DB37T 6034.2-2026 禽疫病诊断技术 第2部分：鸡星状病毒

65.020.3037B41山东省地方标准DB37/T6034.2—2026禽疫病诊断技术第2部分：鸡星状病毒Diagnostictechniquesforavianinfectiousdiseases—Part2:Chickenastrovirus2026-05-发布2026--实施山东省市场监督管理局ꢀꢀ发布DB37/T6034.22026前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是DB37/T6034《禽疫病诊断技术》的第2部分。DB37/T6034已经发布了以下部分：——第2部分：鸡星状病毒。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。技术中心。本文件主要起草人：王建琳、郝小静、尹燕博、潘青、王永海、侯冉冉、刘锡武、张灿、衣服德、徐守振、刘爱晶、李方正、张倩、刘开东。IDB37/T6034.22026引言需求，制定了《禽疫病诊断技术》系列标准，拟由以下六个部分组成。——第1部分：家禽圆圈病毒。目的在于开展家禽圆圈病毒的检测，指导家禽圆圈病毒感染的诊——第2部分：鸡星状病毒。目的在于开展鸡星状病毒的检测，指导鸡星状病毒感染的诊断。——第3部分：鸽毛滴虫病。目的在于开展禽毛滴虫的检测，指导鸽子毛滴虫病的诊断。——第4部分：禽波氏杆菌。目的在于开展家禽波氏杆菌的分离、鉴定和检测，指导禽波氏杆菌感染的诊断。——第5部分：鸭乙型肝炎病毒。目的在于开展鸭乙型肝炎病毒的检测，指导鸭乙型肝炎的诊断。——第6部分：水禽呼肠孤病毒。目的在于开展水禽呼肠孤病毒的检测，指导水禽呼肠孤病毒感染的诊断。染后导致鸡胚孵化率降低，给养鸡业造成了严重的经济损失。鸡星状病毒感染在我省鸡群中普遍存在。的开展，促进我省养鸡业的持续健康发展。IIDB37/T6034.22026禽疫病诊断技术第2部分：鸡星状病毒12本文件规定了鸡星状病毒感染的临床诊断、实验室诊断和综合判定。本文件适用于鸡星状病毒感染的诊断。规范性引用文件文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范34术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。临床诊断4.1流行病学主要通过粪-口途径水平传播感染雏鸡，也可垂直传播。鸡星状病毒主要感染肉鸡，尤其是2周～4周龄肉鸡，在蛋鸡、种鸡群中也可广泛传播。此外，该病毒也可在火鸡、珍珠鸡等其他禽群中传播。4.2临床症状育迟滞综合征。4.3病理变化4.3.1剖检病变尿酸盐，严重者心脏、肝脏表面和肾脏有尿酸盐沉积。4.3.2组织学病变尿酸盐沉积，近曲小管上皮细胞变性、坏死。4.4结果判定1DB37/T6034.22026符合4.1至4.3特征，可判定为鸡星状病毒感染疑似病例，应进行实验室确诊。5实验室诊断实验室生物安全要求按照GB19489规定执行。5.1RT-PCR5.1.1试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯，所用材料均无RNA酶。5.1.1.1水，GB/T6682，一级。5.1.1.2Trizol裂解液。5.1.1.3三氯甲烷。5.1.1.4异丙醇。5.1.1.575％乙醇。5.1.1.6RT-PCR一步法试剂盒。5.1.1.7一步法RT-PCR缓冲液。5.1.1.8无RNA酶水。5.1.1.9DNA分子量标准（分子大小范围100bp～2ꢁ000bp）。5.1.1.10PBS缓冲液：配制方法按照附录A中A.1。5.1.1.11Tris-乙酸电泳缓冲液：配制方法按照A.2。5.1.1.121％琼脂糖凝胶：配制方法按照A.3。5.1.1.13RT-PCR引物：见附录B中B.1。5.1.1.14阳性对照：鸡星状病毒核酸样本。5.1.1.15阴性对照：未感染鸡星状病毒的鸡组织，阴性尿囊液或正常鸡源细胞。5.1.2仪器设备5.1.2.1分析天平：精度为0.01ꢁg。5.1.2.2PCR基因扩增仪。5.1.2.3核酸电泳仪。5.1.2.4高速冷冻离心机：离心力≥12ꢁ000ꢁg。5.1.2.5核酸电泳仪。5.1.2.6凝胶成像分析系统。5.1.2.7生物安全柜。5.1.2.8高通量组织研磨仪。5.1.3样品的采集、保存和运输5.1.3.15.1.3.1.1棉拭子ꢀcm～2ꢀꢀ于带有冰袋的样品运输箱内，送至实验室，6ꢀ000ꢀg离心5min，取上清液待检。2DB37/T6034.220265.1.3.1.2取5ꢀcm～10ꢀcm肠道组织或2ꢀg～5ꢀg肝脏，加入5ꢀmL～10ꢀꢀPBS缓冲液，使用高通量组织研磨仪研磨匀浆，制成组织悬液，将组织悬液置于10ꢀmL离心管内，封口，置于带有冰袋的样品运输箱内，送至实验室，反复冻融2次～3次，6000ꢀg离心5ꢀmin，取上清液待检。5.1.3.2保存和运输样品保存和运输按照NY/T541执行。5.1.4试验步骤5.1.4.1RNA5.1.4.1.1取被检样品上清液200ꢀ至1.5ꢀmL的离心管中，再加入700ꢀμLꢀTrizol裂解液，混匀静置5ꢀmin。5.1.4.1.2140ꢀμL氯仿，混匀静置ꢀmin，于4ꢀꢀ000ꢀgꢀmin。5.1.4.1.3吸取5.1.4.1.2中上层水相500ꢀ至1.5ꢀmL的离心管中之后加入500ꢀμL的异丙醇。轻轻翻转混匀，于-20℃条件下沉淀15min，4ꢀ℃以ꢀ000gꢀmin，弃去上清。5.1.4.1.4ꢀꢀꢀ7ꢀ500ꢀgꢀꢀ体，将离心管在冰上放置7ꢀmin，晾干。5.1.4.1.5ꢀμL灭菌无RNARNAꢀ℃冰箱冻存。5.1.4.1.6RT-PCR一步法试剂盒提取病毒RNA，按说明书操作。5.1.4.1.7同样的方法提取设立的鸡星状病毒阳性和阴性组织样品的RNA。5.1.4.2ꢀꢀꢀꢀꢀ5ꢀꢀꢀ30ꢀ℃ꢀs，72ꢀꢀ1ꢀmin，35个循环；72℃ꢀꢀmin。5.1.4.3扩增产物电泳分子量标准、阴性对照、阳性对照。电压80ꢀV～100ꢀV或电流40ꢀmA～50ꢀmA，电泳30ꢀmin。结束后，由凝胶成像系统观察并拍照记录。5.1.5结果判定5.1.5.1试验成立条件阳性对照品出现362图见附录D中D.1。5.1.5.2判定标准待检样品扩增产物电泳出现362ꢀ品无扩增条带或扩增条带大小与目标条带不一致，判为阴性，表明样品中无鸡星状病毒核酸。5.2RT-PCR3DB37/T6034.220265.2.1试剂或材料5.2.1.1多重RT-PCR引物：鸡星状病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽肾炎病毒RT-PCR检测引物，见B中B.2。5.2.1.2阳性对照：鸡星状病毒、禽肾炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒核酸样本。5.2.1.3阴性对照：未感染鸡星状病毒、禽肾炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒的鸡组织，阴性尿囊液或正常鸡源细胞。其余同5.1.1。5.2.2仪器设备同5.1.2。5.2.3样品的采集、保存和运输同5.1.3。5.2.4试验步骤5.2.4.1RNA同5.1.4.1。5.2.4.2ꢀ℃30ꢀꢀꢀ5ꢀꢀꢀ30ꢀꢀ℃ꢀꢀꢀꢀ1ꢀminꢀꢀꢀꢀꢀmin。5.2.4.3扩增产物电泳同5.1.4.3。5.2.5结果判定5.2.5.1试验成立条件阳性对照品分别出现1ꢀ577ꢀꢀꢀ病毒）扩增条带，同时阴性对照品无扩增条带，证明试验条件成立，扩增产物对照图见附录D中D.2。5.2.5.2判定标准待检样品扩增产物电泳出现362ꢀꢀ577ꢀ品中无鸡星状病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽肾炎病毒核酸。6综合判定6.1鸡群临床症状与第4章中所描述相符，且第5章中鸡星状病毒结果呈阳性，则可判定为鸡星状病毒感染。4DB37/T6034.220266.2病鸡剖检变化与4.3.1RT-PCR与鸡传染性支气管炎和禽肾炎病毒感染进行鉴别诊断，且第5章中鸡星状病毒阳性，则可判定为鸡星状病毒感染。6.3鸡群未出现第4章中所描述特征，而第5章中鸡星状病毒结果呈阳性，则可判定为鸡星状病毒无症状感染。5DB37/T6034.22026附录A（规范性）溶液的配制A.1PBS缓冲液（磷酸盐缓冲溶液）称取NaCl8.0ꢀꢀ0.2PO0.2ꢀHPO12HOꢀ2.83ꢀꢀ00024242℃高压蒸汽灭菌15ꢀmin，4ꢀ℃冰箱保存备用。A.2Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）ꢀꢀꢀ（pH8.0）100.0ꢀmL，加水至1ꢀ000mL。临用现配至1×工作浓度。A.3称取1ꢀmLꢀꢀ℃～ꢀꢀmg/mL～10ꢀ混匀，倒入插好梳子的电泳板上，凝固后取下梳子，备用。6DB37/T6034.22026附录B（资料性）引物的设计B.1鸡星状病毒特异性检测引物序列ꢀbp。使用时用无RNA酶水稀释至10μM。B.2鸡星状病毒、禽肾炎病毒和鸡传染性支气管炎病毒三重RT-PCR检测用引物序列B.2.1鸡星状病毒ꢀbp。使用时用无RNA酶水稀释至10μM。B.2.2禽肾炎病毒796ꢀbp。使用时用无RNA酶水稀释至10ꢀμM。B.2.3鸡传染性支气管炎病毒ꢀ577ꢀ使用时用无RNA酶水稀释至10μM。7DB37/T6034.22026附录C（资料性）RT-PCR反应体系的配置C.1RT-PCR一步法反应体系见表C.1。表C.1RT-PCR一步法反应体系体积μL235组分无RNA酶水10×OnestepRNAPCR缓冲液MgCl2（25mmol/L）105dNTPMixture（各10ꢀmmol/L）上游引物（20ꢀmol/mL）下游引物（20ꢀmol/mL）RNA酶抑制剂（40ꢀU/AMVRTaseXL（5ꢀU/AMV-OptimizedTaq（5ꢀU/模板RNA111112总体积50注：不同公司生产的一步法RT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，根据相应的说明书进行修