表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的构建与免疫效果探究

表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的构建与免疫效果探究一、引言1.1研究背景与意义鸡传染性支气管炎（InfectiousBronchitis，IB）和鸡传染性喉气管炎（InfectiousLaryngotracheitis，ILT）是养鸡业中两种危害严重的疾病。鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒（InfectiousBronchitisVirus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，呈世界性分布。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，可导致成鸡增重和饲料报酬降低，鸡蛋产量、质量和孵化率下降，雏鸡死亡、肾脏病变和输卵管永久性退化。此外，IB还常参与混合感染，诱发慢性呼吸道病等，近年来其流行呈上升趋势，肾病变型IB已蔓延至全国各养鸡地区，给养鸡业造成了严重的经济损失。IBV血清型众多，目前世界上已分离到的IB血清型达30种之多，不同血清型毒株疫苗之间仅有部分或无交叉保护作用，这使得IB的免疫预防面临很大挑战。鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒（InfectiousLaryngotracheitisVirus，ILTV）引起的一种急性、高度接触性上呼吸道传染病，被国际兽疫局（OfficeInternationaldesEpizooties，OIE）列为B类传染病。本病特征为呼吸困难、喘气、咳出带血分泌物、喉部和气管黏膜肿胀、出血并形成糜烂，急性暴发时发病率可达90%-100%，死亡率为5%-70%（平均20%），蛋鸡产蛋量明显下降，严重影响养鸡业的经济效益。ILTV只有一种血清型，但在鸡上表现出不同的毒力，且其宿主范围窄，几乎只感染鸡和鸡源细胞。该病主要通过接触性感染，经呼吸道和眼睛侵入鸡体，一年四季均可发生，冬春寒冷季节发病较多。目前，针对这两种疾病的防控主要依靠疫苗接种。然而，现有的疫苗存在一些局限性。对于IBV疫苗，由于其血清型复杂，单一疫苗难以对所有血清型提供有效保护；对于ILTV疫苗，弱毒疫苗虽能预防临床疾病，但接种后动物反应较大，且存在潜伏感染导致毒力返强的风险，这给ILT的防控带来了难题。构建表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒具有重要意义。一方面，可利用ILTV作为载体，表达IBV的纤突蛋白，开发出针对两种疾病的二联疫苗，实现一针防两病，减少免疫次数，降低养殖成本；另一方面，通过基因工程技术构建重组病毒，有望克服传统疫苗的缺点，提高疫苗的安全性和有效性，为鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎的防控提供新的策略和方法，对保障养鸡业的健康发展具有重要的现实意义。1.2国内外研究现状1.2.1鸡传染性支气管炎病毒研究进展鸡传染性支气管炎病毒的研究一直是禽病领域的重点。在病毒结构与基因组研究方面，IBV属于巢式病毒目、冠状病毒科、γ-冠状病毒属，是有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组约27.6kb，5’端有帽子结构，3’端有poly(A)尾，从5’-3’端顺序依次为5’utr-la/1ab-S-3a-3b-e-m-5a-5b-n-3’utr。其主要结构蛋白包括纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），其中S蛋白在病毒感染和免疫中具有关键作用，它位于病毒粒子最表层的囊膜上，由mRNAB编码，可被切割为S1和S2两条糖多肽。S1蛋白决定了病毒的血清特异性抗原决定簇、组织亲和性及其毒力，能诱导血凝抑制抗体和中和抗体；S2糖蛋白可诱发较弱的中和抗体，有免疫优势且在大多数毒株中保守。在流行病学方面，IBV呈世界性分布，主要通过空气、接触病禽及其排泄物以及受污染的物品传播。每年10月到次年4月，由于外界环境温度较低，圈舍封闭、空气流通慢，易造成IBV大范围传播。IBV血清型众多，目前世界上已分离到30种之多，我国流行的主要毒株为QX（GI-19）、4/91（GI-13）、TW（GI-7）、MASS（GI-1），其中QX是优势毒株，且流行具有明显的地域性特征，主要集中在禽类养殖较为密集的中东部和南方地区，南方和华中地区商品鸡养殖场普遍存在多个基因型IBV毒株。疫苗研究是防控IB的关键。目前，IBV弱毒疫苗因免疫方式便捷、有效性较高而被广泛应用，如H120株是全球应用最广的疫苗株。随着反向遗传技术的发展，以IBV为载体表达外源基因的疫苗研制成为可能，但重组IBV通常存在遗传稳定性问题。有研究尝试用海肾荧光素酶基因替换IBV基因组的orf3、orf5和基因间隔区ir，发现hrluc基因替换orf5后重组IBV稳定性最高，但仅能稳定遗传至12代。此外，基于抗原表位的疫苗研究也显示出良好前景，选择具有保护性的抗原表位，以IBV为载体骨架构建表达多表位的重组IBV，是解决当前重组IBV稳定性差的有效方法。1.2.2鸡传染性喉气管炎病毒研究进展鸡传染性喉气管炎病毒的研究也取得了诸多成果。在病毒特性方面，ILTV属于α-疱疹病毒，病毒颗粒具有囊膜、核衣壳和核心，成熟病毒颗粒直径为195-250nm。其基因组由155kb的线状DNA分子组成，由位于反向重复序列两侧的长独特性片断（UL）和短独特性片断（US）构成。ILTV只有一种血清型，但在鸡上表现出不同毒力，宿主范围窄，几乎只感染鸡和鸡源细胞。它可在鸡胚及鸡胚的细胞培养物内良好增殖，经尿囊腔或绒毛尿囊膜途径接种ILTV，接种鸡胚后48h能观察到痘斑，2-12d鸡胚死亡。流行病学研究表明，鸡是ILTV感染的主要自然宿主，各种日龄和品种的鸡均可感染，成年鸡感染率可达90%-100%，死亡率差异较大，一般为10%-20%，近年来在养禽业发达国家由于饲养管理水平提高和疫苗应用，死亡率大大降低。该病主要通过接触性感染，经呼吸道和眼睛侵入鸡体，自然感染潜伏期随毒力不同而变化，强毒株一般为2-6d，弱毒株潜伏期可长达10-12d。一年四季均可发生，冬春寒冷季节发病较多，鸡群拥挤、通风不良等因素可促进本病发生。在疫苗研究方面，目前国内外防控ILT以弱毒疫苗为主，但弱毒疫苗存在接种后动物反应较大、潜伏感染导致毒力返强等问题。因此，新型疫苗的研发成为研究热点，如以鸡痘病毒（FPV）为载体表达ILTV糖蛋白的重组疫苗研究，但母源抗体的干扰限制了其大规模推广应用；也有研究致力于开发基因工程亚单位疫苗，但存在制造复杂、成本高、需额外佐剂和加强注射等问题。1.2.3重组病毒疫苗研究现状重组病毒疫苗是将编码有效抗原的特定基因插入病毒载体并表达而获得的疫苗，可诱导体液及细胞免疫。常用的病毒载体有腺病毒（Ad）、痘苗病毒（VV）、疱疹病毒、水疱性口炎病毒（VSV）、流感病毒等。疱疹病毒作为疫苗载体具有容纳外源基因能力强、可携带多个或较大基因等优点。在禽病领域，构建表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒是一种新的疫苗研发思路。通过基因工程技术，将IBV的纤突蛋白基因插入ILTV基因组中，期望获得既能预防ILT又能预防IB的二联疫苗。这样的重组病毒疫苗有望克服传统疫苗的缺点，如一针防两病，减少免疫次数，降低养殖成本，同时提高疫苗的安全性和有效性。目前，已有相关研究尝试构建此类重组病毒，但在重组病毒的构建技术、遗传稳定性、免疫原性及安全性评价等方面仍需深入研究和优化。1.3研究目标与内容本研究旨在构建表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒，并对其免疫效果进行评价，为开发新型的鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎二联疫苗提供理论依据和技术支持。具体研究内容如下：表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的构建：从GenBank中获取IBVS基因序列，根据其设计引物，通过PCR扩增S基因和S1基因，并将其克隆到pMD19-T载体中进行测序验证。将测序正确的S基因和S1基因分别插入到pUC19-ΔUS9载体中，构建转移质粒pILTΔUS9-S和pILTΔUS9-S1。利用脂质体转染法将转移质粒pILTΔUS9-S和pILTΔUS9-S1分别与ILTV全基因组DNA共转染至鸡胚成纤维细胞（CEF）中，通过同源重组获得重组病毒ILTV-ΔUS9-S株和ILTV-ΔUS9-S1株。采用PCR、间接免疫荧光试验（IFA）和Westernblot等方法对重组病毒进行鉴定，并研究其生长特性。IBVS1蛋白单克隆抗体的制备：将IBVS1基因克隆到原核表达载体pET-32a中，转化大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达重组S1蛋白。通过镍柱亲和层析纯化重组S1蛋白，将其免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，制备单克隆抗体，并测定其效价和亚类。利用制备的单克隆抗体对重组病毒表达的S1蛋白进行鉴定。表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的免疫效果评价：选取1日龄SPF鸡，随机分为对照组、ILTV弱毒疫苗组、重组病毒ILTV-ΔUS9-S株组和重组病毒ILTV-ΔUS9-S1株组。分别对各组鸡进行滴鼻免疫，免疫后不同时间采集血清，用ELISA法检测血清中抗ILTV和抗IBV的抗体水平。免疫21天后，用ILTVWG株和IBVCK/CH/LDL/091022分离株分别对各组鸡进行攻毒，观察鸡的临床症状，记录发病率和死亡率。攻毒后3天，采集气管和肺组织，用荧光定量PCR法检测病毒载量，评价重组病毒对ILTV和IBV的免疫保护效果。二、相关理论基础2.1鸡传染性支气管炎病毒（IBV）2.1.1生物学特性鸡传染性支气管炎病毒（IBV）在形态上略呈圆形，病毒粒子直径约80-120nm，表面有纤突和囊膜，整体外观近似皇冠，这也是冠状病毒得名的原因。其基因组为不分节段的单股正链RNA，长度约27.6kb，不同毒株的基因长度略有差异，本身具有感染性和信使RNA功能，这使得它能够直接在宿主细胞内发挥作用，指导蛋白质的合成。IBV病毒粒子主要由外面的囊膜和内部的核衣壳构成。外层的囊膜上存在两种病毒糖蛋白，即纤突蛋白（S蛋白）以及膜蛋白（M蛋白）。核衣壳直径为10-20纳米，呈螺旋形，由正链核糖核酸及其外面包裹的磷酸化核蛋白（N蛋白）组成。S蛋白是聚合物，由大小几乎相同的两个多肽非共价连接，其前体被蛋白酶切割成N端的S1以及C端的S2。S蛋白主要在囊膜外，C端一小段疏水区埋在囊膜内部，它是以2聚体或者3聚体的形式存在，主要具有粘附宿主细胞表面的受体和引发病毒粒子融合宿主细胞膜的功能，使得病毒粒子得以进入细胞内。除了S蛋白外，冠状病毒表面还分布着大量比S蛋白小一些的跨膜糖蛋白M和数量少且体积更小的非糖蛋白E，这些蛋白都是病毒粒子形成过程中所必需的。不同毒株M蛋白序列变化很大，N端含有潜在糖基化位点的约20个氨基酸暴露在病毒囊膜外，形成N-寡聚糖，能形成抗原决定簇，位于C端的氨基酸，与N蛋白相互作用而使N蛋白结合至囊膜上，参与病毒复制。N蛋白是磷酸化的蛋白，碱性氨基酸含量丰富，大约是17.2%，80%碱性氨基酸在位置上是比较保守的，N蛋白中间部分比两端保守，可能参与病毒核糖核酸合成、转录和翻译，与病毒核糖核酸结合，形成核衣壳。IBV具有众多血清型，目前世界上已分离到的IB血清型达30种之多。这主要是由于其基因组核酸RNA复制的不连续机制及RNA聚合酶的不完全校对机制，使得病毒RNA在复制过程中易发生基因点突变、插入、缺失或重组，造成大量IBV变异株的出现。我国流行的主要毒株为QX（GI-19）、4/91（GI-13）、TW（GI-7）、MASS（GI-1），其中QX是优势毒株。不同血清型毒株疫苗之间仅有部分或无交叉保护作用，这给IB的免疫预防带来了极大的挑战。此外，IBV的致病型（生物型）也不尽相同，现有呼吸型、肾病变型、生殖道型，1995年在我国还出现了腺胃型等。致病型与血清型没有相关性，不同致病型的鸡传染性支气管炎病毒其血清学相关性可能很远，也可能很近，而相同致病型的鸡传染性支气管炎病毒其血清学相关性同样可能很远，也可能很近。而且，在混合感染的情况下，IBV可以发生重组，很容易出现新的血清型或基因型，甚至是新的致病型。2.1.2纤突蛋白的结构与功能纤突蛋白（S蛋白）由mRNAB编码，位于病毒粒子最表层的囊膜上，是构成病毒纤突的主要成分，由2-3个相同的单体非共价连接构成聚合物。S蛋白包含两种糖多肽S1和S2，具有非常重要的生物学功能。在病毒感染过程中，S蛋白首先与宿主细胞膜上二糖蛋白受体结合，使IBV吸附在宿主细胞上。只有当S蛋白被宿主细胞的蛋白酶切割为S1和S2两条糖多肽时，病毒囊膜才有融细胞膜的活性，从而使得病毒能够进入宿主细胞内部，开启感染进程。S1蛋白的氨基N端决定了IBV毒株的组织亲和性及其毒力，同时它也是决定IBV血清特异性抗原决定簇的主要蛋白。不同血清型的IBV，其S1蛋白的氨基酸序列存在差异，这也导致了病毒的血清型差异以及对不同组织的亲和性不同。例如，某些血清型的IBV主要侵害呼吸道，而另一些则可能对肾脏、生殖道等组织具有更高的亲和性。在免疫应答方面，S蛋白可诱导机体产生血凝抑制抗体和中和抗体。其中，S1蛋白诱导产生的中和抗体能够特异性地识别并结合病毒，阻止病毒与宿主细胞的吸附和融合，从而发挥抗病毒作用。S2糖蛋白虽然诱发的中和抗体较弱，但它具有免疫优势，并在大多数IBV毒株中保守。S2糖蛋白在病毒感染和免疫过程中也发挥着重要作用，它可能参与了病毒粒子的组装和释放过程，并且其保守性使得它可以作为IBV疫苗设计的一个重要靶点。此外，S蛋白还能够刺激机体的细胞免疫应答，激活T淋巴细胞等免疫细胞，增强机体对病毒感染的抵抗力。2.2鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）2.2.1生物学特性鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科中的鸡疱疹病毒1型。病毒粒子呈近似球形，具有囊膜、核衣壳和核心，成熟病毒颗粒直径为195-250nm。其囊膜表面有糖蛋白纤突，这些纤突在病毒与宿主细胞的相互作用中发挥着重要作用。ILTV的基因组为155kb的线状双链DNA分子，由长独特性片断（UL）和短独特性片断（US）构成，两端分别排列着一个9kb的反向重复序列IRs，在UL上也发现了一个末端重复序列TRs，IRs和TRs序列相同，但方向相反。这种独特的基因组结构赋予了ILTV一些特殊的生物学特性。目前已确定的编码基因有VL区的TK、gB和gC基因，US区的pK、gX、P60基因及反向序列的ICP4基因。其中，TK基因是非必需基因，但它是α-疱疹病毒的一个毒力基因，TK功能缺失的毒株，在非分裂细胞中的复制能力相当低，能使潜伏于神经的病毒难以复发。gB基因是病毒感染性所必需的，它与病毒吸附和穿入宿主细胞有关，而且能诱导体液和细胞介导的免疫应答。ILTV只有一种血清型，但在鸡上表现出不同的毒力。它可在鸡胚及鸡胚的细胞培养物内良好增殖，经尿囊腔或绒毛尿囊膜途径接种ILTV，接种鸡胚后48h能观察到痘斑，2-12d鸡胚死亡。在鸡胚中，病毒会使鸡胚感染后胚体变小，绒毛尿囊膜增生和坏死，形成混浊的斑块病灶。在细胞培养中，病毒易在鸡胚细胞培养物上生长繁殖，并出现细胞病变，最早（接种后4-6小时）的细胞变化为核染色质变位和核仁变圆，随后胞浆融合，成为多核的巨细胞（合胞体），并且早在接种后12小时便能检出核内包涵体，随着培养时间的延长，多核细胞的胞浆出现大的空泡，并且由于细胞变性而变成更为嗜碱性。2.2.2作为疫苗载体的优势ILTV作为疫苗载体具有诸多显著优势。首先，在安全性方面，虽然ILTV是一种致病病毒，但通过基因工程技术对其进行改造，如缺失毒力相关基因（如TK基因），可使其毒力减弱，在体内使用较为安全。而且，ILTV宿主范围窄，几乎只感染鸡和鸡源细胞，这就降低了其传播给其他物种的风险，使得在疫苗应用过程中，对非目标宿主的安全性有较高保障。从免疫原性角度来看，ILTV能够在鸡体内引发强烈的免疫反应。它主要感染鸡的呼吸道，感染后能刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。其病毒粒子表面的糖蛋白是主要的免疫原，如gB基因编码的糖蛋白，在病毒接触和进入宿主细胞时起关键作用，也是ILTV的主要免疫原，能诱导体液免疫和细胞免疫。当将外源基因（如IBV纤突蛋白基因）插入ILTV基因组中构建重组病毒时，重组病毒在鸡体内增殖的过程中，不仅能激发机体对ILTV本身的免疫反应，还能诱导机体对外源基因表达产物产生免疫应答，从而达到同时预防两种疾病的目的。此外，ILTV基因组相对较大，这为容纳外源基因提供了便利。其基因组由155kb的线状双链DNA分子组成，有多个复制非必需区，可在这些区域插入外源基因，构建重组病毒。而且，ILTV在鸡胚及鸡胚细胞培养物内易于增殖，这有利于重组病毒疫苗的大规模生产，能够满足养鸡业对疫苗的大量需求。同时，由于ILTV只有一种血清型，在作为疫苗载体时，不会像某些具有多种血清型的病毒那样，因血清型差异导致免疫效果不稳定的问题，使得基于ILTV构建的重组病毒疫苗的免疫效果具有较好的一致性和可预测性。三、表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的构建3.1实验材料细胞、病毒与鸡胚：鸡胚成纤维细胞（CEF），由本实验室自行制备。具体制备方法为：选取9-11日龄SPF鸡胚，无菌取出鸡胚，去除头、四肢和内脏，用PBS冲洗后剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化，再用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，经滤网过滤、离心后，将细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞长满瓶底80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，备用。鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）全基因组DNA，由本实验室保存，该病毒株在CEF上连续传代培养，定期测定病毒滴度。10-11日龄SPF鸡胚，购自特定的SPF鸡胚供应商，购回后置于37℃、5%CO₂的孵化箱中孵化备用。质粒与菌株：克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司，该载体具有氨苄青霉素抗性基因，可用于筛选含有重组质粒的大肠杆菌。原核表达载体pET-32a购自Novagen公司，其多克隆位点丰富，便于目的基因的插入，且含有6×His标签，有利于重组蛋白的纯化。转移质粒pUC19-ΔUS9由本实验室构建并保存，该质粒是在pUC19的基础上，通过基因编辑技术缺失了US9基因，用于后续构建表达IBV纤突蛋白的转移质粒。大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司，DH5α用于质粒的扩增和保存，BL21（DE3）用于重组蛋白的表达。酶及主要试剂：TaqDNA聚合酶、PrimeSTARHSDNA聚合酶、限制性内切酶（EcoRⅠ、HindⅢ等）、T₄DNA连接酶、反转录酶M-MuLV均购自TaKaRa公司，这些酶具有高效、稳定的特点，能满足基因克隆和重组的实验需求。DNAMarker、ProteinMarker购自ThermoFisherScientific公司，用于核酸和蛋白质分子量的判断。质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自Omega公司，能高效、快速地提取和纯化质粒及DNA片段。脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，用于将重组质粒转染至细胞中。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司，用于制备免疫小鼠的抗原乳化剂。HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，用于ELISA和Westernblot检测中的二抗。其他常规试剂如氯仿、异丙醇、无水乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器和设备：PCR仪（AppliedBiosystemsVeriti96-wellThermalCycler）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，用于DNA的扩增。凝胶成像系统（Bio-RadGelDocXR+）购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，用于观察和分析核酸和蛋白质电泳结果。高速冷冻离心机（Eppendorf5424R）购自艾本德（中国）有限公司，用于细胞和核酸、蛋白质的离心分离。CO₂培养箱（ThermoFisherScientificForma3111）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，为细胞培养提供适宜的环境。超净工作台（苏州净化SW-CJ-2FD）购自苏州净化设备有限公司，用于无菌操作。酶标仪（ThermoFisherScientificMultiskanGO）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，用于ELISA检测中吸光度的测定。恒温摇床（NewBrunswickInnova44R）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，用于细菌的培养和振荡。引物：根据GenBank中登录的IBVS基因（登录号：[具体登录号]）和S1基因（登录号：[具体登录号]）序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：S基因上游引物：5’-[具体序列]-3’，引入EcoRⅠ酶切位点；S基因下游引物：5’-[具体序列]-3’，引入HindⅢ酶切位点；S1基因上游引物：5’-[具体序列]-3’，引入EcoRⅠ酶切位点；S1基因下游引物：5’-[具体序列]-3’，引入HindⅢ酶切位点。引物设计时，考虑了引物的长度、GC含量、Tm值等因素，确保引物的特异性和扩增效率。同时，在引物两端引入合适的酶切位点，便于后续基因克隆和重组质粒的构建。3.2转移质粒的构建IBVS基因和S1基因的扩增：取适量保存的IBV病毒液，按照TRIzol试剂说明书提取病毒总RNA。将提取的RNA进行反转录，反应体系为：5×M-MuLVBuffer4μL，dNTPs（10mmol/L）2μL，Random6mers（50μmol/L）1μL，RNA模板2μg，M-MuLV反转录酶（200U/μL）1μL，RNasin（40U/μL）1μL，用DEPC水补足至20μL。反应条件为：37℃1h，70℃15min，反转录产物cDNA于-20℃保存备用。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增S基因和S1基因。S基因PCR扩增体系为：2×PrimeSTARHSPCRBuffer25μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，cDNA模板2μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶（2.5U/μL）0.5μL，用ddH₂O补足至50μL。S1基因PCR扩增体系除模板为cDNA外，其他成分与S基因扩增体系相同。S基因PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min（根据S基因长度确定延伸时间），共35个循环；72℃终延伸10min。S1基因PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min（根据S1基因长度确定延伸时间），共35个循环；72℃终延伸10min。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否有目的条带。目的基因与pMD19-T载体的连接与转化：将PCR扩增得到的S基因和S1基因片段用胶回收试剂盒进行回收纯化。按照pMD19-T载体说明书进行连接反应，连接体系为：pMD19-TVector0.5μL，回收的目的基因片段4μL，SolutionⅠ5μL，于16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。取5μL连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，迅速冰浴2min；加入900μL无抗生素的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养1h；取200μL菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。阳性克隆的筛选与鉴定：次日，从LB平板上挑取单个白色菌落，接种于含氨苄青霉素（100μg/mL）的5mLLB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。取1μL菌液作为模板，用S基因和S1基因的特异性引物进行PCR鉴定，PCR体系和条件同目的基因扩增时一致。将PCR鉴定为阳性的菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件与GenBank中登录的IBVS基因和S1基因序列进行比对分析，验证插入基因的正确性。转移质粒的构建：将测序正确的含有S基因和S1基因的pMD19-T重组质粒分别用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切。酶切体系为：10×BufferK5μL，EcoRⅠ（10U/μL）1μL，HindⅢ（10U/μL）1μL，重组质粒5μL，用ddH₂O补足至50μL，37℃酶切3-4h。同时，对转移质粒pUC19-ΔUS9也用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切体系和条件同上。酶切结束后，将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒分别回收S基因和S1基因片段以及pUC19-ΔUS9载体片段。将回收的S基因片段与pUC19-ΔUS9载体片段用T₄DNA连接酶进行连接，连接体系为：10×T₄DNALigaseBuffer2μL，T₄DNALigase（350U/μL）1μL，回收的S基因片段5μL，回收的pUC19-ΔUS9载体片段2μL，16℃连接过夜，构建转移质粒pILTΔUS9-S。同理，将回收的S1基因片段与pUC19-ΔUS9载体片段连接，构建转移质粒pILTΔUS9-S1。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化方法同前。转化后，将菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。挑取单个白色菌落，接种于含氨苄青霉素（100μg/mL）的5mLLB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。取菌液进行PCR鉴定和双酶切鉴定，PCR鉴定引物为S基因或S1基因特异性引物，双酶切鉴定用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切，酶切体系和条件同前。将鉴定正确的转移质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果验证转移质粒构建的正确性。3.3重组病毒的构建及鉴定重组病毒的构建：将对数生长期的鸡胚成纤维细胞（CEF）接种于6孔细胞培养板中，每孔接种1×10⁶个细胞，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞长满80%-90%时进行转染。按照脂质体Lipofectamine2000说明书进行转染操作。分别取转移质粒pILTΔUS9-S和pILTΔUS9-S1各2μg，加入到100μL无血清的Opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5min。同时，取5μL脂质体Lipofectamine2000加入到100μL无血清的Opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5min。然后，将稀释好的质粒与稀释好的脂质体混合，轻轻混匀，室温静置20min，形成DNA-脂质体复合物。将6孔板中的培养基吸出，用PBS清洗细胞2次，每孔加入800μL无血清的Opti-MEM培养基。将制备好的DNA-脂质体复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇匀，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。4-6h后，吸出含有DNA-脂质体复合物的培养基，每孔加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养。转染后48-72h，观察细胞病变情况。当细胞出现明显病变（如细胞变圆、脱落、融合等）时，收集细胞培养上清，即为重组病毒的初代病毒液。将初代病毒液接种到新的CEF中进行传代培养，一般传代3-5次，以获得足够量的重组病毒。在传代过程中，要密切观察细胞病变情况，及时收集病毒液。重组病毒的鉴定：PCR鉴定：提取重组病毒ILTV-ΔUS9-S株和ILTV-ΔUS9-S1株的基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，用S基因和S1基因的特异性引物分别进行PCR扩增。PCR扩增体系和条件同转移质粒构建时目的基因扩增的体系和条件。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。如果在预期位置出现特异性条带，说明重组病毒中含有目的基因S或S1。测序鉴定：将PCR鉴定为阳性的重组病毒PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件与GenBank中登录的IBVS基因和S1基因序列进行比对分析。若测序结果与目的基因序列高度一致，进一步验证重组病毒中目的基因的正确性。免疫荧光鉴定：将CEF接种于24孔细胞培养板中，每孔接种5×10⁵个细胞，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞长满80%-90%时，分别接种重组病毒ILTV-ΔUS9-S株和ILTV-ΔUS9-S1株，同时以接种野生型ILTV的细胞作为对照。接种后48-72h，吸弃细胞培养上清，用PBS清洗细胞3次，每次5min。然后，用4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS清洗3次，每次5min。接着，用0.2%TritonX-100破膜10min，PBS清洗3次，每次5min。再用5%脱脂奶粉封闭1h，PBS清洗3次，每次5min。加入1:100稀释的鼠抗IBVS蛋白或S1蛋白单克隆抗体（自制或购买），37℃孵育1h，PBS清洗3次，每次5min。加入1:200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃避光孵育1h，PBS清洗3次，每次5min。最后，在荧光显微镜下观察，若接种重组病毒的细胞出现绿色荧光，而接种野生型ILTV的细胞无绿色荧光，表明重组病毒能够表达IBV的S蛋白或S1蛋白。Westernblot鉴定：将接种重组病毒ILTV-ΔUS9-S株和ILTV-ΔUS9-S1株的CEF以及接种野生型ILTV的CEF收集，用细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，将蛋白样品与上样缓冲液混合，100℃煮沸5min使蛋白变性。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，TBST清洗3次，每次10min。加入1:1000稀释的鼠抗IBVS蛋白或S1蛋白单克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10min。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1h，TBST清洗3次，每次10min。最后，用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下观察结果。若在预期位置出现特异性条带，且接种野生型ILTV的CEF无相应条带，说明重组病毒表达的S蛋白或S1蛋白能够被特异性抗体识别。3.4重组病毒的生长特性研究重组病毒在CEF中的生长曲线测定：将对数生长期的鸡胚成纤维细胞（CEF）接种于24孔细胞培养板中，每孔接种5×10⁵个细胞，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞长满80%-90%时，分别接种重组病毒ILTV-ΔUS9-S株和ILTV-ΔUS9-S1株，同时以接种野生型ILTV的细胞作为对照，接种量均为0.1MOI（感染复数）。接种后，每隔12h收集细胞培养上清，冻融3次，使细胞破裂释放病毒。采用TCID₅₀（半数组织培养感染剂量）法测定病毒滴度。具体操作如下：将收集的病毒上清进行10倍系列稀释，从10⁻¹到10⁻¹⁰，每个稀释度接种8孔CEF，每孔接种100μL，同时设正常细胞对照。接种后，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，每天观察细胞病变情况，连续观察7d。根据Reed-Muench法计算病毒滴度。以时间为横坐标，病毒滴度的对数值为纵坐标，绘制重组病毒和野生型ILTV在CEF中的生长曲线。重组病毒在鸡胚中的生长曲线测定：选取10-11日龄SPF鸡胚，将重组病毒ILTV-ΔUS9-S株和ILTV-ΔUS9-S1株以及野生型ILTV分别经尿囊腔接种鸡胚，接种量均为0.1mL/胚，每个病毒接种10枚鸡胚，同时设正常鸡胚对照。接种后，将鸡胚置于37℃孵化箱中继续孵化。分别于接种后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取出鸡胚，收集尿囊液，冻融3次，使病毒释放。采用TCID₅₀法测定尿囊液中的病毒滴度，方法同CEF中病毒滴度测定。以时间为横坐标，病毒滴度的对数值为纵坐标，绘制重组病毒和野生型ILTV在鸡胚中的生长曲线。生长特性分析：通过对重组病毒在CEF和鸡胚中生长曲线的分析，比较重组病毒与野生型ILTV的生长特性。观察重组病毒的生长速度、病毒滴度峰值出现的时间以及病毒滴度的高低等指标。如果重组病毒的生长速度与野生型ILTV相似，病毒滴度峰值出现的时间相近，且病毒滴度与野生型ILTV无显著差异，说明重组病毒在细胞和鸡胚中的生长特性良好，未受到插入的IBV纤突蛋白基因的明显影响；反之，如果重组病毒的生长速度明显减慢，病毒滴度峰值出现时间延迟，且病毒滴度显著低于野生型ILTV，则表明插入的基因可能对重组病毒的生长产生了不利影响，需要进一步分析原因，如基因插入位置是否影响了病毒的关键基因表达，或者重组病毒在传代过程中是否发生了突变等。同时，还可以比较ILTV-ΔUS9-S株和ILTV-ΔUS9-S1株之间的生长特性差异，分析不同的IBV纤突蛋白（S蛋白和S1蛋白）对重组病毒生长的影响。四、IBVS1蛋白单克隆抗体的制备4.1实验材料细胞与实验动物：SP2/0骨髓瘤细胞购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），该细胞株具有无限增殖能力，且不分泌抗体，常用于单克隆抗体制备中的细胞融合实验。细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于37℃、5%CO₂培养箱中，定期传代，保持细胞处于对数生长期。6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠饲养于SPF级动物房，温度控制在22-25℃，相对湿度为40%-60%，自由采食和饮水。在实验前，小鼠需适应环境1周，确保其健康状况良好。病毒与质粒：IBV毒株由本实验室保存，用于提取病毒RNA，进而扩增S1基因。原核表达载体pET-32a购自Novagen公司，该载体含有T7启动子、6×His标签等元件，便于S1基因的表达和重组蛋白的纯化。酶及主要试剂：限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T₄DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、PrimeSTARHSDNA聚合酶、反转录酶M-MuLV均购自TaKaRa公司，这些酶具有高效、稳定的特性，能够满足基因克隆和重组过程中的酶切、连接、扩增等反应需求。DNAMarker、ProteinMarker购自ThermoFisherScientific公司，用于在核酸和蛋白质电泳实验中确定条带的分子量大小。质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自Omega公司，能高效、快速地提取和纯化质粒及DNA片段。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司，用于制备免疫小鼠的抗原乳化剂，增强抗原的免疫原性。HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，用于ELISA和Westernblot检测中的二抗，以检测抗体-抗原复合物。其他常规试剂如氯仿、异丙醇、无水乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器和设备：PCR仪（AppliedBiosystemsVeriti96-wellThermalCycler）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，用于DNA的扩增，能够精确控制反应温度和时间，保证扩增的准确性和重复性。凝胶成像系统（Bio-RadGelDocXR+）购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，可对核酸和蛋白质电泳结果进行观察和分析，通过拍摄凝胶图像并进行分析软件处理，获取条带的亮度、位置等信息。高速冷冻离心机（Eppendorf5424R）购自艾本德（中国）有限公司，用于细胞和核酸、蛋白质的离心分离，可在低温条件下进行高速离心，有效保护生物样品的活性。CO₂培养箱（ThermoFisherScientificForma3111）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，为细胞培养提供适宜的温度、湿度和CO₂浓度环境，确保细胞正常生长和代谢。超净工作台（苏州净化SW-CJ-2FD）购自苏州净化设备有限公司，用于无菌操作，通过过滤空气和紫外线杀菌，减少实验过程中的微生物污染。酶标仪（ThermoFisherScientificMultiskanGO）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，用于ELISA检测中吸光度的测定，可快速、准确地读取样品的吸光值，从而判断抗体-抗原反应的强度。恒温摇床（NewBrunswickInnova44R）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，用于细菌的培养和振荡，提供稳定的振荡速度和温度，促进细菌的生长和代谢。引物：根据GenBank中登录的IBVS1基因（登录号：[具体登录号]）序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：S1基因上游引物：5’-[具体序列]-3’，引入EcoRⅠ酶切位点；S1基因下游引物：5’-[具体序列]-3’，引入HindⅢ酶切位点。引物设计时充分考虑了引物的长度、GC含量、Tm值等因素，确保引物具有良好的特异性和扩增效率。同时，在引物两端引入合适的酶切位点，便于后续将S1基因克隆到原核表达载体pET-32a中。4.2重组蛋白的构建S1基因的克隆与表达载体构建：以之前反转录得到的IBVcDNA为模板，使用带有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的S1基因特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系与扩增S基因和S1基因时类似，扩增条件也基本一致，95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min（根据S1基因长度确定延伸时间），共35个循环；72℃终延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的条带。将回收的S1基因片段与经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的原核表达载体pET-32a用T₄DNA连接酶进行连接。连接体系为：10×T₄DNALigaseBuffer2μL，T₄DNALigase（350U/μL）1μL，回收的S1基因片段5μL，回收的pET-32a载体片段2μL，16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，转化方法同前。转化后，将菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。重组蛋白的诱导表达与鉴定：次日，从LB平板上挑取单个白色菌落，接种于含氨苄青霉素（100μg/mL）的5mLLB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。将过夜培养的菌液按1:100的比例转接至含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8。加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达4-6h。诱导表达结束后，收集菌液，12000rpm离心1min，弃上清。加入适量的PBS重悬菌体，超声破碎细胞（功率200W，工作3s，间隔5s，共30min）。超声破碎后，12000rpm离心15min，分别收集上清和沉淀。将上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，观察重组蛋白的表达情况。同时，以未诱导的含重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）和诱导表达的空载体pET-32a转化的大肠杆菌BL21（DE3）作为对照。SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶进行考马斯亮蓝染色，染色液为0.25%考马斯亮蓝R-250，染色时间为1-2h。然后用脱色液（甲醇：冰醋酸：水=45:10:45）脱色，直至背景清晰，观察蛋白条带。如果在预期位置（根据重组蛋白的分子量大小确定）出现特异性条带，且诱导表达组的条带明显深于未诱导组和空载体对照组，说明重组S1蛋白成功表达。为了进一步验证重组蛋白的正确性，将SDS-PAGE电泳后的蛋白转移至PVDF膜上，进行Westernblot鉴定。鉴定方法同重组病毒的Westernblot鉴定，使用鼠抗IBVS1蛋白单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗。若在预期位置出现特异性条带，表明表达的蛋白为目的蛋白S1。4.3杂交瘤细胞的筛选免疫动物：将纯化的重组S1蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，对6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行皮下多点注射，每只小鼠注射剂量为[X]μg（根据蛋白浓度和小鼠体重等因素确定合适剂量）。初次免疫后，间隔2-3周，用重组S1蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后进行第二次免疫，注射剂量和方式同初次免疫。再间隔2-3周，用不含佐剂的重组S1蛋白进行腹腔注射加强免疫，注射剂量为[X]μg。加强免疫3天后，通过断尾取血，采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗S1蛋白抗体的效价。具体操作如下：将重组S1蛋白用包被缓冲液稀释至[X]μg/mL（根据预实验确定最佳包被浓度），每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次，每次3min。然后用5%脱脂奶粉封闭，每孔200μL，37℃孵育1h。弃去封闭液，PBST洗涤3次，每次3min。将小鼠血清用PBST进行2倍系列稀释，从1:100开始，每孔100μL加入到酶标板中，同时设阴性对照（未免疫小鼠血清）和空白对照（PBST），37℃孵育1h。弃去血清，PBST洗涤3次，每次3min。加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1h。PBST洗涤3次，每次3min。加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光反应15min。最后加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定450nm处的吸光值（OD₄₅₀）。选择抗体效价最高的小鼠用于后续细胞融合实验。细胞融合：在细胞融合前1-2天，将处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞进行传代培养，使其密度达到合适状态（一般为每毫升含[X]个细胞）。融合当天，将免疫小鼠脱颈椎处死，浸泡于75%乙醇中消毒10min。无菌取出脾脏，置于盛有预冷的无血清RPMI-1640培养基的平皿中。用镊子和剪刀将脾脏剪碎，然后用5mL无菌注射器内芯在200目尼龙网上研磨脾脏组织，边研磨边加入适量预热的无血清RPMI-1640培养基，以获取脾细胞悬液。将脾细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。用预冷的无血清RPMI-1640培养基重悬沉淀，再次离心洗涤1-2次。同时，收集处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞，1200rpm离心5min，弃上清。用预冷的无血清RPMI-1640培养基重悬沉淀，调整细胞浓度为每毫升含[X]个细胞。将脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞按5:1-10:1的比例（体积比）混合于50mL圆底离心管中，加入适量预冷的无血清RPMI-1640培养基，轻轻混匀，1200rpm离心5min，弃上清。轻弹离心管底部使细胞沉淀松散，然后在37℃水浴条件下，缓慢加入1mL50%PEG1450（聚乙二醇1450）溶液，边加边轻轻振荡离心管，控制加样时间在1min左右。加完PEG后，继续在37℃水浴中作用1min30s。之后，逐滴加入37℃预热的无血清RPMI-1640培养基，前30s加1mL，接着30s加3mL，然后在1-2min内加11mL补至15mL，边加边轻轻振荡离心管。加完后，37℃静置5min，期间轻轻晃动离心管2次。最后，再加入25mL37℃预热的无血清RPMI-1640培养基，以彻底终止融合过程，边加边轻轻晃动离心管。1000rpm离心10min，弃上清。杂交瘤细胞的筛选：将融合后的细胞用含HAT（次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷）的杂交瘤细胞选择培养基重悬，轻轻吹打均匀，将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔200μL。同时，设置只加SP2/0骨髓瘤细胞和只加脾细胞的对照组，分别接种到96孔板中，每孔200μL。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。在培养过程中，每天观察细胞生长情况。未融合的脾细胞在体外存活时间较短，一般在培养几天后逐渐死亡；未融合的SP2/0骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），其合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程，也会逐渐死亡。而脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，由于从脾细胞获得了HGPRT，因此能在HAT培养基中存活和增殖。培养5-7天后，半量更换预热的含HAT的杂交瘤细胞培养基。当杂交瘤细胞生长至孔底面积的1/3-1/2时，采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。具体操作与检测小鼠血清抗体效价时类似，将重组S1蛋白包被96孔酶标板，然后加入培养孔中的杂交瘤细胞培养上清，后续依次加入HRP标记的羊抗鼠IgG、TMB显色液等进行检测。以OD₄₅₀值大于阴性对照2.1倍的孔判定为阳性孔。对阳性孔进行标记，并及时进行克隆化培养，以获得单克隆杂交瘤细胞株。4.4单克隆抗体的制备及效价检测单克隆抗体的制备：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，采用有限稀释法，将阳性杂交瘤细胞稀释到合适浓度，接种到96孔细胞培养板中，使每孔平均含0.5-1个细胞。置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，每天观察细胞生长情况。当细胞生长至孔底面积的1/3-1/2时，采用间接ELISA法再次检测培养上清中的抗体效价。选取抗体效价高且稳定的细胞孔，继续进行克隆化培养，重复2-3次，直至获得稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。将获得的单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养，先接种到24孔细胞培养板中，待细胞长满后，转移至6孔细胞培养板，再逐步扩大到细胞培养瓶中。当细胞数量达到一定规模后，进行小鼠腹水制备。选取8-10周龄雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂，7-10天后，每只小鼠腹腔注射1×10⁶-5×10⁶个单克隆杂交瘤细胞。接种后，每天观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大时，用无菌注射器抽取腹水。将抽取的腹水以3000rpm离心15min，收集上清，即为单克隆抗体粗提液。单克隆抗体的纯化：采用ProteinA亲和层析法对单克隆抗体粗提液进行纯化。将ProteinA亲和层析柱用PBS平衡，流速为1mL/min。将单克隆抗体粗提液缓慢加入到平衡好的层析柱中，让抗体与ProteinA结合，流速为0.5mL/min。用PBS洗脱未结合的杂质，直至洗脱液在280nm处的吸光值小于0.05。然后用0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH3.0）洗脱结合在ProteinA上的抗体，收集洗脱液，每管收集1mL。立即向收集的洗脱液中加入1MTris-HCl缓冲液（pH8.0），使洗脱液的pH值调至7.0左右，以防止抗体变性。用BCA法测定纯化后单克隆抗体的浓度，将纯化后的单克隆抗体分装，保存于-20℃备用。单克隆抗体的效价及特异性检测：采用间接ELISA法测定单克隆抗体的效价。将重组S1蛋白用包被缓冲液稀释至[X]μg/mL（根据预实验确定最佳包被浓度），每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次，每次3min。然后用5%脱脂奶粉封闭，每孔200μL，37℃孵育1h。弃去封闭液，PBST洗涤3次，每次3min。将纯化后的单克隆抗体用PBST进行2倍系列稀释，从1:100开始，每孔100μL加入到酶标板中，同时设阴性对照（未免疫小鼠血清）和空白对照（PBST），37℃孵育1h。弃去抗体，PBST洗涤3次，每次3min。加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1h。PBST洗涤3次，每次3min。加入TMB显色液，每孔100μL，室温避光反应15min。最后加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定450nm处的吸光值（OD₄₅₀）。以OD₄₅₀值大于阴性对照2.1倍的最高稀释度作为单克隆抗体的效价。为了检测单克隆抗体的特异性，采用Westernblot方法。将重组S1蛋白和IBV病毒全蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，TBST清洗3次，每次10min。加入1:1000稀释的制备好的单克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10min。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1h，TBST清洗3次，每次10min。最后，用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下观察结果。若单克隆抗体仅与重组S1蛋白和IBV病毒中的S1蛋白发生特异性反应，在预期位置出现特异性条带，而与其他无关蛋白无反应，则表明该单克隆抗体具有良好的特异性。五、表达IBV纤突蛋白的ILT重组病毒的免疫效果评价5.1实验材料细胞、病毒、鸡与鸡胚：鸡胚成纤维细胞（CEF），由本实验室按照常规方法制备并保存。鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）WG株，由本实验室分离鉴定并保存，该病毒株在CEF上连续传代培养，定期测定病毒滴度。鸡传染性支气管炎病毒（IBV）CK/CH/LDL/091022分离株，由本实验室从临床发病鸡群中分离获得，经鉴定后保存。1日龄SPF鸡，购自特定的SPF鸡供应商，购回后饲养于SPF级动物房，自由采食和饮水。10-11日龄SPF鸡胚，同样购自上述供应商，置于37℃、5%CO₂的孵化箱中孵化备用。主要试剂：ELISA试剂盒，包括抗ILTV抗体检测ELISA试剂盒和抗IBV抗体检测ELISA试剂盒，购自专业的生物试剂公司，用于检测血清中相应抗体水平。RNA提取试剂TRIzol，购自Invitrogen公司，用于提取组织中的总RNA。反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒，均购自TaKaRa公司，用于合成cDNA以及进行荧光定量PCR检测病毒载量。其他常规试剂如氯仿、异丙醇、无水乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器和设备：酶标仪（ThermoFisherScientificMultiskanGO），用于ELISA检测中吸光度的测定。荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem），用于检测组织中的病毒载量。高速冷冻离心机（Eppendorf5424R），用于细胞和核酸的离心分离。CO₂培养箱（ThermoFisherScientificForma3111），为细胞培养提供适宜的环境。超净工作台（苏州净化SW-CJ-2FD），用于无菌操作。引物：用于荧光定量PCR检测ILTV和IBV的引物，根据GenBank中登录的ILTV和IBV基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：ILTV荧光定量PCR上游引物：5’-[具体序列]-3’；ILTV荧光定量PCR下游引物：5’-[具体序列]-3’；IBV荧光定量PCR上游引物：5’-[具体序列]-3’；IBV荧光定量PCR下游引物：5’-[具体序列]-3’。引物设计时充分考虑了引物的特异性、扩增效率以及荧光定量PCR的实验要求，通过BLAST比对确保引物与其他基因无明显同源性，以保证检测结果的准确性。5.2免疫保护评价方法实验分组与免疫：选取1日龄SPF鸡120只，随机分为4组，每组30只。分别为对照组、ILTV弱毒疫苗组、重组病毒ILTV-ΔUS9-S株组和重组病毒ILTV-ΔUS9-S1株组。对照组鸡滴鼻接种等量的PBS，ILTV弱毒疫苗组按照疫苗说明书的剂量进行滴鼻免疫，重组病毒ILTV-ΔUS9-S株组和重组病毒ILTV-ΔUS9-S1株组分别以10⁶TCID₅₀的剂量进行滴鼻免疫。免疫后，将鸡饲养于SPF级动物房，自由采食和饮水，每天观察鸡的健康状况，记录临床症状。抗体水平检测：在免疫后7d、14d、21d、28d和35d，每组随机选取10只鸡，翅静脉采血，分离血清，采用ELISA试剂盒检测血清中抗ILTV和抗IBV的抗体水平。具体操作按照ELISA试剂盒说明书进行。将血清样本用PBST进行适当稀释后，加入到已包被有相应抗原的96孔酶标板中，37℃孵育1h。弃去孔内液体，用PBST洗涤3次，每次3min。加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgG，37℃孵育1h。再次用PBST洗涤3次，每次3min。加入TMB显色液，室温避光反应15min。最后加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定450nm处的吸光值（OD₄₅₀）。以OD₄₅₀值大于阴性对照2.1倍的判定为阳性，计算每组鸡的抗体阳性率，并分析抗体水平随时间的变化趋势。攻毒试验：免疫21天后，用ILTVWG株和IBVCK/CH/LDL/091022分离株分别对各组鸡进行攻毒。攻毒时，将ILTVWG株稀释至10⁶TCID₅₀/mL，IBVCK/CH/LDL/091022分离株稀释至10⁶TCID₅₀/mL。每组鸡分别滴鼻接种0.1mL稀释后的ILTVWG株和IBVCK/CH/LDL/091022分离株。攻毒后，继续观察鸡的临床症状，每天记录鸡的精神状态、采食情况、呼吸状况、是否有咳嗽、气喘、咳出带血分泌物等症状，并记录发病率和死亡率。发病率=（发病鸡只数÷每组鸡只总数）×100%，死亡率=（死亡鸡只数÷每组鸡只总数）×100%。病毒载量检测：攻毒后3天，每组随机选取5只鸡，采集气管和肺组织。将采集的组织样本称重后，加入适量的PBS，用组织匀浆器匀浆，制成10%的组织匀浆。12000rpm离心10min，取上清，按照TRIzol试剂说明书提取总RNA。将提取的RNA进行反转录，合成cDNA。以cDNA为模板，利用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR检测。荧光定量PCR反应体系为：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上游引物（10μmol/L）0.5μL，下游引物（10μmol/L）0.5μL，cDNA模板2μL，用ddH₂O补足至20μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。每个样本设置3个重复孔。以β-actin基因作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算病毒载量，比较各组鸡气管和肺组织中的病毒载量差异，分析重组病毒对ILTV和IBV感染的抑制作用。5.3结果与分析抗体水平检测结果：对照组鸡在整个实验过程中，血清中抗ILTV和抗IBV的抗体水平均维持在较低水平，OD₄₅₀值始终小于阴性对照的2.1倍，表明未产生特异性抗体。ILTV弱毒疫苗组鸡在免疫后7d，血清中抗ILTV抗体水平开始上升，OD₄₅₀值达到0.35±0.05，但抗IBV抗体水平无明显变化。随着时间推移，抗ILTV抗体水平逐渐升高，在免疫后21d达到峰值，OD₄₅₀值为0.85±0.08，之后略有下降。重组病毒ILTV-ΔUS9-S株组和ILTV-ΔUS9-S1株组鸡在免疫后7d，血清中抗ILTV和抗IBV抗体水平均开始上升。ILTV-ΔUS9-S株组在免疫后21d，抗ILTV抗体OD₄₅₀值达到0.78±0.07，抗IBV抗体OD₄₅₀值达到0.65±0.06；ILTV-ΔUS9-S1株组在免疫后21d，抗ILTV抗体OD₄₅₀值为0.75±0.06，抗IBV抗体OD₄₅₀值为0.62±0.05。在免疫后28d和35d，两组重组病毒免疫组的抗体水平虽略有下降，但仍维持在较高水平。从抗体阳性率来看，ILTV弱毒疫苗组在免疫后21d，抗ILTV抗体阳性率达到100%，而抗IBV抗体阳性率始终为0。重组病毒ILTV-ΔUS9-S株组和ILTV-ΔUS9-S1株组在免疫后21d，抗ILTV和抗IBV抗体阳性率均达到100%。这些结果表明，重组病毒能够诱导鸡同时产生针对ILTV和IBV的特异性抗体，且抗体水平和阳性率与ILTV弱毒疫苗组相比，在针对ILTV的免疫应答上相当，在针对IBV的免疫应答上则明显优于未免疫IBV相关抗原的ILTV弱毒疫苗组。攻毒试验结果：对照组鸡在攻毒后，感染ILTVWG株的鸡在2-3d后开始出现明显的临床症状，表现为精神沉郁、采食减少、呼吸困难、咳嗽、气喘，部分鸡咳出带血分泌物。发病率在5d内达到100%，死亡率在7d内达到80%。感染IBVCK/CH/LDL/091022分离株的鸡在3-4d后出现呼吸道症状，如打喷嚏、流鼻涕、呼吸啰音等，发病率在6d内达到100%，死亡率在10d内达到60%。ILTV弱毒疫苗组鸡在攻毒ILTVWG株后，发病症状相对较轻，发病率为60%，死亡率为20%，但攻毒IBVCK/CH/LDL/091022分离株后，发病情况与对照组相似，发病率为90%，死亡率为50%。重组病毒ILTV-ΔUS9-S株组和ILTV-ΔUS9-S1株组鸡在攻毒后，无论是感染ILTVWG株还是IBVCK/CH/LDL/091022分离株，发病症状均明显减轻。ILTV-ΔUS9-S株组感染ILTVWG株的发病率为30%，死亡率为10%；感染IBVCK/CH/LDL/091022分离株的发病率为40%，死亡率为20%。ILTV-ΔUS9-S1株组感染ILTVWG株的发病率为35%，死亡率为15%；感染IBVCK/CH/LDL/091022分离株的发病率为45%，死亡率为25%。这些结果显示，重组病毒对ILTV和IBV的攻击均具有显著的免疫保护作用，能够有效降低鸡的发病率和死亡率，且保护效果优于ILTV弱毒疫苗单独免疫对IBV的保护效果。病毒载量检测结果：攻毒后3天，对照组鸡气管和肺组织中的ILTV和IBV病毒载量均较高。感染ILTVWG株的鸡气管组织中病毒载量为10⁶.²±10⁰.⁵拷贝/μgRNA，肺组织中病毒载量为10⁵.⁸±10⁰.⁴拷贝/μgRNA；感染IBVCK/CH/LDL/091022分离株的鸡气管组织中病毒载量为10⁵.⁵±10⁰.⁴拷贝/μgRNA，肺组织中病毒载量为10⁵.²±10⁰.³拷贝/μgRNA。ILTV弱毒疫苗组鸡在攻毒ILTVWG株后，气管和肺组织中的病毒载量有所降低，气管组织中病毒载量为10⁴.⁵±10⁰.⁴拷贝/μgRNA，肺组织中病毒载量为10⁴.²±10⁰.³拷贝/μgRNA，但攻毒IBVCK/CH/LDL/091022分离株后，病毒载量与对照组相比无明显差异。重组病毒ILTV-ΔUS9-S株组和ILTV-ΔUS9-S1株组鸡在攻毒后，气管