效与安全性。本实验是利用质粒上的转座子将目的基因转移到细胞中，相较于病毒载体，这种方式更加简单方便，能够为我们推进实验过程节约大量时间，操作也更加简单。为实时监测基因转导效率，将水母（Aequoreavictoria）来源的绿色荧光蛋白（GFP）基因与自杀基因（如HSV-TK）共表达。GFP在激发光（488nm）下发射特征性绿色荧光（509nm），可通过荧光显微镜分析转导效率，有利于推进后续的实验。在实验操作中，需严格将细胞密度控制在60%-70%以优化感染效率。因为，过高的细胞密度（>90%）会导致细胞间接触抑制，使转导效率下降。而且细胞经过转染操作，一般也仅有30%-40%成功率，如果细胞密度过低，那么能够成功转染的细胞数量也会相应减少。本研究成功构建了SMMC-7721-HSV-TK稳转细胞株，但转染后在荧光显微镜下观察到GFP阳性细胞比例仅为35%-40%。为获得高纯度稳转细胞系，利用质粒上的嘌呤霉素的抗性基因进行筛选。直接在细胞的培养液中加入适量比例的嘌呤霉素，没有成功转染的细胞中不含有抗嘌呤霉素的基因。培养24小时后，不含有嘌呤霉素抗性基因的细胞会大量死亡。同时，在荧光显微镜下观察，存活的细胞是否都能发出绿色荧光，可以根据细胞的具体情况调整处理细胞的嘌呤霉素含量和时间。获得高浓度的稳转细胞株后，复苏未转染的细胞株，并调整两个细胞株的密度。当密度约为60%时，可添加GCV，培养两天后，可以在显微镜下观察到，稳转细胞株相对于未转染的细胞株，发生明显的死亡。则说明HSV-TK/GCV系统对于肝癌细胞株SMMC-7721具有明显的杀伤作用。本实验仅能证明HSV-TK/GCV系统能够作用于肝癌细胞，在个体层面的作用还需进一步的实验证明。但基因治疗逐渐从“实验性疗法”向“主流治疗手段”转型，其发展前景取决于技术创新、临床适应症拓展及政策-产业生态的协同。未来，随着递送系统精准化、联合策略多元化及成本控制优化，基因治疗有望成为实体瘤综合治疗的核心模块，为患者提供根治性解决方案。ADDINCNKISM.LBib参考文献[1]SaranyaChidambaranathan-Reghupaty,PaulB.Fisher,DevanandSarkar.Hepatocellularcarcinoma(HCC):Epidemiology,etiologyandmolecularclassification[M]:Elsevier,2021:1-61.[2]JingliDing,ZhiliWen.Survivalimprovementandprognosisforhepatocellularcarcinoma:analysisoftheSEERdatabase[J].SpringerScienceandBusinessMediaLlc,2021,21(1).[3]PeterR.Galle,AlejandroForner,JosepM.Llovet,etal.EASLClinicalPracticeGuidelines:Managementofhepatocellularcarcinoma[J].JournalofHepatology,2018,69(1):182-236.[4]HongmeiZeng,WanqingChen,JieHe.ChangingcancersurvivalinChinaduring2003–15:apooledanalysisof17population-basedcancerregistries[J].TheLancetGlobalHealth,2018,6(6):e555-?.[5]AmandaK.McCullough,R.StephenLloyd.Mechanismsunderlyingaflatoxin-associatedmutagenesis–Implicationsincarcinogenesis[J].ElsevierBv,2019,77:76-86.[6]YuJiang,QiujuHan,HuajunZhao,etal.TheMechanismsofHBV-InducedHepatocellularCarcinoma[J].InformaUkLimited,2021,Volume8:435-450.[7]GiacomoEmanueleMariaRizzo,GiuseppeCabibbo,AntonioCraxì.HepatitisBVirus-AssociatedHepatocellularCarcinoma[J].MdpiAg,2022,14(5):986.[8]MousumiKhatun,RanjitRay,RatnaB.Ray.HepatitisCvirusassociatedhepatocellularcarcinoma[M]:Elsevier,2021:103-142.[9]RobertaD’Ambrosio,PietroLampertico.IsittimetorefineHCCsurveillancestrategiesinHCVcuredpatients?[J].OvidTechnologies(woltersKluwerHealth),2022,76(1):9-11.[10]BubuA.Banini,ArunJ.Sanyal.NAFLD-relatedHCC[M]:Elsevier,2021:143-169.[11]K.K.Tsilidis,J.C.Kasimis,D.S.Lopez,etal.Type2diabetesandcancer:umbrellareviewofmeta-analysesofobservationalstudies[J].Bmj,2015,350(jan021):g7607-g7607.[12]AleksandrovaKrasimira,Stelmach-mardasMarta,SchlesingerSabrina.ObesityandLiverCancer[M].Cham:SpringerInternationalPublishing,2016:177-198.[13]郑荣寿,张思维,孙可欣,等.2016年中国恶性肿瘤流行情况分析[Z],2023.[14]ZhenxiaoWang,HanjiaoQin,ShuiLiu,etal.PrecisiondiagnosisofHepatocellularCarcinoma[J].OvidTechnologies(woltersKluwerHealth),2023.[15]JianZheng,DeborahKuk,MithatGönen,etal.Actual10-YearSurvivorsAfterResectionofHepatocellularCarcinoma[J].SpringerScienceandBusinessMediaLlc,2017,24(5):1358-1366.[16]G.Curigliano,D.Cardinale,T.Suter,etal.Cardiovasculartoxicityinducedbychemotherapy,targetedagentsandradiotherapy:ESMOClinicalPracticeGuidelines[J].ElsevierBv,2012,23:vii155-vii166.[17]YangGe,WeiMu,QianBa,etal.Hepatocellularcarcinoma-derivedexosomesinorganotropicmetastasis,recurrenceandearlydiagnosisapplication[J].ElsevierBv,2020,477:41-48.[18]HiroyoKuwabara,KiyohideFushimi.Theimpactofanewpaymentsystemwithcase-mixmeasurementonhospitalpracticesforbreastcancerpatientsinJapan[J].ElsevierBv,2009,92(1):65-72.[19]MinKyeongLee,ThomasB.Dodson,RomeshP.Nalliah,etal.Nine-yeartrendanalysisofhospitalizationsattributedtooralandoropharyngealcancersintheUnitedStates[J].ElsevierBv,2014,118(1):47-67.[20]LorenzaRimassa,ArmandoSantoro.Sorafenibtherapyinadvancedhepatocellularcarcinoma:theSHARPtrial[J].InformaUkLimited,2009,9(6):739-745.[21]SaranyaChidambaranathanReghupaty,DevanandSarkar.CurrentStatusofGeneTherapyinHepatocellularCarcinoma[J].MdpiAg,2019,11(9):1265.[22]AxicabtageneCiloleucelinLargeB-CellLymphoma[J].MassachusettsMedicalSociety,2023,389(12):1152-1153.[23]田海飞,曾燕.肝癌HSV-TK/GCV自杀基因治疗的研究进展[J].重庆医学,2016,(12):1697-1700.[24]MajaTTomicic,RudolfThust,BerndKaina.Ganciclovir-inducedapoptosisinHSV-1thymidinekinaseexpressingcells:criticalroleofDNAbreaks,Bcl-2declineandcaspase-9activation[J].SpringerScienceandBusinessMediaLlc,2002,21(14):2141-2153.[25]Christi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