【生物发酵法生产丁醇研究进展概述3000字】

生物发酵法生产丁醇研究进展概述目录TOC\o"1-3"\h\u17634生物发酵法生产丁醇研究进展概述 1134721.1丁醇发酵菌株 1292651.2丁醇发酵的代谢途径及机制 142731.3发酵法生产丁醇面临的问题 3丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵和异丙醇-丁醇-乙醇（IBE）发酵是通过梭菌属微生物利用生物质工业生产丁醇的经典技术[69]。在典型的ABE发酵和IBE发酵中，丙酮-丁醇-乙醇或异丙醇-丁醇-乙醇的比例均为3:6:1[70-72]。1.1丁醇发酵菌株目前，用于工业ABE发酵或IBE发酵生产丁醇的菌株主要是梭状芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌是革兰氏阳性厌氧菌，这一类菌株主要包括丙酮丁醇梭菌（C.aceto-butylicum）、糖丁酸梭菌（C.saccharobutylicum）、拜氏梭菌（C.beijerinckii）和糖乙酸多丁醇梭菌（C.saccharoperbutylacetonicum）[60]。其中，丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌菌株适合发酵淀粉类物质，例如玉米和马铃薯，而糖丁酸梭菌和糖乙酸多丁醇梭菌优选利用糖蜜作为ABE生产的底物。随着生物丁醇领域的循序发展，产丁醇梭菌选择性不断拓宽且具有极为宽泛的底物谱，能够利用各类物料中不同碳源进行丁醇等产物的代谢合成，其中葡萄糖为绝大多数产丁醇梭菌的最适碳源[61]。目前丙酮丁醇梭菌是研究最为广泛且深入的菌株，部分野生菌已经完成基因组测序，如C.aceto-butylicumATCC824和C.aceto-butylicumDSM1731等[62]。除了自然界中发现的野生菌之外，科研人员还致力于对菌种进行基因工程改造，但是由于工程菌的传代稳定性较差，因此并未实现工业化应用。1.2丁醇发酵的代谢途径及机制由于发酵菌种、原料及发酵条件的差异，丁醇发酵产量也有所差别，但梭菌属微生物主要产生溶剂的代谢途径是非常特定的，分为两个不同的阶段：产酸阶段（其中生成几种有机酸）和产溶剂阶段（其中生成溶剂并伴随着对合成有机酸的再利用）。在产酸阶段，细胞正处于对数生长期，此时梭菌主要产生丁酸和乙酸等，酸的积累会导致培养基pH下降。随着细胞进入静止生长期，其代谢进入第二个时期产醇阶段，此时产酸阶段产生的丁酸和乙酸被回用，发酵液的pH开始回升，丙酮、丁醇和乙醇开始产生，当溶剂达到一定浓度（18-22g/L）菌体生长会受到抑制，开始产生孢子，最后衰老死亡[63]。以ABE发酵的代谢途径为例，如图1-4所示，ABE发酵的酸和溶剂的生产主要取决于三个关键代谢节点：乙酰-CoA、乙酰乙酰-CoA和丁酰-CoA[64]。在产酸代谢阶段，丙酮丁醇梭菌可将葡萄糖和五碳糖转化成丙酮酸。前者是经糖酵解（EMP）途径，后者是经磷酸戊糖（HMP）途径[65]。生成的丙酮酸与CoA在铁氧还原蛋白的作用下，转化为乙酰-CoA，并伴随有CO2与H2的生成。乙酰-CoA可以直接在磷酸乙酰转移酶的作用下，转化为乙酰磷酸酯，进而在乙酸激酶的作用下生成乙酸[66]。同时，乙酰-CoA可经一系列复杂途径，转化为丁酰-CoA。丁酰-CoA在丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶作用下[67]，经去磷酸化，最终生成丁酸。在产溶剂代谢阶段，碳流和电子流开始转向溶剂的合成，CoA转移酶是三种溶剂合成的关键酶之一[64]。它一方面可以催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸，乙酰乙酸在乙酰乙酸脱羧酶的作用下生成丙酮；另一方面能催化乙酸或者丁酸的CoA转移反应，乙酸和丁酸在CoA转移酶的催化下重利用，分别生成乙酰-CoA和丁酰-CoA，乙酰-CoA和丁酰-CoA经过两步还原最终生成乙醇和丁醇[57]。丁醇、丙酮和乙醇是代谢途径主要的终产物[68]，其体积百分比分别约为22-33%，62-74%和1-6%。图1-4ABE发酵生产丁醇的代谢途径Fig.1-4ThemetabolicpathwayofABEfermentationtoproducebutanol而产酸阶段向产溶剂阶段的转变作为丁醇发酵的关键途径，已经有很多研究去探索了哪些因素导致了这种生理转变，主要包括内部因素和外部因素[63]。胞内因素包括胞内水平和丁酰磷酸浓度等。外部因素包括营养因素和温度等。但是，由于代谢网络的复杂性，到目前为止，还没有一个明确的定论。因此，丁醇的代谢机制还有待进一步研究。1.3发酵法生产丁醇面临的问题随着生物发酵法生产丁醇的主要代谢途径的深入研究以及丁醇作为生物燃料所具有的优势，越来越多的发酵工艺、菌种资源及代谢途径的影响因素等相关研究被报道，人们致力于实现丁醇生物发酵法的规模化生产。然而，尽管丁醇发酵的历史悠久，经过长期的研究和探索已经有了较大的发展，但是目前仍然存在以下几个问题[59,63,73-75]：（1）发酵底物价格高。传统的丁醇工业发酵通常以玉米、糖蜜等粮食作物作为原料，随着原料需求量的增加和价格的上涨，生产成本也不可避免的增加。目前，在全球范围内已经投产的丁醇发酵生产工艺中，主要的发酵基质仍然集中在单糖、淀粉等高成本或粮食相关的底物种类之上，采用这类底物进行的发酵生产具有发酵周期短、微生物转化效率高、发酵体系及发酵性能相对稳定等诸多优点，但是高昂的底物成本抬高了生物丁醇发酵生产的成本，使得生物发酵产品在与化学合成产品面前毫无竞争力可言。因此，目前很多研究集中在将自然界中广泛存在的、可再生的生物质纤维素作为一种低成本新型发酵底物引入丁醇的生物发酵法生产中，以期有效地降低发酵生产中的底物成本，提升生物丁醇规模化发酵生产的潜力。然而，目前以生物质纤维素作为发酵底物尚无法提供稳定的发酵性能和较高的微生物转化率。因此，继续探究不同种类的纤维素底物发酵生产性能任重而道远。（2）优良菌种资源少。菌种资源也是限制生物丁醇生产规模化的问题之一。在目前的研究中，虽然通过基因工程改造技术获得了一些具有较高丁醇转化率和丁醇产量的菌株，但现有的基因工程手段中随着途径修饰程度的加深，对宿主菌株的生长活力和发酵能力均会产生一定的影响，过多的外源基因表达会对宿主菌株造成严重的负担，同时相关功能基因的敲除有时会与预期目标产生较大的偏差。因此，通过基因操作的菌株其遗传性可能是不稳定的，而且这些菌株的发酵生产目前仅限于实验室阶段。此外，现有生产菌株在底物利用范围上相对较窄，无法适应低成本的生物质纤维素转化生产丁醇的发酵过程。因此，筛选出具有广泛底物利用能力且能稳定遗传的丁醇生产菌株有利于丁醇发酵生产的规模化与工业化。此外，对于丁醇耐受性方面的考虑也是丁醇发酵菌株的选育的研究热点之一。（3）发酵溶剂产率低。丁醇作为一种有机溶剂，在发酵生产过程中的积累会对微生物菌体细胞造成毒害作用，因此存在严重的产物抑制，导致丁醇的产率偏低。在传统的发酵生产中，天然菌株的丁醇产率约为13g/L，这基本上是其耐受极限[76]。但微生物产丁醇的代谢网络较为复杂，通常改变某些发酵条件就可以影响某些代谢途径的表达，从而影响丁醇的产量。同时，对梭菌属微生物发酵性能的影响因素有很多，包括底物种类、培养温度、底物浓度、摇床转速、初始培养基pH、接种量以及菌种活力等。为了提高微生物发酵速率和增加发酵产品产量，已经有很多科研工作者对这些因素进行控制研究，努力优化发酵工艺条件使发酵生产达到最佳水平。目前，大多数研究者常用的研究方法是改变培养基的配方或是在培养基中添加一些物质，再借助单向方差分析、响应面模型、人工神经网络模拟和遗传算法优化等分析工具和分析模型获得培养基中影响显著的成分及其适宜的添加量，从而达到提升丁醇产量的目的。（4）产品分离回收难。在工业化生产中，55-60g/L底物大约能生产20g/L溶剂，丁醇所占比例偏低约60%，而后续丁醇分离和回收工序难度大，也增加了生产成本。通过传统方法（即直接蒸馏）从发酵液中分离丁醇需要18.4MJ/kg，大约是丁醇燃烧热值的54%[77]。同时，丁醇生产在发酵过程中会带一些水，