神经遗传病分子诊断中二代全外显子组测序的盲区与应对策略总结2026

神经遗传病分子诊断中二代全外显子组测序的盲区与应对策略总结2026单基因神经遗传病是一类由基因变异引起，主要累及中枢或周围神经系统、神经肌肉接头以及骨骼肌系统的疾病，具有起病隐匿、病因复杂、表型异质性强等特点，涵盖脑病、癫痫、遗传性共济失调、遗传性周围神经病、肌病等多个疾病谱系［1］。近年来，随着分子诊断技术的发展，二代测序（next-generationsequencing）特别是全外显子组测序（wholeexomesequencing，WES）因具有高通量、高性价比的特点，大大提高了遗传病的诊断效率，已成为神经遗传病基因诊断的重要手段［2,3］。然而，在临床实践中仍有30%~50%高度怀疑为遗传病的患者面临着WES结果阴性的困境［4,5］，导致治疗延误、遗传咨询困难等。为此，我们结合临床实践分析WES检测的“盲区”，并提出相应的应对策略。一、WES的技术局限性及检测“盲区”WES作为目前主流的高通量测序技术，其本身存在一定的技术局限性。（一）技术原理和检测范围的局限性1.WES仅针对基因组中1%~2%的蛋白编码区（即外显子及其邻近内含子序列）进行测序，而人类基因组中高达98%的区域属于非编码序列，包括启动子、增强子、转录调控区、非经典剪接区域、深度内含子区域以及散在的重复元件等非编码序列，这些区域为WES的检测“盲区”。近年来有研究发现，这些区域是基因组发生结构变异、动态突变的富集区域，该区域内的基因变异可能与神经遗传病存在密切的联系［6］。2.WES的数据质量受捕获效率和测序平台的影响。高GC含量区域WES的捕获效率较低，部分外显子可能存在低覆盖率或间断覆盖的问题，导致潜在“漏检”。（二）变异类型检测的局限性1.尽管WES在检测点突变和小片段插入缺失变异方面具有较高的灵敏度，但对复杂变异的检测能力有限。例如，染色体拷贝数变异（copynumbervariation，CNV）、非等位重组导致的结构变异、动态突变等均难以被WES有效识别。2.WES技术无法检测印记基因缺陷导致的遗传病（如Prader-Willi综合征、Angelman综合征、Ⅰb假性甲状旁腺功能减退症等）［7］。数据分析的局限性1.外显子区域的非经典剪接变异，如DNA层面的同义变异和错义变异均可能引发异常剪接，这些变异可通过影响剪接调控元件导致编码蛋白的表达下降或结构改变，在生物信息分析的过程中常被忽略，但仅从生物信息分析层面有时很难把握。2.假基因干扰（如SORD基因）增加了神经遗传病的诊断复杂性［8］。3.不同WES检测平台的生物信息分析能力可能存在差异，特别是生物信息分析从业人员对临床表型的理解存在一定的差异，导致可能致病的基因变异被流程化过滤或遗漏。二、WES阴性的临床应对策略即使WES检测结果提示为“阴性”时，仍可能存在未被识别的致病变异。临床表型是破解WES阴性困局的第一把钥匙。当WES检测结果为阴性时，首先应回归基本问题：该病例是否为遗传性疾病？这一判断不应仅依赖分子遗传学检测结果，而应基于患者详细的病史、临床表现、家族史、辅助检查结果等进行综合评估。是否存在慢性、渐进性进展？是否有多系统受累？是否为典型的发病年龄或伴有特征性表型？是否存在类似症状的家属？这些因素共同构成遗传病诊断的重要基石。因此，在遗传性疾病的分子遗传学诊断过程中，当WES检测结果呈阴性时，可能涉及以下多种潜在机制，需结合疾病的临床表型、遗传模式、致病变异类型及不同变异检测手段等多方面进行综合分析。（一）大卫星重复序列CNV面肩肱型肌营养不良（facioscapulohumeralmusculardystrophy，FSHD）由D4Z4重复单元拷贝数减少引起，该变异属于结构变异范畴，WES无法有效检测［9］。临床医生应对患者进行仔细的检查，如能发现患者存在面肌无力、翼状肩胛以及不对称性肌无力等临床特征，需采用Southern印迹法及光学基因组图谱技术，可有效提高FSHD的诊断敏感度。（二）小卫星重复序列CNV（动态突变）某些疾病如强直性肌营养不良1型、眼咽远端型肌病和神经元核内包涵体病，其致病机制涉及非编码区短串联重复序列（shorttandemrepeats）的异常扩增［10,11,12］。这类变异可导致遗传不稳定性，表现为显性、隐性、不完全外显或散发等多种遗传模式。因为这些疾病的致病变异常位于WES的检测范围之外，WES测序不能通读或无法拼接，进而导致阴性结果。因此，临床医生对该类疾病表型的准确认识至关重要，如果提示可能是动态突变类疾病，在进行基因测序时应转而利用限制性、连接介导的PCR方法结合毛细管电泳进行特定基因的动态突变检测，或者采用全基因组测序（wholegenomesequencing，WGS）/长读长测序技术进行检测。当前研究结果表明，WGS在WES阴性患者中的“二次诊断率”可达10%~20%［13］。而长读长测序技术凭借其超长读长和单分子实时测序的优势，极大地克服了二代测序在结构复杂区域检测中的局限性。对于高度重复区域、GC偏高片段、串联重复扩展及染色体重排的检测，长读长测序具有天然优势。（三）结构变异（structuralvariants）结构变异包括染色体重排、倒位、插入、平衡易位等复杂变异形式，也可能导致基因功能异常。例如DMD基因中的复杂结构变异是已知的致病机制之一，需借助染色体核型分析、荧光原位杂交、光学基因组图谱技术或长读长测序等手段进行识别［14］。（四）结构基因外显子区缺失或重复迪谢内肌营养不良症（Duchennemusculardystrophy，DMD）、腓骨肌萎缩症1A型以及脊髓性肌萎缩症等疾病，常由外显子区域的大片段缺失或重复变异引起［15］。由于WES技术本身对CNV的检测能力有限以及分析平台存在差异，若未结合多重连接探针扩增技术（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）等补充检测方法，易导致漏诊。建议将MLPA、染色体微阵列、低深度高通量测序或长读长测序作为补充检测手段。（五）深度内含子区域变异某些致病变异位于致病基因的深度内含子区域，可能导致异常剪接或调控功能改变［16］。以DMD为例，1%~2%的病例由深度内含子变异引起［17］。此类变异通常无法通过常规WES检出。当临床表型高度怀疑为DMD时，需进行骨骼肌活组织检查（活检），在肌肉病理明确的情况下，利用肌肉组织进行RNA层面的分析鉴定异常剪接事件，再回溯至DNA层面确定潜在致病变异。（六）外显子区域的非经典剪接变异被误滤尽管通常认为同义变异不致病，但一些外显子区域的同义变异可能影响信使RNA前体（pre-mRNA）的剪接、翻译效率或稳定性，从而具有致病意义［17,18］。此外，外显子区域的错义变异同样可以通过影响剪接调控元件引发异常剪接产生致病性。然而，在数据分析过程中，其常因被误认为是单核苷酸多态性（single-nucleotidepolymorphism，SNP）而被过滤。因此，建议重新对原始数据进行人工复核，结合生物信息学工具（如SpliceAI、SpliceVault、HumanSplicingFinder）预测该类变异的潜在功能影响，并通过mRNA分析验证其生物学效应，例如DMD和GNE肌病，既往均有在DNA层面的同义变异通过异常剪接机制引发疾病的相关报道［17,18］。（七）线粒体DNA变异由于致病变异位于线粒体基因组，仅针对核基因组进行WES将无法检测出此类变异，从而导致假阴性结果。典型的线粒体疾病综合征如线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作（mitochondrialencephalomyopathywithlacticacidosisandstroke-likeepisodes，MELAS）和肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维（myoclonicepilepsywithragged-redfibers，MERRF）综合征，通常具有特征性的临床表现，易于识别，因此会对患者优先进行线粒体基因组检测。然而，部分患者可能仅表现为非特异性的孤立症状（如肢带型肌无力、癫痫、发育迟缓等）或呈现不典型的综合征表型，此时线粒体疾病的临床提示较弱，易被忽视［19］。因此，在WES结果阴性的情况下，应考虑线粒体病的可能性，建议重新评估患者的临床表型，并结合相关辅助检查（如肌肉活检）结果，补充进行线粒体DNA测序。所幸的是，目前多数基因检测平台在进行WES检测时，会同步对血细胞的线粒体DNA进行测序，但临床需要警惕由不同组织样本中线粒体DNA的突变比例不同造成的结果差异。当血细胞中线粒体DNA突变比例过低时，可能出现漏诊。如慢性进行性眼外肌麻痹或Kearns-Sayre综合征患者，其肌肉组织中线粒体DNA的缺失比例显著高于血液样本，此时肌肉活检样本的线粒体DNA检测可提高检出率［20］。同时，也要警惕因核基因组的线粒体假基因扩增所引起假的低比例线粒体DNA突变结果。（八）体细胞嵌合变异与组织特异性突变多数WES基于外周血DNA提取，但某些疾病如线粒体脑肌病或嵌合体病变（颅面血管瘤病、发育性脑畸形）可能存在组织特异性变异［21,22］。“样本来源与致病位点不符”是技术本身难以克服的问题，只有临床医生提供组织特异性样本才能保障检测结果的敏感度和特异度。（九）非经典遗传机制对于表型高度特异或者明确有家族史但WES结果为阴性的病例，需警惕非经典遗传学机制的存在，如表观遗传修饰（DNA甲基化）、单亲二体（uniparentaldisomy）、基因组印记异常或染色体畸变等。建议优先采用SNP芯片、WGS、光学基因组图谱、长读长测序或甲基化特异性检测（如甲基化特异性MLPA）等技术，拓展遗传病因诊断的广度与深度。（十）新致病基因在采取重分析并排除上述干扰因素以后，对于表型高度特异或者明确有家族史但WES检测结果为阴性的病例，我们需要警惕存在新的致病基因的可能。对于这种情况，建议采取相同临床病例表型聚类分析的策略，对具有相似临床表型但WES检测结果为阴性的病例在课题组内或者国内同行课题组之间进行分享汇总，建立专病表型和基因型数据库进行聚类分析。（十一）变异致病性评级应用差异目前不同的检测实验室应用的变异评级策略和评级证据存在差异，可能引起变异评级差异。对于高度怀疑为单基因遗传病的病例，可以结合临床资料，组织临床医生和遗传分析检测人员进行多学科团队讨论，对测序的原始数据进行变异重分析，以期检测出致病变异。目前分子遗传学检测技术飞速发展，变异分析的参考数据库不断更新，因此也建议对WES阴性结果的测序