第四章电泳技术

第四章电泳技术

带电颗粒在电场的作用下向着与其电性相反的电极方向迁移，这种现象称之为电泳（electrophoresis，简称EP）。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核酸等都具有可电离基团，在特定的pH溶液中它们可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电离子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。

电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。电泳作为一种分离技术是在1937年由瑞典的Tiselius建立了“移动界面电泳”（moving-boundaryelectrophoresis）以后才实现的。

此方法先是在U形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间形成清晰的界面，然后加一外电场。由于界面处存在浓度梯度因而产生折射率梯度，利用适当的光学系统可以观察到界面的移动。他创造了Tiselius电泳仪，使用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的。由于Tiselius在电泳技术方面做出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。

电泳早期的支持介质主要是以薄膜、薄层为主。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行了研究。1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法（zoneelectrophoresis）。

区带电泳方法是由于在支持介质上电泳蛋白质混合物被分离成若干区带而得名。1959年S.Raymond和L.Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶区带电泳方法（polyacrylamidegelelectrophoresis,简称PAGE），极大地提高了电泳技术的分辨率。1960年以后，L.Orenstein

和B.J.Davis从理论上阐述了聚丙烯酰胺凝胶电泳，并通过改进实验方法使得凝胶电泳技术得以推广应用。1967年A.L.Shapiro等在此基础上首先建立了SDS（十二烷基硫酸钠）技术，随后K.Weber和M.Osborn对其进行完善。SDS是一种有效的变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，使蛋白质的多肽链处于展开状态。20世纪70年代以后根据不同需要又发展了等电聚焦电泳、双向电泳、印迹转移电泳等技术。

电泳的模式也从圆盘电泳、垂直板电泳、脉冲电泳等发展到后来的分辨率极高的毛细管电泳。电泳后的检测手段也从染色、扫描等方法延伸到紫外吸收、放射自显影、生物活性测定、化学发光、荧光激发以及质谱和核磁共振等方法进行分析得到所需数据。可以说，近代电泳技术仍是生物化学和分子生物学中对生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术之一。§4.1电泳的基本原理

生物大分子由于其本身的解离或表面吸附其它带电质点而带电，带电粒子在电场中运动，不仅是物质的一种运动现象，还是一种有效的物质分离方法。各种带电粒子在电场中移动方向取决于它们的带电符号，而移动的速度不同形成各自特定的迁移率。迁移率大小不仅取决于粒子自身特性还取决于外部多种因素。§4.1.1电泳迁移率

电泳迁移率（Electophoreticmobility）对于一个特定的生物分子是一个恒定的常数，它决定着粒子在电场中的移动速度。如果把带有效电荷q的生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场强度为E的电场中，使该粒子具有恒定迁移率的动力（Fef）等于所带净电荷与电场强度的乘积：

Fef

=q·E

（4.1）这个作用力使得带电粒子向其电荷相反的电极方向移动。

在移动过程中，粒子同时会受到介质摩擦力的阻碍。摩擦力（Ffr）的大小与粒子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电粒子的移动速度成正比，对于球形粒子来说，在自由溶液中此阻力的大小服从Stokes定律：

Ffr=6·π·r·η·υ

（4.2）式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是带电离子的移动速度(υ=d/t，单位时间粒子运动的距离，cms-1

)。

但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stokes定律。Ffr还取决于介质中的其他因素，如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。当带电颗粒达到稳态运动时，两种作用力相等：

Fef=Ffr

（4.3）（4.4）

电泳迁移率（µ）是指在单位电场强度（1Vcm-1）时带电粒子的迁移速度：

（4.5）由上式可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。在确定条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物理化学特性常数，从式（4.5）中可以导出迁移率的单位是cm2s-1

V-1。带电颗粒迁移率的差异提供了从混合物中分离各种物质的基础，迁移距离与迁移率成正比。§4.1.2焦耳热在电泳过程中，电流通过导电介质时，由于有电阻的存在就会产生欧姆热，也就是焦耳热（JouleHeating）。这种热量必须通过介质（如凝胶或毛细管的表面）散发出去。因此，在介质中会形成一个温度梯度，这将直接导致电极间形成对流，从而产生泳带扩散或分辨率下降现象。

释放出的热量（Q）与电流强度（I）的关系可列成如下公式：

Q＝I2·R·t（4.6）式中R为电阻；t为电泳时间；I为电流强度。公式表明，电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅降低分辨率，而且在严重时会熔化支持物（如：琼脂糖凝胶）。

降低焦耳热的方法有：（1）尽量使用较低的电场强度或降低电泳缓冲液的离子强度，当然，电泳中过低的电压会导致延长电泳时间和降低分离效率；（2）尽量使用薄胶或直径较小的毛细管，这样会加快散热。由于此时的电阻较高，根据欧姆定律，如果电压不变，则电流减小，因此导致焦耳热减小。但这样做的同时也减少了样品的上样量，也就降低了电泳的检测限。§4.1.3电渗流当支持物（琼脂、凝胶、毛细管）不是绝对惰性物质时，常常会因支持物上存在的负离子基团如羧基、羟基、硅醇基等吸附电极溶液中的正离子（如H+）,形成一个正离子层，在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，溶液层会向正极移动，电场中溶液层的这种泳动称为电渗流（Electroosmoticflow,EOF），这种现象也称之为电渗（Electroosmosis）现象。

溶液层所受到的电场力称为电渗力。当带电颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。当电场力等于或小于电渗力时，则颗粒的泳动速度为零或向相反的方向移动。图4.1电渗示意图

电渗流是毛细管电泳设计的重要理论依据之一，石英毛细管壁上的硅烷基，在pH大于4时就会带负电荷吸附溶液中的带正电荷离子，这种吸附能力从毛细管表面到中心逐渐减弱形成zate电势（ζ）。电势的大小与溶液的离子强度正相关。毛细管中电渗流的速度与溶液的电势（ζ）、电介常数（ε）和电场强度（E）成正比，与溶液的粘度（η）成反比。（4.7）

电渗迁移率定义为单位电场强度中溶液在电渗力的作用下的迁移速度：（4.8）

在毛细管中电泳时，电渗流可以通过以下方式控制：（1）在低pH下电泳；当pH低到可以使硅烷基团质子化时，毛细管表面电荷被中和，通常这种情况都是发生在pH<4时，此时，多数生物分子不够稳定；（2）进行化学表面修饰；硅烷基团的化学修饰可以使毛细管壁变成非常亲水或非常疏水状态。通过磺酸处理形成的亲水表面可以保持恒定的高电渗流，而挂上疏水基团的表面就可以抑制电渗流。这种方法的不足之处是化学修饰的长期稳定性较差；（3）对毛细管壁进行动态涂层；在电泳缓冲液中加入聚乙二醇（PEG），在毛细管壁上形成动态的粘液层，封闭了管壁上的电荷，从而抑制电渗流；（4）使用添加剂改变溶液的粘度或电势。一些中性的添加剂（如羟乙基纤维素，聚乙烯醇）可以增加电泳缓冲液的粘度，减小电渗流的速度，抑制离子与毛细管表面的相互作用。而一些有机溶剂（如甲醇或乙腈）也可以用来降低或增加溶液的粘度。此外，像十二烷基三甲基溴化铵（dodecyl

trimethylammoniumbromide，DoTAB）这类阳离子表面活性剂可以吸附在毛细管壁上改变表面电性，从而改变电渗流的方向。当然，表面活性剂必须在较低的浓度下使用才能避免形成束胶干扰样品分离。§4.1.4分离效率与分辨率电泳的分离效率（Separationefficiency）与分辨率（Resolution）受各种待分离物质的电泳流和电渗流的共同影响，也就是说影响电泳迁移率的因素决定着分离效率与分辨率。电泳的分辨率(RS)指的是两个离子之间的分离效率，分辨率的好坏取决于离子迁移率间的差值（Δμep）、待分离样品的实际迁移率（μapp）、电泳的分离电压(V)和扩散系数（D）。

(4.9)

最好的优化分辨率的方法是提高分辨效率，即增加离子间迁移率的差值。这可以通过改变缓冲液的pH值或改变电泳模式来实现。此外，对于具有低扩散系数的大分子分辨率较高。由电泳迁移率的公式可以看出，影响电泳分离的因素很多，主要的影响因素如下所述。一、生物大分子的性质待分离生物大分子所带的静电荷量、分子直径与形状都会对泳动速度有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、或其形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。

二、电泳缓冲液的性质缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而决定其带静电荷的量，溶液pH距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越快。对于蛋白质、核酸等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于分子的等电点，则分子带负电荷，其电泳的方向是流向正极，反之，则流向负极；

为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH的稳定性，缓冲液必须要保持一定的离子强度，一般在0.02～0.2之间。离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层－离子氛（ionicatmosphere），由于离子扩散层与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。

离子的这种障碍效应与其浓度和化合价数相关。可用离子强度（I）表示：（4.10）

式中s表示溶液中离子种类，Ci和Zi分别表示每种离子的摩尔浓度与化合价。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响，因为粘度与电泳速度成反比关系，因此，粘度过大或过小都会影响分子的迁移率。

三、电场强度电场强度（Vcm-1）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流所作的功绝大部分都转换为焦耳热，因而引起介质温度升高，这会导致样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；产生对流现象，引起待分离物的再混合；对热敏感样品，会引起样品变性；也会引起溶液粘度降低、电阻下降，严重时会损坏仪器。

电泳中产生的热通常是由中心向外周扩散，一般支持物中心温度要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，样品电泳迁移速度增大，相同离子在中央部分的电泳速度比边缘快，会导致电泳分离带呈弓型。降低电流强度，可以减小产热，但会延长电泳时间，引起离子扩散增加从而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，条件允许时可以适当冷却以降低温度来获得较好的分离效果。

四、电渗液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。如果电渗方向与待分离生物大分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。这是因为待分离样品的实际迁移率（μapp）为电泳迁移率（μep）和电渗迁移率(μeof

)的矢量和，即

μapp

=μep+μeof

(4.11)

五、支持物的筛孔支持物的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。§4.1.5电泳的分类按分离原理可分为如下几类：

区带电泳（zoneelectrophoresis,ZEP）：在均一的缓冲液系统中电泳，待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条独立的区带，可用染色等方法显示出来，这是当前应用最为广泛的电泳技术。

移界电泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP）：这是瑞典的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，把电场加在生物大分子溶液和缓冲液之间的界面上，带电离子的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定，能起到部分分离的作用，分离组分有相互重叠的部分，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。

稳态电泳（steadystateelectrophoresis）：包括等速电泳（isotachophoresis,ITP）和等电聚焦电泳（isoelectricfocusing,IEF）。带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化。如：等速电泳使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带分成清晰的界面，并以等速向前运动；

在等电聚焦电泳中两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH