沈阳地区鸡马立克氏病毒感染状况的分析

沈阳地区鸡马立克氏病毒感染状况的分析摘要鸡马立克氏病（MD，乃是由马立克氏病毒（MDV）所引发的有高度传染性的鸡淋巴组织增生性疫病，这种疫病对家禽健康构成了严重威胁，会给养禽业带来颇为巨大的经济损失，此次研究将重点放在沈阳地区，来较为全面地了解该地区规模化鸡场中MDV的感染状况以及流行趋势，为疫病防控提供科学依据，同时探索出综合防控方案。MDV归属于疱疹病毒科马立克病毒属，它分为3个血清型，其中血清1型（MDV-1），其致病性较强，是沈阳地区主要流行的血清型，它的基因组是线性双链DNA，里面含有多个独特区以及重复序列，致病基因像meq、pp38和132bp基因等，在病毒致病的过程里发挥着关键作用。在流行病学方面，感染鸡以及病鸡是主要的传染源，依靠空气、羽毛屑、粪便等途径传播，不存在垂直传播的情况，不同品种的鸡对MDV的易感性不一样，母鸡相较于公鸡更容易感染，出雏和育雏室的早期感染会致使高发病率以及病死率。临床症状主要可分为神经型、内脏型、眼型以及皮肤型这几种类型，每一种类型都有着其自身独特的症状表现，而病理变化主要体现为外周神经出现肿大的情况、内脏器官有肿瘤形成等，对于MD的诊断，需要综合考虑流行病学、临床症状、病理学以及实验室检查等多方面因素，实验室诊断常用的方法包括病毒抗原检测、血清学方法（如琼脂扩散法）以及PCR技术，在这些方法中，PCR技术可有效地对疫苗株和野毒株进行区分。在针对病毒携带情况展开检测工作时，采集了沈阳地区9家养殖单位的272份样本（羽髓、脾脏、肝脏），运用PCR技术，依据MDV的132bp重复序列来设计引物开展检测，检测结果显示，所提取的样本DNA在纯度以及完整性方面表现良好，可用来进行后续的实验。MDV野毒株总的阳性率是9.92%，疫苗株阳性率为51.84%，疫苗株阴性率为38.24%，不同组织样本的病毒检出率存在差异，羽髓样本的野毒株阳性率是最高的，肝脏样本没有检测出阳性。综合各项研究得出的结果来看，沈阳地区广泛运用的疫苗免疫策略切实有效地减轻了野毒株的感染压力，然而野毒株依旧持续存在这一情况说明免疫方面存在着漏洞，为了做好MDV的防控工作，需要着重强化环境消毒，像针对羽毛屑采用次氯酸钠进行处理，还要加强生物安全措施，做好防范鸟类以及老鼠的工作，严格落实空舍期消毒，每一批鸡出栏之后要让鸡舍空着7至10天，在养殖的期间要定期开展带鸡气雾消毒，对于重点区域要增加消毒的频次，在种蛋入孵之前进行熏蒸处理，及时将病鸡隔离并淘汰，妥善处置病死的禽类、羽毛、粪便、受到污染的垫料以及污水等。未来还需要从病原学、免疫学以及管理策略等多个维度展开深入研究，定期进行监测评估，对防控策略加以优化，以此保障养禽业可健康地发展。关键词：鸡马立克氏病；马立克氏病毒；流行病学调查；PCR检测；防控措施

第一章前言鸡马立克氏病（Marek’sdisease，MD））乃是由疱疹病毒属的马立克氏病毒（（Marek’sdiseasevirus，MDV）引发的一种有高度传染性的鸡淋巴组织增生性疫病[1]，此疾病以高传染性、广泛流行性以及独特的单核细胞浸润于各类器官与组织而闻名，对家禽健康构成严重威胁，疫苗接种是控制鸡MD的主要手段，自20世纪70年代起，借助疫苗接种，MD已获得成功控制，在家禽业的经济损失方面有了明显减少，不过鉴于MDV持续繁衍变异并产生新的亚型，疫苗免疫失败的情况屡屡出现。在中国，MDV首次被报道是在20世纪70年代，自1907年发现该病以来，MD在世界各地广泛传播，给禽类养殖行业给予了巨大的经济损失与危害[2]，当前绝大多数中国家禽企业在孵化时接种的是CVI988疫苗、814（一种中国广泛使用的GaHV-2有效减毒疫苗）疫苗或者CVI988+HVT双价疫苗（CVI988+HVT）。[3]因此，对马立克氏病准确诊断、有效预防与精确控制显得极其关键且必要，尤其是在提升生产效率与减小经济损失方面，其作用至关重要。本文全面阐述了鸡马立克病的发病状况、临床表现、病理变化以及实验室诊断方法，并着重提出了将加强预防策略与实施疫苗接种作为防治马立克病的基本原则。1.1马立克氏病概述马立克氏病，俗称“鸡瘫痪病”“鸡肿瘤病”，是目前流行较广泛的一种病毒性传染性疾病，长期以来严重危害禽类养殖业健康发展，一旦发生即可引起鸡群较高的发病率和死亡率。MD临床表现多样，共有神经型、内脏型、眼型以及皮肤型四种类型，每一种类型都在不同部位引发特定的症状。病情严重时，可能出现混合感染。[4]该病普遍发生于世界所有禽类养殖国家和地区，任何品种、年龄的鸡群均有可能感染，且该病的发生不遵循季节性规律。MDV编码100多个基因，参与病毒生命周期的各种过程且目前尚未开发出针对性治疗药物，如有发生即造成严重卫生安全和经济损失。[5]1.1.1马立克氏病毒病原学鸡马立克氏病病毒（MDV）隶属于疱疹病毒科马立克病毒属，为典型的细胞结合性病毒。该病病毒分为三个血清型：血清1型（MDV-1），属强毒株，具有强致病性，可诱发肿瘤及免疫抑制；血清2型（MDV-2），为弱毒株，属于非致瘤性马立克氏病毒，致病性较弱，通常不引发肿瘤；血清3型（MDV-3），火鸡疱疹病毒（HVT），常用于疫苗，提供交叉保护。[6]1.1.2基因组结构：MDV基因组是线性双链DNA分子，其大小处于160至180kbp之间，呈现出典型的α疱疹病毒基因组结构特点，被归类为E类基因组，该基因组由两个独特区域组成，即长独特区（uniquelongregion,UL）以及短独特区（uniqueshortregion,US）[7]，还包含两对方向不同的重复序列，分别是末端长重复区（terminalrepeatlongregion,TRL）与内部长重复区（internalrepeatlongregion,IRL），以及末端短重复区（terminalrepeatshort,TRS）与内部短重复区（internalrepeatshort,IRS）。在此，TRL与IRL、TRS与IRS分别有序列相同但方向相反的特性，[8,9]其中致病基因主要是meq基因，它是最关键的致瘤基因，可编码一种bZIP转录因子，pp38基因与病毒潜伏感染和肿瘤转化有关[10]，pp38蛋白含有多个抗原表位，能诱导机体内的免疫机制在潜伏感染和肿瘤细胞中持续表达，和病毒早期感染相关，vIL-8基因编码病毒白介素8类似物，参与免疫调节。1.1.3病毒复制：MDV的复制依照一种典型的细胞结合病毒复制模式来进行，当MDV侵入机体后，它与细胞之间的相互作用呈现出三种主要形态，首先要说的是生产性感染，这是MDV在鸡羽囊上皮细胞里采取的一种完全生产性感染策略，在这个过程中，MDV大量产生带有囊膜的病毒粒子，这些粒子脱离细胞后依旧保持着较高的传染性。不过在部分淋巴细胞、上皮细胞以及多数培养细胞当中，MDV呈现出一种生产-限制性感染的特性，这种感染形式随着抗原的合成，但是所产生的病毒粒子大多没有囊膜，不有传染性，生产性感染大多时候致使细胞溶解，也被称作溶细胞感染，和生产性感染相比，生产-限制性感染更多地体现为潜伏感染，它主要在被激活的CD4+T细胞中发生，但在CD8+T细胞和B细胞中同样可观察到。[11]潜伏感染是一种非生产性的感染状态，它没办法借助常规的显微镜观察等方式直接检测出来，而要依靠DNA探针杂交技术或者体外培养以激活病毒基因组的办法来进行确认，除了上述两种感染形式之外，MDV还存在第三种感染方式——转化性感染，这是MD淋巴瘤中大多数转化细胞共有的特征。转化性感染只局限于T细胞，而且只有强毒MDV才有引发这种感染的能力，与潜伏感染中病毒基因组虽存在但不表达的情形不同，转化性感染以病毒基因组的有限表达为其特征，其中Meq基因在转化细胞的核内正常表达，同时在S期的胞质中也能检测到其表达，该基因与亮氨酸拉链类致瘤基因有同源性，这指出转化性感染与细胞癌变之间的潜在关联。转化细胞可表达多种非病毒抗原，其中MD肿瘤相关表面抗原(MATSA)就是其中的一种代表性抗原。1.1.4流行病学沈阳地区主要流行的MDV血清型为血清1型（MDV-1），此血清型致病性较强，在密集养殖场，应给予重点关注，感染鸡与病鸡成为该疾病的主要传染源头，它们借助空气流动、散落的羽毛屑以及粪便等多种途径，在鸡群内部顺利实现病毒的扩散，病毒的传播方式有直接的物理接触，也有借助气源进行的间接接触。病毒能在羽囊上皮细胞中复制增殖，随后随羽毛脱落和皮屑产生被排出体外，如此一来，即便鸡舍灰尘，经长年累月积累也可能保持传染性，众多外表看似健康的鸡只，实际上可能长期携带并排出病毒，成为潜在传染源，在一般饲养条件下，MDV（马立克氏病病毒）能在鸡群中广泛传播，待鸡只性成熟时，几乎都难以幸免感染。大量健康鸡只也可能成为病毒携带者，持续排出病毒，加剧疾病在鸡群中的蔓延，不过该病毒不有垂直传播能力，即从母鸡借助种蛋直接传染给后代的风险较低，这一特性在一定程度上限制了病毒传播的范围和速度，从感染范围看，该病普遍性极高，能感染任何品种鸡只，但其发病率和死亡率存在明显个体差异，这主要受鸡只个体耐药性影响。不同品种或品系的鸡均具备感染马立克氏病毒（MDV）的能力，然而，它们在面对MD（即肿瘤）发生时所展现出的抵抗力却存在着显著的差异。这种抵抗力的差异，从根本上讲，植根于禽类所具备的免疫应答能力之中，这一能力是构成遗传抗病力与年龄抗病力的共同基石。具体而言，遗传抗病品系的鸡在年龄增长过程中所表现出的抗病力，相较于遗传敏感品系而言，显得尤为突出和明显。在性别差异方面，母鸡相较于公鸡而言，对MD的易感性更高，这进一步丰富了我们对MD感染复杂性的认识。为了深入研究MD的抗性机制，一些实验室已经成功培育出了对MD具有高度抵抗力或高度易感性的纯系鸡。这些实验室的努力，为我们提供了宝贵的动物模型，有助于揭示MD的致病机理和抗性机制。在实际生产中，一些常见的蛋鸡品种，如伊莎、罗曼、海赛等，以及国内的北京油鸡和狼山鸡，均被发现对MD具有高度易感性。此外，乌骨鸡这一特色品种也被证实对MD具有很高的易感性。这提醒我们在养殖过程中需要特别关注这些品种的MD防控工作。值得注意的是，感染时鸡的年龄也是影响MD发病的一个重要因素。特别是在出雏和育雏室的早期阶段，如果鸡只感染了MDV，那么很可能会导致极高的发病率和病死率。这一发现强调了早期防控MD的重要性，也为我们制定有效的MD防控策略提供了科学依据。1.1.5临床症状与病理变化临床症状：依据鸡马立克氏病侵害的病变部位以及所呈现出的临床表现，该疾病可被划分成4种类型，分别是神经型(古典型)、急性型(内脏型)、眼型以及皮肤型，并且也存在出现混合症状的情况[12]。神经型病变的关键特点是外周神经出现异常肿大，展开来说，像坐骨神经丛、腹部迷走神经、肱骨神经丛、肋间神经以及腹部神经丛等关键部位，原本有的横纹与光泽渐渐消失，呈现出淡黄色或者灰白色的样子，在形态上好似经过水煮后那般肿大变粗，这种肿大有可能是局部性的，也有可能是弥漫性的，其体积大多时候能达到正常状态的2至3倍。随着这种神经肿大情况，还会出现十分突出的运动功能障碍，比如当坐骨神经受到影响而肿大时，病鸡会表现出独特的劈叉姿态，要是前臂神经发生肿大，就会致使病鸡的侧翅膀自然下垂，更为严重的是，多数病鸡因为运动障碍加剧，无法进行有效的采食和饮水，最终导致死亡[13]，在临床症状方面，肢体的非对称性不全麻痹构成了马立克氏病（MD）的一个标志性特征，这一症状随后会逐渐演变成完全麻痹状态。受损的神经部位不同，所表现出的临床症状也会有差异，臂神经受损时，鸡翅会因麻痹而下垂，控制颈肌的神经受到侵害，病鸡可能会出现头部下垂或头颈歪斜的现象，迷走神经一旦受害，可能引发嗦囊异常扩张或喘息症状，坐骨神经受到侵害，具体表现为步态不稳定，随后可能完全麻痹，病鸡无法行走，只能蹲伏在地上，或者呈现出典型的“劈叉”姿势，也就是一腿向前伸展，另一腿向后伸展，这也是神经侵害中较为常见的一种类型。内脏型病鸡呈现出一系列症状，精神状态显得萎靡不振，食欲明显减退，羽毛变得杂乱无章，体重呈现渐进性减轻，还伴有持续性腹泻，这类病例的病程往往比较长，最终大多是因为多器官系统功能衰竭而导致死亡，死亡率一般处于10%至30%之间，偶尔会出现急剧上升到70%的情况。当MD急性疫情发生时，病情格外严重，初期的特征是大量鸡只精神沉郁，在数日之内部分个体出现共济失调症状，接着发展为单侧或者双侧肢体瘫痪，部分鸡只突然死亡，而多数鸡只则呈现出脱水、消瘦以及昏迷的状态。眼型特征具体表现为虹膜出现受损情况，引发失明的症状，存在一侧或者双侧虹膜出现异常现象，色彩有所减退，瞳孔呈现出同心环或者斑点状甚至是弥漫性的灰白变化，在初期的时候边缘并不规则，到了终末期会缩小至针尖样的小孔，病程延长的情况下会伴有体重减轻、肤色变得苍白、食欲减退以及腹泻等症状。致死原因一般归结于饥饿、脱水或者同笼鸡只的踩踏。皮肤型多在在外体形成小结节或瘤状物，大腿、颈、躯干和背部尤为突出。羽毛囊上皮也发生增生。[14]病理变化：本病作为一种肿瘤性疾病有着自身特点，其潜伏期比较长，一般能持续3至4周，一旦感染，动物体可能长时间携带病毒，成为潜在传染源，[15]实验室条件下，对1日龄雏鸡人工接种后，雏鸡大约2周后开始排毒，排毒高峰期在接种后3到5周，接种后3至6天内，雏鸡会出现溶细胞感染现象，之后6至8天内，淋巴器官会发生变性损害。大约接种2周后，依靠组织学检查能观察到神经组织和其他器官出现单核细胞性浸润。通常情况下，本病的临床症状以及病理变化在接种之后的3到4周才会较为明显地呈现出来，早期死亡综合征有一个典型特征，即在感染后的8到14天内出现死亡情况，在现场实际的养殖环境里，本病的潜伏期大多时候很难精准判定，原因在于其会受到多种因素的作用，如病毒毒力的强弱、接种剂量的大小、感染途径的不同，以及被感染鸡的遗传品系、年龄以及性别等。这些因素共同发挥作用致使潜伏期存在较大的个体差异，对于种鸡和产蛋鸡来说，它们一般在4到20周龄之间出现十分突出的临床症状，此阶段是养殖过程中需要着重关注与管理的关键时期。最恒定的病理变化部位大多集中于外周神经，这种病理变化大多时候呈现出单侧性的特征，借助对两侧神经加以对比观察，可在很大程度上辅助医生实现准确诊断，在内脏器官当中，卵巢是最容易遭受侵害的部位，排在卵巢之后的是肾脏、肾上腺、脾脏、肝脏、心脏、肺部、胰腺、肠系膜、腺胃以及肠道。另外肌肉和皮肤也有遭受侵害的可能性，在上述所提到的器官和组织里，可观察到大小各异的肿瘤块，这些肿瘤块一般呈现出灰白色，质地坚硬且致密，有时候，肿瘤会以弥漫性的形态存在，使得整个器官增大，个别病鸡因为肝脏和脾脏的极度肿大，甚至会出现破裂的情况，引发内出血，最终导致突然死亡。在进行剖检的时候，可以看到病鸡的头部颜色苍白，肝脏上有裂口，肝表面覆盖着较大的血凝块，腹部除了法氏囊之外，其他内脏的肉眼可见变化在很大程度上与禽白血病等其他肿瘤病不容易明确区分，而且体腔内积聚了大量的血水。在极为罕见的情形之下，会出现弥漫性增厚的肿瘤改变，此种改变乃是由肿瘤细胞的滤泡间浸润引发的，就皮肤方面的病理改变而言，其大多时候和羽囊存在关联，不过并非仅仅局限于羽囊，这些病理改变可相互融合，形成成片的、边界清晰的白色结节，在拔去羽毛后的胴体之上，这种变化会显得格外明显。1.1.6马立克氏病的诊断方法MDV（马立克氏病病毒），有很强的接触传染性，这让它在商业饲养的鸡群里几乎到处都有，不过虽然MDV广泛存在，但在被感染的鸡群中，只有非常少的一部分会真正发展成马立克氏病（MD），那些接种了疫苗的鸡，虽说能在很大程度上得到保护不出现MD的临床发病情况，但还是有可能被MDV的强毒株感染。只根据鸡是否感染MDV，不能作为准确诊断其是否患MD的唯一标准，要做出准确诊断，得综合考虑多方面信息，像流行病学资料、具体临床症状表现、病理学检查结果以及依靠实验室手段得到的各项数据。马立克氏病的实验室诊断实验室检查可借助病毒抗原检测以及更详尽的血清学方法来开展，在此过程里，主要是借助检测组织样本中的病毒抗原或者核酸成分，以此明确是否存在病毒感染状况，在实际操作时，可采用病鸡的肿瘤组织、经过抗凝血处理后的样本，或是含有血液淋巴细胞的悬液，作为接种所需材料。随后将这些材料接种到鸡胚成纤维细胞中培养，等蚀斑出现后，收获相应盖片，并用冷丙酮进行固定处理，紧接着利用单抗进行免疫荧光染色，以准确鉴定病毒，聚合酶链反应（PCR）试验也是一种有效的方法，它能扩增马立克病毒的特异序列，帮助区分致弱株和野毒株，不过虽说PCR试验有较高敏感性，但在某些情形下，可能仍无法检测出潜伏感染的存在。这主要是由于在潜伏感染状态下，阳性细胞数量往往较少，且每个细胞中病毒基因的拷贝数也相对较低，为更准确评估感染鸡组织中的病毒载量，一般会采用定量PCR试验，这一方法能提供更精确的数据支持，且正逐渐成为马立克病诊断和流行病学研究中不可或缺的关键手段[16]。血清学方法于实际应用里广泛采用琼脂扩散技术，此技术具体操作是：在用心制备的琼脂平板之上，借助特制的梅花形状打孔器精准地打出若干孔洞，之后，用细小的针头小心地把孔中的琼脂挑除，以此保证后续实验顺利开展，接着为封闭这些孔洞底部，操作人员会用酒精灯轻烤平皿底部，直到琼脂受热微微融化，这时迅速移开酒精灯，防止过度加热影响实验结果。准备好琼脂板后，下一步是往中央孔洞加入预先稀释好的马立克高兔血清，把标准阳性抗原悬液分别加至外周相对位置的两个孔洞中，其余孔洞用来加入待检测的羽髓浸出液，加样完毕后，整个平皿要静置5至10分钟，让所有样本充分与琼脂板接触并发生可能的反应，随后将平皿倒置放入设定为37℃的恒温培养箱中进行一段时间孵育。在此期间，分别在24小时和48小时时间点观察实验结果，要是标准阳性血清与标准抗原孔之间出现明显沉淀线，阳性对照实验成功，保证了整个实验流程有效且准确，在实验成立的条件下，若待检测的血清或抗原与标准阳性血清之间也观察到明显沉淀线，且这些沉淀线与标准抗原孔和标准血清孔中的沉淀线末端相互融合，那么可判断待检测样品为阳性。这一结果对疾病诊断、疫情监控以及疫苗效果评估等方面都有关键指导意义[17]。马立克氏病病理切片诊断取固定好的肺脏组织修整为立方体，浸蜡，冷却后切成4μm厚的连续切片，HE染色，光学显微镜下观察病理变化并拍照记录。4日龄后染病鸡肺脏组织内可见大量的淋巴样细胞浸润，30日龄剖杀可见肿瘤细胞在肺脏内呈局灶性或弥漫性生长。[18]1.2研究目的本研究的来了解当下沈阳地区规模化鸡场MDV的感染状况及其流行趋势，运用PCR方法检测MDV，以此了解沈阳地区MDV的流行情况，依据MDV的meq、pp38以及132bp重复序列设计特异性引物[19]，对扩增出的特定条带进行测序，鉴定感染病毒的毒力强弱，为沈阳地区规模化鸡场MDV的防控提供基础数据，明确该地区MDV的病原型分布。凭借分析沈阳地区鸡马立克氏病毒（MDV）的病原型、性状及流行情况，明确该地区流行的MDV分布特征，为针对性防控提供科学依据，探索MDV的综合防控措施，结合疫苗接种、生物安全措施以及饲养管理，探寻适合沈阳地区的MDV综合防控方案，降低MDV对养禽业的危害，借助本研究，为MDV的病原学、流行病学和防控技术提供新的科学数据，推动该领域的研究进步，帮助养禽业的健康发展。1.3防控措施疫苗接种是防控本病的关键，以防止出雏室和育雏室早期感染为中心的综合性防控措施对提高免疫效果和减少损失亦起重要作用。[20]1.3.1马立克氏病疫苗接种用于制造疫苗的病毒主要有三大类别：其一为血清1型MDV，像CV1988便是其中的代表毒株，其二是自然不会致瘤的血清2型MDV，SB-1和Z属于其典型毒株，其三是血清3型MDV，也就是HVT，FC126是该类型里较为知名的毒株，在这三种病毒里，HVT疫苗的使用历史最为久远，应用范围也最为宽广。这一方面是因其制作成本相对比较低，另一方面是它可制成冻干制剂，让疫苗的保存以及使用变得更加便利，在疫苗种类中，多价疫苗占据关键位置，它们主要由血清2型和3型MDV组合而成，或者是血清1型和3型MDV组合而成，这样的组合可提供更全面的免疫保护，不过血清1型MDV和血清2型MDV在疫苗形式上存在限制，它们只能制成细胞结合疫苗，而且这类疫苗需要在严格的液氮条件下保存，以此保证其稳定性和效力。在MD的防控策略中，合理挑选和使用疫苗十分关键，疫苗的选择要考虑病毒的血清型，还得结合养殖动物的种类、生长周期以及养殖环境等多方面因素，在我国，目前饲养的生长期较短的肉鸡品种一般不接种MD疫苗，这主要是鉴于其较短的生长周期以及较低的MD发病风险，然而对于生长期较长的“三黄”肉鸡以及蛋鸡、种鸡等，由于它们面临更高的MD发病风险，更倾向于使用免疫效力最高的CVI988疫苗，以提供更可靠的免疫保护[21]。诸多复杂且多样的因素会对疫苗的免疫效果造成影响，其中早期感染被视作致使免疫鸡群出现超量死亡的关键因素之一，这是由于接种疫苗后，鸡群大概需7天时间才能建立起坚强免疫力，然而在这关键的免疫构建期，鸡只于出雏室和育雏室都面临潜在感染风险，这些感染风险可能削弱疫苗预期效果，还可能使鸡群死亡率上升，给养殖业带来经济损失。了解并控制影响疫苗免疫效果的因素，早期感染问题，对维护鸡群健康与提高养殖效益意义重大。1.3.2饲养管理对马立克氏病的影响加强饲养管理对该病预防具有显著效应，故而需提升饲养管理水平，为鸡群供给营养充沛的饲料及清洁饮水，雏鸡饮水需加热至适宜温度，尤忌寒冷季节提供过低温水，并可在饮水中添加多种维生素及微量元素，供给高品质饲料以增强鸡只免疫力。同时，应缩减鸡群密度，优化通风状况，减轻应激反应。维持鸡舍清洁干燥状态，规避潮湿与拥挤环境。[22]第二章沈阳地区马立克氏病发病情况调查2.1材料与方法2.1.1材料：在2024到2025年期间沈阳地区的18个养殖单位与各个防疫中心及兽医兽药站中，与行政人员、管理人员、饲养技术人员、兽医、兽药销售人员等进行交流，了解各场的饲养情况、环境情况、MD的发病情况、免疫情况及防治措施等等。将沈阳地区鸡养殖单位按照养殖规模分为规模化养殖场（饲养羽数超过10000羽，共11家）、个体养殖场（饲养羽数小于10000羽，共10家），同时还对防疫中心及兽医兽药站（共12家）进行信息统计。2.1.2调查方法：本研究运用横断面调查（cross-sectionalsurvey）与回顾性分析（retrospectiveanalysis）二者相结合的办法，借助多阶段分层抽（multistagestratifiedsampling）的方式针对沈阳地区的养殖单位展开流行病学调查。其具体的步骤如下所示：问卷调查（QuestionnaireSurvey）：设计标准化电子问卷，涵盖养殖场基本信息、生物安全等级（biosafetylevel,BSL）、免疫程序（vaccinationprotocol）及历史发病数据。实地考察（FieldInvestigation）对抽样单位进行现场勘查，记录鸡舍布局（如密度/m²）、消毒设施（如紫外线照射强度、喷雾消毒频率）及废弃物处理流程（如粪便堆肥化参数）。临床样本采集（ClinicalSampling）：按WHO动物疫病采样指南，无菌采集疑似病例的羽髓（featherpulp）、脾脏（spleen）及肝脏（liver），置于RNA/DNA稳定液中，-80℃超低温保存。同步记录样本对应的临床症状（如神经症状评分、肿瘤肉眼病变分级）。2.1.3调查内容调查内容分为以下核心部分，均与MD发病有关且符合OIE疫病监测标准，包括：养殖场基础参数，如饲养规模、饲养环境、饲养方式、种群规模、日常消杀流程等；MDV感染指标，如是否有MD流行情况、若有MD的发生，其发生时的日龄、发病数、死亡数、MD的病型、诊断情况、处理方式等；MD的免疫与防控的进行，如是否进行MD的免疫、疫苗参数、免疫接种时间、疫苗种类、生物安全等级等。2.2结果分析2.2.1沈阳地区鸡养殖单位统计结果Figure2-1StatisticaldiagramofsurveyobjecttypesinShenyangarea图1-1沈阳地区调查对象类型统计图Figure2-1StatisticaldiagramofsurveyobjecttypesinShenyangarea图1-1沈阳地区调查对象类型统计图2.2.2沈阳地区鸡马立克氏病发病情况调查结果通过对沈阳地区养殖单位持续调查及与当地防疫中心及兽医兽药站排查后发现，均未发现MD的传播与流行。但经调查发现，在当地对鸡场样品检测疾病主要为新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡白血病与支原体病毒，未对MD进行检测，因此此次结果还需采集样本并检测加以确定。2.2.3沈阳地区鸡马立克氏病免疫情况调查结果通过对沈阳地区养殖单位持续调查及与当地防疫中心及兽医兽药站排查后，均进行了MD的疫苗免疫，规模化养殖场为1日龄疫苗免疫，有两家个体养殖场与规模化养殖场相同为1日龄疫苗免疫，而其他个体养殖场为直接购买已免疫的雏鸡。FigureFigure2-2SurveyandstatisticsofchickenMDimmunityinShenyangarea图2-2沈阳地区鸡MD免疫情况调查统计图2.3讨论2.3.1沈阳地区鸡养殖单位饲养情况调查分析辽宁省作为我国家禽养殖重要省份，2022年家禽出栏量达7.2亿只，占全国总量的8.5%，位列全国第四[23]，然而，集约化养殖模式带来的环境压力不容忽视。首先禽类粪便对环境的污染是不可避免的，研究表明，每只蛋鸡每年产生约55-65kg粪便（Lietal.,2020），其中含有大量氮（3.5-4.5%）、磷（1.8-2.5%）和重金属（如铜、锌等）[24]。禽类养殖过程中对环境的污染因素还有很多，其中还包括养殖废弃物及噪音污染，也会给当地的环境造成不可避免的影响。而经调查发现沈阳地区养殖品种结构呈现专业化趋势：蛋鸡中海兰褐占比达78%（适应东北气候，年产蛋量达300-310枚/只）；肉鸡中白羽肉鸡占65%（42天出栏，料肉比1.6:1），黄羽肉鸡30%（70-90天出栏，溢价15-20%），黑瑶肉鸡等特色品种5%（高端市场，价格是普通肉鸡2-3倍）2.3.2沈阳地区鸡养殖单位饲养环境情况分析调查结果说明规模化养殖场一般采用密闭式鸡舍，配备自动化通风与温控系统，平均养殖密度是8-10羽/㎡，个体养殖场则以开放式或者半开放式鸡舍为主，密度达到12-15羽/㎡，高密度养殖让空气传播风险加剧，在冬季通风不足的时候，羽毛屑和粉尘在鸡舍内长时间停留，成了MDV传播的关键媒介。大概65%的个体养殖场存在鸡舍布局混乱的情况（如育雏区与成鸡区未有效分隔），这就增大了交叉感染的可能性，消毒设施覆盖率有差异：规模化养殖场每天进行2次喷雾消毒（0.3%次氯酸钠），还进行紫外线空气消毒（强度≥70μW/cm²），孵化厅和育雏舍每周用福尔马林熏蒸1次，个体养殖场消毒频率低（每周1-2次），且35%的场户没有配备紫外线设备。在防鸟防鼠措施上，规模化养殖场均安装了防鸟网和电子驱鼠装置，个体养殖场只有40%采取了基础防护措施，使得野鸟和啮齿类动物接触风险增加。第三章沈阳地区鸡马立克氏病病毒携带情况检测分析3.1材料与方法3.1.1样本来源：2024年~2025年期间，采用随机抽样的方法进行样本采集，试验样本来自于沈阳地区各个养殖单位，其中肉鸡采集40~50日龄、蛋鸡采集70~80日龄的样本，样本组织包括羽髓、脾脏与肝脏。3.1.2主要设备主要使用试验仪器见表3-1：图3-1主要试验仪器Figure3-1Mainexperimentalinstrument仪器名称（Nameofinstiument）生产厂家（Manufacturer）全自动高压蒸汽灭菌器（SX500）电热鼓风干燥箱（DHG-9075A）酶标仪（INFINITE200PRO型）雪花制冰机（AF100）台式微量高速离心机（CT15RE）低速离心机组织研磨仪水平电泳仪凝胶成像仪（UniversalHoodⅡ）电子天平（AUW120D）金属浴PCR仪移液器水浴锅磁力搅拌器超纯水仪日本TomyDigitalBiology公司上海一恒科学仪器有限公司瑞士TECAN公司斯科茨曼制冰系统（上海）有限公司日立（中国）有限公司艾本德（上海）国际贸易有限公司中国塞维尔生物科技有限公司美国伯乐上海勤翔科学仪器有限公司日本岛津公司卡尤迪生物科技宜兴有限公司德国耶拿德国Eppendorf公司WIGGENS北京鼎昊源科技有限公司德国默克医药化工企业3.1.3主要试剂与耗材主要使用试验试剂与耗材见表2-2：Figure3-2MainReagentsandconsumable表3-2主要试剂与耗材试剂名称（Reagentname）生产厂家（Manufacturer）引物琼脂糖GoldenView核酸染料（G8140）RNasefreeddH20DEPC水6×DNAloadingbuffer50×TAE电泳缓冲液DL2000DNAMarkerDL3000DNAMarkerDL5000DNAMarker2×TaqMasterMix（QuickLoad）无水乙醇1.5mL去酶EP管移液枪头测序组织/细胞/血液基因组DNA提取试剂盒生工生物工程（上海）股份有限公司北京索莱宝科技有限公司北京索莱宝科技有限公司北京索莱宝科技有限公司北京索莱宝科技有限公司宝生物工程（大连）有限公司宝生物工程（大连）有限公司苏州近岸蛋白质科技股份有限公司苏州近岸蛋白质科技股份有限公司苏州近岸蛋白质科技股份有限公司苏州近岸蛋白质科技股份有限公司国药集团化学试剂有限公司上海卧宏生物科技有限公司白鲨生物科技有限公司江苏溥博生物科技有限公司沈阳塞维尔生物科技有限公司3.1.4方法沈阳地区样本采集在沈阳地区各养殖单位随机抽取采集鸡羽毛、脾脏与肝脏，共9家养殖单位、272份样本，其中羽毛98份，脾脏153份，肝脏21份，羽毛分别放入已编码的自封袋中，脾脏与肝脏分别放入已标号的1.5mL去酶EP管中，置于低温环境保存，带回实验室。沈阳地区所采集样本的处理方法在超净工作台，将鸡的肝脏、脾脏等各组织病料和羽髓预处理：（1）提前将所需的手术剪、药匙、研钵、研磨杵、离心管、枪头密封，进行高压蒸汽灭菌处理，灭菌后放入烘干箱中烘干待用。（2）取羽髓约2.0g放于已灭菌并预冷后的研钵中，倒入液氮，并用预冷后的研杵进行液氮研磨，用无菌剪刀剪碎置于1.5mL去酶EP管，加入200μLBufferGA。取脾脏和肝脏30mg左右，置于装有3颗3mm研磨小钢珠的1.5mL去酶EP管中，加入200μLBufferGA，使用组织研磨仪，对EP管中的疑似病料研磨3min，直至呈现匀浆状态。病毒核酸的提取和保存使用沈阳塞维尔生物科技有限公司组织/细胞/血液基因组DNA提取试剂盒提取处理好的样品上清DNA。（3）加入20μLProteinaseK和4μLRNaseA，56℃孵育30min，每10min涡旋混匀一次。（4）孵育后，进行12000rpm4℃离心2min，将上清液转移至新的1.5mL去酶EP管中，避免吸取沉淀。（5）加入200μLBufferGB，上下颠倒混匀，70℃孵育10min。（6）孵育后，加入200μL无水乙醇，上下颠倒混匀，会出现絮状沉淀，进行12000rpm室温离心2min。（7）将DNASpinColumn安置于CollectionTube上，并将上清液转移至DNASpinColumn中。（8）进行12000rpm室温离心30s，弃掉滤液，将DNASpinColumn重新放回CollectionTube中。（9）向DNASpinColumn中加入500μLBufferPD，12000rpm室温离心30s，弃掉废液。（10）沿着DNASpinColumn的管壁加入600μLBufferPW，冲洗管壁上残留的盐分，12000rpm室温离心30s，弃掉废液。（11）重复操作步骤.（12）将DNASpinColumn放入CollectionTube中，12000rpm室温离心2min。（13）将DNASpinColumn置于一新的1.5mL去酶EP管中，室温放置3~5min，使DNASpinColumn残留的乙醇完全挥发。（14）向DNASpinColumn的中央加入50μLBufferTE，室温放置5min。（15）12000rpm室温离心2min，收集DNA。提取的DNA放于-20℃保存。沈阳地区所采集样本总DNA质量的检测（1）通过酶标仪（INFINITE200PRO型）检测260nm/280nm紫外线吸光值（OD260/OD280）及其浓度，如提取的样本总检测值在1.7~2.0之间，则其纯度符合要求可用于后续实验。（2）使用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取样本总DNA的完整性。A.用电子天平称量1g琼脂糖粉末倒入锥形瓶中，加入1×TAE溶液定容至100mL，将锥形瓶放入微波炉内煮沸至粉末充分溶解，在瓶内加入2.5μLGoldenView并混匀，待其冷却至50℃左右时，缓慢倒入已准备好的胶板中，待其凝固后备用。B.将胶板放置于电泳槽内，电泳液完全浸没胶板，并注意电极方向。C.将6×DNAloadingbuffer与所提取的DNA按1:5比例配比混匀，用移液枪将混匀液体垂直加入泳道孔中，每孔上样量为6μL，电泳条件为恒压110V，电泳时间为20min。D.电泳结束后，关闭电泳仪，将胶板取出放入照胶仪中，照胶并保存结果。马立克氏病病毒132bpr基因PCR引物的合成按照中华人民共和国国家标准鸡马立克氏病诊断技术（GB/T18643-2021）中发表的引物对样本进行检测，引物由生工生物工程股份有限公司合成。表3-3MDV132bpr基因PCR引物序列Table3-3MDV132bprPrimerssequenceofPCRPCR引物名称（PCRprimername）PCR引物序列（PCRprimersequence）132bpr上游132bpr下游5’TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG3’5’GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC3’马立克氏病病毒132bpr基因PCR引物最适退火温度的筛选将引物3000rpm室温离心1分钟后，小心开盖，随后严格按照说明书加入DEPC水，将引物充分稀释溶解后，于-20℃冰箱保存，以备后续实验使用。根据引物与taq酶说明书中推荐的反应条件对引物进行特异性检验。表3-4MDV132bpr基因PCR反应体系（25μL）Table3-4PCRreactionsystemofMDV132bpr（25μL）组分（Component）用量（Dosage）2xFastPfusPCRMasterMix上游特异性引物下游特异性引物DNA模板RNasefreeddH2012.5μL1μL1μL1μL9.5μL表3-5MDV132bpr基因PCR反应条件Table3-5PCRreactionconditionsofMDV132bpr反应步骤（Reactionstep）反应温度（Reactiontemperature）反应时间（Reactiontime）预变性阶段循环反应阶段（40循环）延伸阶段94℃94℃Tm℃72℃72℃90s20s20s1min5min马立克氏病病毒132bpr基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测配置2%的琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，使电泳液完全没过胶板，依次加入3μLMarker和各不同温度下的PCR产物，电泳条件为恒压80V，电泳时间为30min。沈阳地区样本PCR检测确定引物最适退火温度后，对样本DNA进行PCR检测，PCR反应与条件同表3-4和表3-5；PCR结束后，对PCR产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测，方法同。根据中华人民共和国国家标准鸡马立克氏病诊断技术中发表的132bpr引物检测结果对样本进行判定：，若检测样本132bpr检测产物PCR扩增结果为317bp或449bp处出现大小单一条带，说明该检测样本为野毒株阳性；若检测样本PCR扩增结果为多带型条带（存在2条以上的条带一般可出现5条～8条,大小为185bp，317bp，449bp，581bp，713bp，845bp，977bp，1109bp），说明该检测样本为MDV-1型阳性；若结果无目的条带检出，说明该检测样本为阴性。3.2结果与分析3.2.1沈阳地区鸡样本总DNA提取结果图3-1沈阳地区部分样本总DNA提取结果Figure3-1PartialtotalDNAextractionresultsofShenyang注：M：DL15000DNAMaker；1-8：样本图3-1沈阳地区部分样本总DNA提取结果Figure3-1PartialtotalDNAextractionresultsofShenyang注：M：DL15000DNAMaker；1-8：样本DNANote:M:DL15000DNAMaker;1-8:samplesDNA3.2.2沈阳地区样本MDV检测结果图3-36-10号羽髓PCR检测电泳结果Figure3-3ElectrophoresisresultsweredetectedbyPCRNo.6-10feather图3-36-10号羽髓PCR检测电泳结果Figure3-3ElectrophoresisresultsweredetectedbyPCRNo.6-10feather注：M：DL2000Maker；1：阳性对照；2：阴性对照；3-7：6-10号样本PCR产物；8：对照组Note:M:DL2000Maker;1:positivecontrol;2:negativecontrol;3-7:No.6-10samplesPCRproducts;8:controlgroup图3-21-5号羽髓PCR检测电泳结果Figure3-2ElectrophoresisresultsweredetectedbyPCRNo.1-5feather注：M：DL2000Maker；1：阳性对照；2：阴性对照；3-7：1-5号样本PCR产物；8：对照组Note:M:DL2000Maker;1:positivecontrol;2:negativecontrol;3-7:No.1-5samplesPCRproducts;8:controlgroup脾脏样本共检测出MDV野毒株阳性13份，野毒株阳性率为8.50%，检测出MDV疫苗株阳性71份，疫苗株阳性率为46.4%。图3-541-45号脾脏PCR检测电泳结果Figure图3-541-45号脾脏PCR检测电泳结果Figure3-5ElectrophoresisresultsweredetectedbyPCRNo.41-45spleen注：M：DL2000Maker；1：阳性对照；2：阴性对照；3-7：41-45号样本PCR产物；8：对照组Note:M:DL2000Maker;1:positivecontrol;2:negativecontrol;3-7:No.41-45samplesPCRproducts;8:controlgroup图3-46-10号脾脏PCR检测电泳结果Figure3-4ElectrophoresisresultsweredetectedbyPCRNo.6-10spleen注：M：DL2000Maker；1：阳性对照；2：阴性对照；3-7：6-10号样本PCR产物；8：对照组Note:M:DL2000Maker;1:positivecontrol;2:negativecontrol;3-7:No.6-10samplesPCRproducts;8:controlgroup图3图3-66-10号肝脏PCR检测电泳结果Figure3-6ElectrophoresisresultsweredetectedbyPCRNo.6-10liver注：M：DL3000Maker；1：阳性对照；2：阴性对照；3-7：6-10号肝脏PCR产物；8：对照组Note:M:DL3000Maker;1:positivecontrol;2:negativecontrol;3-7:No.6-10samplesPCRproducts;8:controlgroup共检测出MDV野毒株阳性27份，野毒株总阳性率为9.92%；检测出MDV疫苗株阳性（已进行MD疫苗免疫）141份，疫苗株总阳性率为51.84%；检测出MDV疫苗株阴性（未进行MD疫苗免疫或免疫失败）104份，疫苗株总阴性率38.24%。

表3-6沈阳地区鸡样本检测结果Table3-6TestresultsofchickensamplesfromShenyangare场次Serialnumber规模Scale组织Tissue样本数量规模SamplesizeMDV野毒株阳性样本数NumberofpositivesamplesofMDVwildstrainMDV野毒株阳性率PositiverateofMDVwildstrainMDV疫苗株阳性样本数NumberofpositivesamplesfromtheMDVvaccinestrainMDV疫苗株阳性率PositiverateofMDVvaccinestrain123456789规模养殖场规模养殖场规模养殖场规模养殖场规模养殖场规模养殖场规模养殖场规模养殖场合计羽毛脾脏脾脏脾脏脾脏脾脏羽毛脾脏肝脏78份20份31份30份25份15份20份32份21份272份9份2份2份9份0份0份5份0份0份27份11.54%20.00%6.45%30.00%0.00%0.00%25.00%0.00%0.00%9.92%69份17份20份19份13份2份1份0份0份141份88.46%85.00%64.52%63.33%52.00%13.33%5.00%0.00%0.00%51.84%3.3讨论PCR检测属于一种简洁有效的快速诊断方式，借助PCR检测技术可检测出是否感染了MDV，还可区分疫苗毒株以及野毒株等不同血清型毒株[25]。本研究运用PCR技术，针对MDV的132bpr重复序列设计专门的特异性引物，以此来区分野毒株和疫苗株（如CVI988），此方法有较高灵敏度与特异性，并且经过对退火温度（45℃）进行优化后，扩增效率得到了提升，电泳结果显示，野毒株的扩增产物是317bp或者449bp的单一条带，而疫苗株呈现出多带型（185bp至1109bp），这与国家标准（GB/T18643-2021）相符，保障了结果的可靠性。实验针对沈阳地区收集到的272份样本展开分子生物学检测（包括羽髓、脾脏及肝脏组织），以此系统剖析该地区鸡马立克氏病毒（MDV）的携带状况以及流行特征，结果说明，MDV野毒株的总阳性率是9.92%，疫苗株阳性率为51.84%，这意味着沈阳地区普遍运用的疫苗免疫策略（如CVI988和HVT疫苗），切实有效降低了野毒株的感染压力。并且不同组织样本的病毒检出率存在差异，羽髓样本里野毒株阳性率为14.29%，比脾脏样本的8.50%要高，而肝脏样本未检测出阳性，这种差异或许和病毒的组织嗜性有关：MDV在羽囊上皮细胞中实现生产性复制，释放出有感染性的病毒粒子，凭借羽毛屑长时间排毒，致使羽髓成为病毒富集的主要组织。脾脏作为免疫器官，可能由于病毒潜伏感染或者疫苗免疫后残留的疫苗株核酸而呈现出较高检出率，不过野毒株（9.92%）的持续存在说明疫苗保护并非完全覆盖，可能受到病毒变异、免疫程序不合适或者早期感染等因素影响。。3．4小结本章借助分子检测技术得以明确沈阳地区MDV的流行实际状况：疫苗免疫有效控制了临床发病情况，然而野毒株的持续存在意味着免疫仍存在漏洞，野毒株在羽髓里的高检出率显示，病毒依旧在持续传播并且不断加强[26]，在密集养殖场，要强化环境消毒（如次氯酸钠处理羽毛屑）工作以及生物安全措施（防鸟、防鼠）。空舍期要进行彻底消毒：每一批鸡出栏之后，需要严格执行空舍期（7-10天），以此保证鸡舍以及设备表面没有病毒残留[27]，带鸡消毒：在养殖期间，定期运用0.3%次氯酸钠或者过氧乙酸开展带鸡气雾消毒（30-50mL/m³），降低气溶胶传播风险，重点区域要进行处理：孵化厅、育雏舍、饲料以及饮水设备需要高频次消毒，种蛋入孵之前要用福尔马林熏蒸，杀灭附着的病毒[28]。还要注意病鸡与污染物的处理：发病的鸡要立刻隔离并且淘汰，病死的禽、羽毛以及粪便要堆积发酵或者焚烧，保证病毒灭活，被污染的垫料要密封运输到指定区域进行处理，污水要经过次氯酸钠消毒之后排放，避免对环境造成污染，未来要从病原学、免疫学以及管理策略多个维度着手，定期进行监测与评估，保证防控策略可动态优化，构建科学的防控体系，为养禽业的可持续发展提供保障。结论家禽MD在我国被列为二类疫病，鸡马立克氏病（MD）是严重危害养鸡业健康发展的病毒性传染病，具有高发病率和高死亡率的特点。沈阳地区主要流行的MDV血清型为强毒型的MDV-1，其致病性强，尤其在密集养殖场中需重点关注。本次实验对2024-2025年共计采取沈阳地区共9家养殖单位、272份样本进行MD检测，其中14个厂区出现MD检测阳性，2个厂区MD检测结果为阴性。MD感染和养殖户自身所采用的饲养管理方式存在关联，在后续的养殖进程当中需要强化饲养管理，认真做好圈舍的清扫消毒以及疫苗免疫工作，积极防控MDV野毒株对家禽造成感染，MDV会借助空气、羽毛屑、粪便等途径来传播，很容易在鸡群里扩散，并且鸡只感染之后有可能会长时间携带病毒，这就加大了防控的难度。疫苗接种是防控MD的关键所在，把生物安全措施与优化饲养管理相结合，可有效地降低MDV对养禽业产生的危害。未来的研究需要深入剖析MDV的致病机制、病毒变异情况以及新型疫苗的开发工作，还要加强流行病学监测，并对综合防控策略给予优化，以此来推动MDV研究朝着科学的方向不断前进，帮助养禽业实现健康发展，借助科学的防控措施以及持续不断的研究努力，MDV对沈阳地区养鸡业所造成的威胁将会得到有效的控制。

引用文献[1]金元昌,张幽静,曹清国,等.鸡马立克氏病肿瘤相关非编码RNA表观遗传调控的研究进展[J].中国家禽,2021,43(08):1-7.[2]葛成菲,陆杭琼,刘长军.鸡马立克病病毒的进化及疫苗研究进展[J].中国科学:生命科学,2023,53(12):1722-1732.[3]Sun,Guorong,Zhang,Yanping,Lv,Hongchao,etal.AChineseVariantMarek'sDiseaseVirusStrainwithDivergencebetweenVirulenceandVaccineResistance[J].VIRUSES-BASEL,2017,9(04).[4]马建.马立克氏病[J].畜牧