《甲壳动物重要病原的微阵列基因芯片检测方法-编制说明》

一、标准制定的必要性

我国人工养殖的甲壳动物有罗氏沼虾、青虾、克氏原螯虾、南美白对虾、澳洲龙虾

（淡水）、中华绒鳌蟹、青蟹和梭子蟹等。目前甲壳动物的人工养殖已经占总面积的15%左右，

而且逐年增加。朱是目前世界上养殖产量最高的虾类之一。如南美白对虾头小身大、出肉率

高、口味鲜美，集适应性广、生长迅速、抗病力强等优点于一身。南美白对虾有半咸水池塘

养殖、淡水池塘养殖、稻田养殖、高位池养殖、大棚养殖等。2020年由于病害南白对虾损失

约60亿元。其中白斑综合症在我国沿海地区较为流行，危害性较大，主要会危害幼体、成虾。

对虾感染后死亡率较高，一般虾池发病后，全池虾最多不足一周可死亡。环境温度在20-28℃

时，极易爆发白斑综合症。典型的病虾可在其头胸甲上发现针尖般的白色斑点，肉眼可见。（2）

肠炎病：每年七八月份，池水温度在25-32℃之间，适宜南美白对虾的快速生长发育。养殖过

程中，随着对虾采食量逐渐增加，水体中会堆积大量的残饵粪便，易滋生病原微生物，继而

引发肠炎病。（3）甲壳溃疡病主要发生在越冬的中后期，对越冬亲虾等危害较大。桃拉综合

症：感染此病后的死亡率极高，累计超过95%，感染后存活的个体也会终身带有病毒。该病的

传播途径主要为水平传播，大部分养殖池，在水池进水换水后出现感染。染病后，病虾的摄

食量下降甚至不吃食，并在水面慢游，严重时外壳变得柔软，无法进食，尾足、尾节、腹肢

会有红色色素沉着，大规格病虾步足甚至会出现溃疡、蛀断等现象。还有传染性皮下和造血

组织坏死病（IHHN）、十足目虹彩病毒病（DIV1）和急性肝胰腺坏死病（AHPND）、对虾病毒性

偷死病、对虾肠孢虫病、桃拉病毒感染导致的红体病和对虾虹彩病毒。南美白对虾的白斑综

合征病毒病是南美白对虾的重要疾病之一，该病毒也能垂直传播，近几年因为养殖南美白对

虾使用带毒率高的“土苗”和“二代苗”，使养殖成功率下降，慢性发病后即使不死亡，之后

再继续养殖生长速度也慢，用不带病毒的国外进口亲虾（SPF亲虾）繁育的“一代苗”因为不

带病毒，不仅生长速度快，养殖成功率也明显提高，近两年“一代苗”越来越受到各地对虾

养殖者的青睐。在南美白对虾养殖过程中，水源中的野虾、野蟹是白斑征病毒病的重要传染

源。目前多数养殖南美白对虾发病后无法治疗的情况下都是直接排塘，连虾带水直接排到入

海的沟渠，因此近年近海捕捞南美白对虾的渔获量逐年增多，近海各种虾蟹等甲壳动物携带

白斑征病毒病的机率也增高，携带病原的野蟹随意在养虾池塘爬来爬去，造成疾病传播；因

此在离海较近或离通海注水沟渠较近的南美白对虾的养殖池塘白斑征病毒病的发病率明显比

远离的池塘高。如果水源处理不好，带入野虾，养殖期间南美白对虾的病毒发病率也会增加，

在广西沿海的光坡、竹林等地区池塘养殖南美白对虾白斑征病毒病的发病率远远高于其它地

1

区。这些地区养虾池塘的病毒病防控重点就是防水源中野生虾蟹的携带病毒传染，水源需要

彻底处理之后再使用，临近注水沟渠的池塘因为有野生小螃蟹爬入的风险，需要设置防蟹薄

膜围墙。我国部分沿海地区如福建漳州、江苏赣榆、河北黄骅等地利用潮汐自然进排水，即

采用大排大灌的模式养殖日本对虾和梭子蟹，由于每次涨潮进水时野生虾蟹等甲壳动物大量

进入池塘，造成养殖对虾、梭子蟹病毒病泛滥，养殖成功率越来越低，这种模式也已经开始

因此被逐渐淘汰。通过原位杂交在虾和蟹的生殖组织中观察到了WSSVDNA‚因此认为垂直传

播可能存在。但它们只在生殖组织的结缔组织中发现有WSSVDNA‚它能否感染卵母细胞或通

过病毒的基因传递给生发细胞仍不清楚需要进一步研究。河蟹“颤抖病”是一种广泛流行、

危害较大的病毒性疾病。该病流行季节长‚发病率高‚主要危害2龄幼蟹和成蟹。水质污染、

河蟹种质混杂、放养密度过大等都极易引发河蟹“颤抖病”这说明该病毒具有水平传播的可

能。蓝蟹疱疹病毒（HLV）与疱疹病毒相似‚在电镜下可看到病毒粒子为20面体具有圆形环

状物和双层外壳直径达150nm存在于病蟹血细胞核内‚传播方法尚不清楚‚估计是健康的蟹

吞食了病蟹肉或含有病毒的水而感染‚有水平传播的可能。

综上所述，对甲壳动物10种病毒的微阵列基因芯片检测中的术语、定义、范围和方法进

行科学确定，对病毒的微阵列基因芯片操作规程进行统一规范，服务于甲壳类的人工养殖业

是十分有必要的。

二、标准编制原则及依据

1.按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结

构和起草规则》要求进行编写。

2.参照相关法律、法规和规定，在编制过程中着重考虑了科学性、适用

性和可操作性。

三、项目背景及工作情况

3.1任务来源

按照2019年，农业农村部等十部委出台的《关于加快推进水产养殖业绿色

发展的若干意见》精神，快速推进我国水产养殖行业绿色发展，健全水生动物疫

病防控体系，加强监测预警和风险评估，提高重大疫病防控和应急处置能力。

3.2协作单位

根据《中国国际科技促进会标准化工作委员会团体标准管理办法》的有关规

定，经中国国际科技促进会标准化工作委员会及相关专家技术审核，批准《甲壳

动物重要病毒的微阵列基因芯片检测方法》团体标准制定计划，计划编号为：

T/CIXXX-2022。本标准由省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重

2

点实验室提出，中国国际科技促进会归口。

根据计划要求，本标准完成时限为5个月。

（二）标准起草单位

本标准的编制工作由省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重

点实验室牵头，负责标准文档起草及相关文件的编制等工作。中国水科院黄海水

产研究所，浙江正合谷生物科技有限公司，象山蓝尚海洋科技有限公司，青岛南

凌生物科技有限公司，山东北游生物科技有限公司，海南新葵生物科技有限那公

司等6家单位作为参与单位共同完成，负责标准中重要技术点的研究和建议，并

参与标准内容的讨论。牵头单位与参与单位为此专门成立《甲壳动物重要病毒的

微阵列基因芯片检测方法》团体标准起草小组，负责本标准的各项工作。

（三）编写人员与分工

编写人员主要有：苏秀榕、王印庚，周君、韩姣姣、叶欢、陈炯、李成华、

王忠华

姓名工作单位职称/职务承担任务

省部共建农产品质

量安全危害因子与整个检测技术的方案设计、

苏秀榕教授

风险防控国家重点技术的应用，起草标准

实验室

白斑病综合征病毒和虹彩

中国水科院黄海水产

王印庚研究员

研究所病毒基因芯片检测技术及

应用研究

省部共建农产品质传染性皮下和造血组织坏

量安全危害因子与死病毒，偷死野田村病毒基

周君副教授

风险防控国家重点因芯片检测技术及应用研

实验室究

黄头病和罗氏沼虾诺达病

韩姣姣宁波大学海洋学院助研毒基因芯片检测技术及应

用研究

浙江正合谷生物科标准在人工养殖斑节对虾

钱鹏宇工程师

技有限公司检测中应用

省部共建农产品质传染性肌肉坏死病毒和

陈炯量安全危害因子与研究员桃拉病毒基因芯片检测技

风险防控国家重点术及应用研究

3

实验室

省部共建农产品质

量安全危害因子与虾肝肠胞虫和副溶血弧菌

李成华研究员

风险防控国家重点的基因芯片检测技术研究

实验室

象山蓝尚海洋科技标准在凡纳滨对虾苗种检

伊祥华总经理

有限公司测

山东北游生物科技标准在人工养殖小龙虾养

王中华董事长

有限公司殖中的应用

四、标准编制原则和主要内容

（一）编制原则

本标准严格按照GB/T1.1-2020的要求和规定编写编制。

协调性原则。本标准旨在规范白斑综合征病毒（Whitespotsyndromevirus，

WSSV）、传染性皮下和造血组织坏死病毒（Infectioushypodermaland

hematopoieticnecrosisvirus，IHHNV）、十足目虹彩病毒（Decapodiridescentvirus

1）、传染性肌坏死病毒（infectiousmyonecrosisvirus，IMNV）桃拉病毒（Taura

syndromevirus，TSV）、黄头病毒（yellowheadvirus,YHV）、罗氏沼虾诺大病

毒（MacrobrachiumrosenbergiinodavirusMrNV)、偷死野田村病毒（Covert

mortalitynodavirus,CMNV）、虾肝肠胞虫（EnterocytozoonhepatopenaeiEHP）

和副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）引起的急性肝胰腺坏死病（Acute

hepatopancreaticnecrosisdiseaseAHPND）等甲壳动物重要病毒的微阵列基因芯

片检测方法的术语定义，科学确定基因芯片检测方法等各方面指标。在术语上严

格按照现行标准相GB/T27990-2011生物芯片基本术语相一致。

必要性原则。标准编写过程中坚持必要性原则，仅对微阵列基因芯片进行了

术语规范和定义。

适用性原则。标准编写过程中坚持适用性原则，从服务育种、种植和加工应

用利益出发，充分考虑行业发展需求，保证标准内容方便被其他标准或文件引用

且可操作性强。

科学性原则。在标准制定过程中充分调研与低植酸小麦相关的研究、检测和

生产企业，归纳总结共性指标和因素，综合全面考虑，并广泛吸收专家意见，逐

4

一对标准各部分内容进行科学规范。

（二）主要内容

本标准主要内容如下：

1范围

本标准规定了人工养殖甲壳动物的10种重要病原的微阵列基因芯片检测技

术，该方法适于各个甲壳动物的各生活时期的样品中带病原情况下的定性检测，

也适于人工养殖病害的流行性学调查、诊断、检疫和监测工作。

2规范性引用文件

文中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，

仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改本）均适用于本标准。

GB/T27990-2011生物芯片基本术语标准

SC/T7011.1—2007水生动物疾病术语与命名规则第1部分：水生动物疾病术

语

SC/T7013—2008水生动物产地检疫采样技术规范

GB/T28630.2-2012白斑综合征(WSD)诊断规程.第2部分：套式PCR检测法

GB/T25878-2010对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测PCR

法

SC/T7228—2019传染性肌坏死病诊断规程

SC/T7233—2020急性肝胰腺坏死病诊断规程

SC/T7237—2020虾虹彩病毒病诊断规程

SN/T3583—2013白尾病检疫技术规范

SN/T1151.3—2013斑节对虾杆状病毒病（MBV）检疫技术规范

SC/T7238—2020对虾偷死野田村病毒（CMNV）检测方法

SC/T7204.3—2007对虾桃拉综合征诊断规程第3部分：RT-PCR检测法

SC/T7236—2020对虾黄头病诊断规程

SN/T4348—2015螯虾瘟检疫技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1荧光标记技术（Fluorescencelabeling）

将荧光基团（荧光素）共价连接到蛋白、核酸等分子上的过程。常用的荧光

素有异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、四氯荧光素、罗丹明类染料、菁染料、香豆

素类、吖啶类、芘类等。

3.2非荧光标记技术（Nonfluorescentlabelingtechnology）

5

将能直接产生颜色反应的物质共价连接到蛋白、核酸等分子上的过程。常用

的非荧光标记物有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、过氧化物酶、纳米金等。

3.3DNA分子杂交（DNAhybridization）

互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子

DNA分子的过程称为杂交。

4缩略语（Abbreviation）

WSSV：对白斑综合征病毒（Whitespotsyndromevirus）。

IHHNV：传染性皮下和造血组织坏死病毒（Infectioushypodermaland

hematopoieticnecrosisvirus）。

IDIV：虾虹彩病毒（InfectiouswithDecapodiridescentvirusI）。

IMNV：传染性肌坏死病毒：（infectiousmyonecrosisvirus）。

TSV：桃拉病毒（Taurasyndromevirus）。

YHV：黄头病毒（yellowheadvirus,）。

MrNV：罗氏沼虾诺大病毒（Macrobrachiumrosenbergiinodavirus)。

CMNV：对虾偷死野田村病毒（Covertmortalitynodavirus,）。

EHP：虾肝肠胞虫（Enterocytozoonhepatopenaei）。

AHPND：急性肝胰腺坏死病（Acutehepatopancreaticnecrosisdisease），是由

于副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）引起的。

NBT/BICP：氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐对甲苯胺（Nitro-blue

tetrazoliumchloride/5-bromo-4-chloro-3-indolyphosphatep-toluidine）。

5原理

从带有病毒的动物样品中提取病毒基因组DNA或者RNA（mRNA需要反

转录成cDNA），利用带有荧光/非荧光物质标记的特异性引物进行PCR扩增。待

检的PCR产物，与微阵列基因芯片上的探针进行杂交，清洗后荧光标记的微阵

列基因芯片用激光扫描仪扫描和结果判定。非荧光标记微阵列基因芯片杂交后清

洗、与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素结合，NBT/BICP显色，用生物芯片检测仪

扫描和判定。

6仪器设备

PCR扩增仪

恒温金属浴（30-100℃）

离心机（转速≤16000）

干烘箱

高压灭菌锅

6

漩涡振荡器

电泳仪和水平电泳槽）

凝胶成像分析系统

激光扫描仪（用于荧光标记基因芯片）

生物芯片检测仪（用于非荧光标记基因芯片）

杂交盒（4，6，10矩阵）

湿盒

7主要试剂和材料

以下试剂如非特殊说明，均为分析纯。实验用水符合GB/T6682的要求。所

有试剂均用无RNA酶的容器分装。

7.1DNA和RNA提取试剂

细菌、寄生虫和病毒DNA和RNA提取用试剂盒均使用相对应的按照操作

说明进行z。

7.2DNA检测试剂

琼脂糖、Goldred核酸染料、蓝色Taq酶Mix、DNA分子量标准、TAE电泳

缓冲液均为商品。

7.3PCR扩增试剂

荧光标记试剂管：Taq酶Mix、dNTP、扩增缓冲液、6’端标记Hex的引物。

非荧光标记试剂管：Taq酶Mix、dNTP、扩增缓冲液、6’端标记Biotin的引

物。具体配方见附录B

7.4杂交试剂

杂交溶液、PC-Hex、PC-Biotin的配方见附录B

7.5显色试剂

碱性磷酸酶抗体、抗体稀释液、NBT/BCIP碱性磷酸酶显色液均为市售商品。

7.6无菌ddH2O

双蒸水（ddH2O）121℃±2℃，高压灭菌20min，冷却常温后无菌分装。

7.7基因芯片

引物、探针、阳性、阴性DNA序列见附录A

8取样

8.1凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）、罗氏虾（Macrobrachiumrosenbergii）、

克氏原螯虾（Procambarusclarkii）、斑节对虾（Penaeusmonodon）以及养殖蟹

等易感宿主。

8.2样品的运输与保存

按照GB/T18088采样，GB/T28730样品至少应在4℃以上的环境中运输，实

7

验室接收样品后应该尽快检测，如果暂时不能检测，应该将样品置于-80℃冰箱

中。

9检测

9.1DNA和RNA模板制备按照试剂盒说明书提取。提取的RNA需要按照试

剂盒说明反转成cDNA备用。

9.2PCR扩增

按照表A-4配制PCR扩增体系，模板推荐量为50-100ng。扩增条件为95℃

预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸40s，40个循环；72℃

延伸10min。

9.3杂交

9.3.1解链：在50-55°C将杂交液融化并混匀（荧光标记微阵列基因芯片每3mL

杂交液加1µL10µmoL的PC-Hex，同样非荧光标记微阵列基因芯片3mL杂交液

加入1μLPC-Biotin）混匀备用。），PCR产物和2×杂交液按照2：1（V:V）混合，

98°C变性5min，放置冰上约3-5min，离心将管壁液体甩下，备用。

9.3.2杂交：将芯片带标签一面朝上，完全插入多功能杂交盒的插槽中。用移液

器通过加样孔缓慢注入变性后的杂交混合液，将杂交盒放入湿盒中，61°C，1h

（杂交盒的体积：10矩阵的35µL,6矩阵60µL,4矩阵90µL）。

9.4芯片清洗

杂交结束后，从湿盒中取出杂交盒、抽出芯片，用水冲洗芯片表面50-60s，

离心甩干。荧光标记基因芯片系列试剂盒在杂交结束后，按8.5步骤进行。非荧

光标记基因芯片系列试剂盒在杂交结束后，按8.6步骤进行。

9.5荧光标记芯片扫描及结果判读

9.5.1扫描

将干燥后的芯片插入激光扫描仪的插槽中，按照仪器使用说明书进行芯片扫

描仪。

9.5.2结果判定

根据扫描仪获取的探针杂交点信号值判断检测结果：

有效检测结果：阳性质控点平均信号值≥背景信号平均值+4×标准差，且阴

性性质控点信号值≤背景信号平均值+4×标准差。

无效检测结果：阳性质控点平均信号值≤背景信号平均值+4×标准差，或阴

性性质控点信号值≥背景信号平均值+4×标准差。

阳性结果：检测探针信号值≥背景信号平均值+4×标准差；同时满足检测探

针信号值≥阴性对照信号平均值+2×标准差｡

阴性结果：检测探针信号值＜背景信号平均值+4×标准差；同时满足，信号

8

值＜阴性对照信号平均值+2×标准差。

9.6非荧光标记芯片扫描及结果判读

9.6.1抗体孵育

杂交结束后，从杂交盒取出芯片，冲洗干净后再装入杂交盒内，将封闭液从

杂交盒加样孔加入，使其覆盖杂交区域，37°C静置30min。

9.6.2显色

吸出抗体液，加入纯净水并吸出。加显色液覆盖杂交区域，显色1-3min，

待杂交区域出现浅紫立即吸出显色液，并用水洗，重新加入显色液，待再出现紫

色，则将芯片与杂交盒分离，冲洗后离心甩干，使用便携式生物芯片检测仪或肉

眼观察、识别和判断。

9.6.3非荧光标记芯片分析及结果判读

使用生物芯片检测仪进行扫描分析，结果由软件自动给出。根据检测仪获取

的探针杂交点信号值，经软件分析后进行结果判断。

有效检测结果：阳性质控点平均信号值≥背景信号平均值+2×标准差，且阴

性性质控点信号值≤四周背景信号平均值+4×标准差。

无效检测结果：阳性质控点平均信号值≤背景信号平均值+2×标准差，或阴

性性质控点信号值≥四周背景信号平均值+4×标准差。

阳性结果：检测探针信号值≥背景信号平均值+2×标准差；同时满足检测探

针信号值≥阴性对照信号平均值+2×标准差｡

阴性结果：检测探针信号值＜背景信号平均值+2×标准差；同时满足，信号

值＜阴性对照信号平均值+2×标准差。

结果报告：若芯片检测结果无效，则需重复进行疫磁检测；若检测结果有效，

结果报告显示相应的病原微生物阳性或阴性。

五、主要试验（或验证）的分析、综合报告，技术经济论证，预期的经济效果

（一）人工养殖甲壳动物重要病毒病的研究现状

世界世界动物卫生组织（OIE）于2004年公布了水生动物疫病名录，并且每

年更新1次。现行“OIE疫病名录”共收录水生动物疫病29种。包括鱼类疫病

10种，甲壳类疫病9种，贝类疫病7种，两栖类动物疫病3种。对虾白斑综合

征、传染性皮下和造血组织坏死病、急性肝胰腺坏死病是OIE的疫病物种。也属

于水产养殖严控的疾病。目前有关对虾病害诊断的行业标准19件，但都是单一

病原诊断，未见同时诊断的方法。我们国家对水产病害的预防工作非常重视，每

年农业农村部都组织相关水生动物疫病专家团队，针对主要水生动物疫病开展

了系统的研究，将多项防控技术成果示范应用，推动了水产业绿色发展。“全国

9

水生动物疾病远程辅助诊断服务网”实现了线上与专家进行“面对面”沟通交

流，自助诊断。2020年农业农村部继续组织开展了水生动物防疫系统实验室检

测能力验证。对鲤春病毒血症、锦鲤疱疹病毒病、鲤浮肿病、草鱼出血病、鲫造

血器官坏死病、传染性造血器官坏死病、罗非鱼湖病毒病、病毒性神经坏死病、

白斑综合征、急性肝胰腺坏死病、虾虹彩病毒病、虾肝肠胞虫病12种疫病病原

实验室的检测能力进行验证。2020年，第四届水生动物防疫标准化技术工作组

完成了《水生动物RNA病毒核酸检测参考物质质量控制规范假病毒》《水生动物

病原DNA检测参考物质制备和质量控制规范质粒》2项国家标准，以及《草鱼

出血病监测技术规范》《罗非鱼湖病毒监测技术规范》《流行性造血器官坏死病诊

断规程》3项水产行业标准的审定；发布了《鱼类免疫接种技术规程》《对虾体

内的病毒扩增和保存方法》《虾肝肠胞虫病诊断规程》等13项行业标准。目前

全国现行有效的水生动物防疫相关标准共有274个。其中：国家标准31个，行

业标准167个（含农业农村部水产行业标准100个、出入境检验检疫行业标准

67个），地方标准76个。

（二）10种病原的检测方法

借助各种新技术新方法，对水产动物病毒研究也更加深入。如抗病鱼类品种

分子模块筛选、量子点对草鱼呼肠孤病毒入侵单粒示踪,利用基因敲除或RNA

干扰技术，研究水产无脊椎动物的抗病毒免疫机制，甚至还从更大尺度上探讨，

使人们能以更开阔的视野探寻水产动物病毒学研究的发展趋势。由此预测：①基

于对病原本质特征的认识，可以研发高效、精准、实用的水产动物病毒病检测诊

断技术方法，构建预警预报体系；②由不当用药治疗向疾病预防为主的方向转

变，防患于未然；③强化水产动物抗病毒免疫机制研究，加速研发安全高效的

免疫综合防控新技术，包括疫苗免疫与生态防控并举；④提升公众参与意识，

并采纳高新技术，消除环境中有害因素，阻断、避免或减少病毒病的传播；⑤测

评养殖水产动物健康阈值(controlthreshold)及遗传特性，筛选和运用抗病分

子标记，从源头做起，构建智能生态健康水产养殖体系，加速水产养殖方式的变

革。预期这些水产动物抗病毒病健康养殖的路径，将会成为中国水产动物病毒学

发展的必然趋势。在已初步形成富有特色的中国水产病毒病研究主题、水产病毒

病诊断预警与综合防控体系，讲述中国水产养殖成功精彩故事的基础上，研究者

们正积极致力于抗病良种选育，注重过程预警预报与病害控制，坚持健康养殖及

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保水渔业研究，以期为中国乃至世界水产养殖的健康发展奠定基础。GB/T

28630.2-2012白斑综合征(WSD)诊断规程.第