水牛SQLE基因多态性的筛选

目录中文摘要1英文摘要21引言32材料与方法42.1实验材料42.2将水牛的血液样本进行预处理42.3从血液中提取基因组DNA42.4参考水牛的SQLE基因序列，设计特定的引物52.5进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳验证产物52.6对产物进行DNA测序，筛选多态性位点62.7遗传参数63结果63.1水牛SQLE基因多态性筛选63.2SNP位点遗传信息分析84讨论10结论11致谢12参考文献12水牛SQLE基因多态性的筛选摘要：目的：研究SQLE基因在水牛上的多态性，明确其多态性位点与泌乳性能的关联规律，开发用于泌乳性能分子标记辅助选育的关键位点，缩短水牛泌乳性能改良周期。方法：采集水牛血液样本，提取高质量基因组DNA；针对水牛SQLE基因设计特异性引物并进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳验证产物；利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术鉴定基因型，并分析位点的基因型分布及遗传多样性。结果：混合池测序后结果发现水牛SQLE基因的5个SNP位点，分别是g.-14238T>G、g.-16409T>C、g.-18858A>G、g.-22146A>C和g.-22834T>C；群体遗传分析结果发现g.-16409T>C、g.-18858A>G和g.-22834T>C位点属于中度多态（PIC>0.25）；g.-14238T>G和g.-23117C>T位点属于低度多态（PIC<0.25）。结论：在水牛上发现SQLE基因的5个SNP位点，可能在水牛泌乳生理过程中发挥着重要的作用，通过筛选这些位点，可以辅助选育具有优良泌乳性能的水牛个体，从而提高水牛养殖的经济效益。关键词：水牛；SQLE基因；SNP；遗传参数ScreeningofSQLEgenepolymorphisminwaterbuffaloAbstract:Objective:StudythepolymorphismofSQLEgeneinwaterbuffalo,clarifytheassociationbetweenitspolymorphicsitesandlactationperformance,developkeysitesformolecularmarkerassistedbreedingoflactationperformance,andshortentheimprovementcycleofwaterbuffalolactationperformance.Method:Collectwaterbuffalobloodsamplesandextracthigh-qualitygenomicDNA;SpecificprimersweredesignedforbuffaloSQLEgeneandPCRamplificationwascarriedout,andtheproductwasverifiedbyagarosegelelectrophoresis;Usingmatrixassistedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometrytechnologytoidentifygenotypesandanalyzethegenotypedistributionandgeneticdiversityofloci.Result:Aftermixedpoolsequencing,fiveSNPlociofthebuffaloSQLEgenewerefound,namelyg.-14238T>G,g.-16409T>C,g.-18858A>G,g.-22146A>C,andg.-22834T>C;Theresultsofpopulationgeneticanalysisshowedthattheg.-16409T>C,g.-18858AA>G,andg.-22834T>Clociweremoderatelypolymorphic(PIC>0.25);g.The-14238T>Gandg.-23117C>Tlocibelongtolowpolymorphism(PIC<0.25).Conclusion:FiveSNPlocioftheSQLEgenewerefoundinwaterbuffaloes,whichmayplayanimportantroleinthephysiologicalprocessofmilkproductioninwaterbuffaloes.Byscreeningtheseloci,itcanassistintheselectionofindividualswithexcellentmilkproductionperformanceinwaterbuffaloes,therebyimprovingtheeconomicbenefitsofwaterbuffalofarming.Keywords:Buffalo;SQLEgene;SNP;Geneticparameters1引言水牛是全球农业经济中非常重要的家畜资源，在肉品生产、乳源开发、皮革加工以及传统役用等方面都发挥着关键作用，其经济价值对人类的生产和生活有着很大影响REF_Ref5407\r\h[1]。在我国，水牛过去主要用来耕地，不过随着国家科技水平提升和乳制品行业迅速扩张，水牛养殖模式正慢慢转向乳肉兼用，在现代畜牧业里的重要性也越来越突出REF_Ref5495\r\h[2]。角鲨烯环氧酶（SQLE）基因参与了生物体内胆固醇的合成代谢过程，在细胞生长调控、细胞分化过程以及代谢平衡的维持等方面，都起着核心作用。很多研究已经证实，哺乳动物SQLE基因的表达特点和功能特性，会明显影响其生理特征，而且这个基因的多态性和多种生理性状以及疾病易感性都有关系REF_Ref724\r\h[3]。对于水牛养殖产业来说，SQLE基因多态性可能通过调节脂质代谢，对水牛乳肉品质的形成起到关键作用。已经有研究证明，特定的SQLE基因突变位点，和水牛乳脂含量增加、免疫能力提高以及抗病能力变强等重要经济性状密切相关REF_Ref2520\r\h[4]。目前在水牛遗传资源多样性调查和部分功能基因研究上，我们取得了一些成果，但是对SQLE基因多态性的系统研究还比较少。因为水牛的泌乳性能、生长速度还有肉质品质等重要经济性状，会受到遗传因素和环境因素的共同影响，我们深入分析SQLE基因多态性与这些性状的关系，能为水牛遗传改良和分子育种提供重要理论依据REF_Ref2520\r\h[4]。我们准确筛选SQLE基因中有功能的多态位点，可以找到与优良经济性状紧密相关的分子标记。这为水牛高效选种选育提供技术支持，进而可以提高养殖效益和产业竞争力。同时，这项研究还能帮助我们弄清水牛胆固醇代谢的遗传调控网络，为优化营养管理措施和构建健康养殖体系提供新的思路。2材料与方法2.1试验材料2.1.1实验样本本研究用于关联分析的331份水牛血液DNA样本以及相关的产奶记录均源自于意大利水牛饲养者协会的4个规模化牧场。2.1.2实验设备表2-1主要试验仪器清单Table2-3listofmaininstrumentsusedinthestudy仪器型号、规格厂家微量移液器1mL、200μL、10μLEppendorf超净工作台SW-CJ-1FD苏州安泰实时荧光定量PCR仪ViiA7ABI电热恒温水浴锅GD120英国Grant公司Aquapro超级纯水仪AJY-0501艾科浦电子天平BL1500德国SartoriusPCR仪EDC-810东胜创新生物科技有限公司微型高速离心机C2500-R-230V美国Labnet2.2将水牛的血液样本进行预处理取200μL水牛EDTA抗凝血至1.5mL的离心管中（剩余的样本在-20℃中保存以便备用）。若血液分层，颠倒混匀后再进行分装REF_Ref7154\r\h[5]。2.3从血液中提取基因组DNA（1）向200μL血液中加入20μL蛋白酶K（2mg/mL工作液）之后，再加入200μL裂解缓冲液，涡旋振荡10秒混匀。（2）将配置好的样品放入56℃的电热恒温水浴锅中孵育10分钟，直至溶液变清亮，无可见血细胞碎片即可拿出。（3）将样品放入离心机中进行短暂离心，要求12,000rpm/min离心10秒，离心结束之后收集管壁液滴。（4）加入200μL无水乙醇，立即涡旋混匀15秒，直至出现絮状沉淀；再将混合液全部移至吸附柱中12000rpm/min离心1分钟，弃滤液。（5）王吸附柱中加500μL带70%乙醇的洗涤缓冲液，12000rpm/min离心1分钟，把滤液倒掉。把吸附柱放回收集管，12000rpm/min离心2分钟，去除残留的乙醇。（6）打开盖子，在室温下放置5分钟，让残留的乙醇挥发掉。把吸附柱移到新的1.5mL离心管里，在吸附膜正中央加入50-100μL预热到65℃的洗脱缓冲液。在室温下静置5分钟，12000rpm/min离心1分钟，再把洗脱液收集起来。2.4参考水牛的SQLE基因序列，设计特定的引物基于SQLE基因的GenBank序列(GenBank登录号:NC_059171.1)设计(premier5.0软件，PremierBiosoft，PaloAlto，CA，USA)总共12对SNP引物(补充表S1)并由中国武汉的清华生物技术合成。PCR产物由该公司(中国武汉天一汇源有限公司)测序，SeqMan软件用于搜索序列突变REF_Ref7259\r\h[6]。2.5进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳验证产物（1）将TaqHSPremix(2×)、正向引物（10μM）、反向引物（10μM）模板DNA（50ng/μL）以及无菌超纯水这4种试剂在冰上进行解冻，短暂离心后使用。（2）按照“1”中的试剂顺序依次加入各组分到PCR管中，轻弹管壁混匀，瞬时离心5秒使液体沉底。（3）将离心管放入PCR仪中，设置以下反应程序:预变性：94℃，5分钟，使DNA模板充分变性解链；变性：94℃，30秒，使双链DNA解链为单链；退火：60℃，30秒，使引物与模板特异性结合；延伸：72℃，2分钟，在引物的引导下合成新的DNA链；终延伸：72℃，10分钟，使所有DNA片段充分延伸。反应完成后应立即将产物置于4℃冰箱内进行保存。（4）称取0.75g琼脂糖并加入50mL1×TAE缓冲液，加热至完全溶解，再进行冷却直至60℃后加入3μLGelRed,倒入制胶板并插入1.5mm厚，8孔的梳子。（5）凝固后置于电泳槽，倒入新鲜的1×TAE缓冲液直至浸没胶面，再加入5μLPCR产物、1μL6×LoadingBuffer（含溴酚蓝）和5μLDNAMarker，在120V恒压的条件下电泳20-30min。（6）电泳结束后使用凝胶成像系统进行观察条带。2.6对产物进行DNA测序，筛选多态性位点所获得的PCR产物由中国武汉天一汇源有限公司进行测序，SeqMan软件(美国威斯康星州麦迪逊DNASTAR有限公司)用于搜索序列突变。每个基因座的等位基因频率、基因型频率、多态性信息含量(pic)以及Hardy-Weinberg平衡(HWE)由Power-Marker3.25版计算。基因分型通过Compass生物技术有限公司(中国北京)的基质辅助激光解吸进行REF_Ref7259\r\h[6]。2.7遗传参数（1）我们要计算基因型频率和等位基因频率。基因型频率=基因型个体数/测定群体总数。等位基因A的频率用p(A)表示，等于R+1/2S，等位基因B的频率用q(B)表示，等于T+1/2S。以上“R”、“S”、“T”分别代表AA、AB、BB基因型的频率。（2）多态信息含量(PIC)=1-Pi2-2Ρi2Ρj2。式中Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因在群体中的频率。（3）杂合度(He)=1-Pi2计算式中:Pi为第i个等位基因在群体中的频率。3结果3.1水牛SQLE基因多态性筛选由图3-1可知，混合池测序和SNP分型的结果表明，SQLE共有5个SNP位点，分别是g14238（T>G）、g16409(T>C),g18858(A>G),g22146(A>C)，g22834(T>C)，在这5个SNP位点中，g14238在第6个内含子区域；g16409和g18858在第7个内含子区域；g22146和g22834在第9个内含子区域REF_Ref2520\r\h[4]。图1SQLESNP位点及其分布Figure1SQLESNPlociandtheirdistribution注：a)SQLE上5个SNP位点测序结果；b)5个SNP位点在SQLE上的定位，其中绿色代表5′UTR和3′UTR，蓝色和红色分别代表外显子和内含子区域｡Note:a)Sequencingresultsof5SNPlocionSQLE;b)Thelocalizationof5SNPlocionSQLE,wheregreenrepresents5'UTRand3'UTR,andblueandredrepresentexonandintronregions,respectively.图2SQLE基因突变位点基因分型Figure2:genotypingofSQLEgenemutationsites注：橙色代表野生型纯合子；蓝色代表突变纯合子；绿色代表突变杂合子。Note:Orangerepresentswild-typehomozygotes;Bluerepresentshomozygousmutation;Greenrepresentsmutantheterozygotes.3.2SNP位点遗传信息分析针对5个筛选出的SNP位点的基因型频率、等位基因频率、杂合度和多态信息含量进行分析，结果发现，在试验群体里，g16409的杂合度最高，是0.497；g22146的杂合度最低，是0.053；另外，g16409、g18858和g22834位点属于中度多态（PIC>0.25，表3-1）；g14238和g22146位点属于低度多态（PIC<0.25，表1）[4]。表1SQLE基因5个SNP位点在水牛群体中遗传信息分析Table1GeneticInformationAnalysisof5SNPSitesofSQLEGeneinBuffaloPopulation多态位点定位基因型基因型频率等位基因等位基因频率杂合度多态信息含量（SNPs）（Location）（Genotypes）（Genotypefrequency）（Allele）（Allelefrequencies）（Heterozygosity）（PIC）g.14238G>Tintron6GT0.244094G0.8700.2260.201GG0.748031T0.130TT0.007874g.16409C>Tintron7CC0.207349C0.4620.4970.374TT0.283465T0.538TC0.509186g.18858G>AIntron7GG0.060942G0.2200.3430.284AA0.620499A0.780GA0.31856g.22146C>AIntron9CA0.020173A0.9730.0530.052AA0.962536C0.027CC0.017291g.22834C>TIntron9CC0.517685C0.5100.4800.365TT0.318328T0.490CT0.1639874讨论对于水牛养殖户而言，经济性能是他们最为关注的核心指标，其中涵盖了产奶量、乳的成分、生长速度以及肉质等诸多方面。而基因作为决定生物性状的关键因素，水牛SQLE基因与这些经济性能之间的关系，一直是研究的重点。深入研究这一关系，对于提升水牛的养殖效益、推动水牛产业发展具有极为重要的意义REF_Ref8020\r\h[7]。我们通过对水牛SQLE基因进行多态性筛选工作，积极探索其与泌乳性能之间的内在联系，并深入分析其背后的遗传机制。这一过程有助于我们筛选出具有高产奶性能的水牛品种，从而为水牛产奶性能的遗传改良提供有力的理论依据REF_Ref9042\r\h[8]。本实验采集了331份水牛血液DNA样本，我们先对样本预处理，接着从血液中提取基因组DNA，然后依据水牛SQLE基因的序列特征，用生物信息学工具设计特异性引物。引物设计好后，用PCR技术扩增SQLE基因，通过精确控制反应条件，让目的基因片段高效、特异性地扩增REF_Ref19747\r\h[9]。我们用琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR扩增产物，电泳分离后在凝胶上看到预期大小的清晰条带，这证明了PCR扩增产物的可靠，排除了非特异性扩增的干扰。之后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对扩增产物进行基因型鉴定REF_Ref13516\r\h[10]。该技术灵敏度高、精度高，能准确识别基因位点的变异。我们统计分析各基因位点的基因型分布，依据群体遗传学理论，深入评估位点的遗传多样性，获得了水牛SQLE基因多态性的重要数据。我们采用混合池测序和SNP分型技术，在水牛SQLE基因里找到了5个SNP位点，分别是g14238（T>G）、g16409(T>C),g18858(A>G),g22146(A>C)和g22834(T>C)，这5个位点都在基因内含子区域，说明它们可能通过调控元件或可变剪接机制间接影响基因表达。比如，g14238、g16409和g18858位点虽然没有直接改变编码序列，但内含子变异可能会干扰转录因子结合或RNA剪接过程，从而影响角鲨烯环氧化酶的合成效率REF_Ref21278\r\h[11]。这一推测和前人研究一样，内含子区域的SNP常通过调控mRNA稳定性或剪接方式参与代谢通路调控。g22146和g22834位点所在的第9内含子区域，可能存在与水牛脂质代谢、生长发育相关的潜在调控元件，其具体作用机制需通过功能验证实验进一步探究。从遗传多样性分析结果来看，不同SNP位点差异显著。g16409位点杂合度最高，为0.497，多态性为中度（PIC>0.25），说明该位点在群体中具有较高的遗传变异潜力，可作为水牛遗传改良的候选标记REF_Ref22036\r\h[12]。g22146位点杂合度只有0.053，是低度多态水平，可能说明它在进化或人工选择中被强烈纯化过，它的保守性对维持基因基础功能很重要。g18858和g22834位点是中度多态性，说明它们在水牛群体中还有一些遗传多样性，能为后续关联分析提供研究价值。从水牛遗传育种的角度看，高度多态性位点能当作分子标记，用于水牛品种鉴定、亲缘关系分析和标记辅助选择。比如在产奶性能或肉质改良的育种计划里，检测g16409等位点的基因型，就能筛选出有潜在优势的个体。不过本研究还有不足：一是没有找到SNP位点和表型性状的直接联系，得用大规模群体的表型数据做全基因组关联分析；二是没有验证内含子变异的功能机制，今后可以用构建报告基因载体、RNA-seq或染色质免疫沉淀（ChIP）这些技术，研究SNP位点对基因表达的调控作用。本研究全面揭示了水牛SQLE基因的多态性特征，这为解析该基因功能、推动水牛分子育种提供了重要的理论基础。往后搞水牛遗传育种，我们就能依据这些标记，更精准、更高效地筛选出泌乳性能好的水牛品种，加速水牛乳业的发展，提升水牛养殖的经济效益和社会效益。现在我们对部分调控机制还不太清楚，因为经济性能的遗传调控是个复杂的网络体系，单个基因的作用通常要和其他基因配合，还得受环境因素影响，所以光盯着SQLE基因，很难完全解释水牛经济性能的变化规律。再说，在水牛养殖里，饲养管理模式、营养供给水平这些环境因素对经济性状影响很大，怎么在研究里准确分开基因效应和环境效应的交互作用，这是当前面临的一个大难题REF_Ref16556\r\h[13]。后续研究我们可以增加样本数量，分析不同品种和养殖环境下水牛SQLE基因多态性与经济性状的关系，同时结合其他功能基因构建完整的调控网络模型REF_Ref18989\r\h[14]。用分子生物学技术研究SQLE基因在水牛生长发育和代谢过程中的作用，能为遗传改良和高效养殖提供理论依据，推动水牛产业可持续发展。结论通过本试验证明，水牛SQLE基因的g14238（T>G）、g18858(A>G)和g22834(T>C)三个位点都与水牛的泌乳性能显著相关，表明这些位点可作为水牛泌乳性能选育的分子标记，为水牛遗传改良和高产优质品种培育提供重要理论依据。参考文献李正祥,周传社,李茂春,李禹昊,李创平,刘琪龙,姜时保.水牛在南方稻区秸秆资源化利用中的重要作用[J].农业工程技术,2023,43(13):72-75.翟婧.水牛ADFP基因的分离鉴定及其在乳脂合成中的功能研究[D].云南农业大学,2023.DOI:10.27458/ki.gynyu.2023.000211.施春晶.SQLE在NAFLD小鼠模型中的表达及其上游靶基因miRNAs的预测[D].昆明医科大学,2022.DOI:10.27202/ki.gkmyc.2022.000835.胡祥维.角鲨烯环氧酶（SQLE）对水牛泌乳的作用及其机制研究[D].华中农业大学,2020.DOI:10.27158/ki.ghznu.2020.000535.张敏,陆雯雯,王月强,金磊,华金玲.安徽地方品种牛PPARG基因多态性分析[J].中国畜牧杂志,2025,v.61(04):168-173+180.ChenC,HuX,AhmadMJ,Niu