第十讲赖氨酸的生产工艺

第十讲赖氨酸的生产工艺第一页，共67页。1.赖氨酸概述(ɡàishù)(2)赖氨酸广泛存在于动物(dòngwù)蛋白质中，赖氨酸的生产最早是用酸水解酪素，经分离谷氨酸后制得，其后又从血粉中提取（猪血粉中赖氨酸含量约9%～10%），但这种方法，工艺比较复杂，产量受到限制。第二页，共67页。1.赖氨酸概述(ɡàishù)(3)1960年以来，用营养(yíngyǎng)缺陷型的谷氨酸菌株直接发酵生产赖氨酸，其产量不断扩大。1977年，东丽公司以合成的己内酰胺为原料，用酶法生产L-赖氨酸。第三页，共67页。1.赖氨酸概述(ɡàishù)(4)目前，国际(guójì)上赖氨酸产生菌种的生产水平一般为12～14g/L，对糖的转化率为45%。采用淀粉水解糖（或纯糖）发酵，其产酸率、提取率较高；而采用糖蜜发酵，其产酸率、提取率要低一些。第四页，共67页。1.赖氨酸概述(ɡàishù)(5)采用淀粉水解糖(或纯糖)发酵(fājiào)，其产酸率为9%～11%，提取率为83%～87%，原料消耗3.2～3.5t(淀粉)/t(赖氨酸)；第五页，共67页。而采用糖蜜(含糖50%)发酵，其产酸率7%～9%，提取率80%～85%，原料消耗6～8t/t。我国广西赖氨酸厂，采用甘蔗(gānzhe)糖蜜发酵，菌种产酸率8.2%，提取率82.4%，接近国际先进水平。第六页，共67页。2.赖氨酸的性质(xìngzhì)(1)赖氨酸盐酸盐的化学式为C6H14O2N2·HCl，含氮量为15.34%，相对分子质量182.65。由于游离的赖氨酸易吸收空气中的二氧化碳，故制取结晶比较(bǐjiào)困难。一般商品都是赖氨酸盐酸盐的形式。第七页，共67页。2.赖氨酸的性质(xìngzhì)(2)赖氨酸的化学名为2,6-二氨基(ānjī)己酸，具有不对称的α-碳原子，故有两种光学活性的异构体（L/D型）。第八页，共67页。2.赖氨酸的性质(xìngzhì)(3)赖氨酸盐酸盐熔点(róngdiǎn)为263℃，单斜晶系，比旋光度+21°。在水中的溶解度为0℃时53.6g/100mL，25℃时为89g/100mL，50℃时为111.5g/100mL，70℃时为142.8g/100mL。在酒精中的溶解度为0.1g/100mL。第九页，共67页。2.赖氨酸的性质(xìngzhì)(4)赖氨酸含有α-氨基及ε-氨基，只有在ε-氨基为游离(yóulí)状态时，才能被动物机体所利用，故具有游离(yóulí)ε-氨基的赖氨酸被称为有效赖氨酸。故在提取浓缩中，要特别注意防止有效赖氨酸受热破坏而影响其使用价值。第十页，共67页。3.赖氨酸生物合成(héchéng)途径赖氨酸的生物合成途径与其他氨基酸不同，依微生物的种类而异。细菌(xìjūn)的赖氨酸生物合成途径需要经过二氨基庚二酸（DAP）合成赖氨酸；第十一页，共67页。3.赖氨酸生物(shēngwù)合成途径(续）酵母、霉菌的赖氨酸生物合成途径，需要经过(jīngguò)α-氨基己二酸合成赖氨酸。同样是二氨基庚二酸合成赖氨酸途径，不同的细菌，赖氨酸的生物合成途径的调节机制有所不同。第十二页，共67页。4赖氨酸的生产(shēngchǎn)发酵赖氨酸的发酵生产有直接（一步）发酵和两步发酵。赖氨酸的直接发酵法可使用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖(rǔtánɡ)发酵短杆菌、诺卡杆菌等，碳源可为葡萄糖、醋酸、乙醇和石蜡。其转化率和产酸率也有所不同。第十三页，共67页。直接(zhíjiē)发酵法工艺流程第十四页，共67页。赖氨酸的两步发酵法先使用大肠杆菌的赖氨酸缺陷型菌株，因缺少二氨基庚二酸脱羧酶，不能生成赖氨酸，于是积累大量的二氨基庚二酸（DAP）。然后再选用含有(hányǒu)二氨基庚二酸脱羧酶的产气杆菌或大肠杆菌，进行酶法脱羧而生成L-赖氨酸。第十五页，共67页。4.1L-赖氨酸生产(shēngchǎn)菌种及扩大培养直接(zhíjiē)发酵法生产赖氨酸工艺生产菌种：中科院北京微生物研究所选育的北京棒杆菌AS1.563和钝齿棒杆菌PI-3-2(AECr、Hse-)；AEC赖氨酸类似物S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸;Hse天冬氨酰半醛脱氢酶黑龙江轻工研究所选育的241134及179等。第十六页，共67页。L-赖氨酸生产(shēngchǎn)菌种（续）这些菌种产酸水平一般(yībān)为7～8g/L,转化率25%～35%，对我国赖氨酸的生产起了较大的作用。但产酸率和转化率均较低，与国外先进水平相比还有较大差距。第十七页，共67页。种子扩大(kuòdà)培养赖氨酸发酵一般根据接种量及发酵罐规模采用二级或三级种子(zhǒngzi)培养。3/(m3•min)，搅拌转速200r/min。培养时间8～11h。根据发酵规模，必要时可采用三级培养。第十八页，共67页。4.2赖氨酸发酵工艺(gōngyì)及控制要点（1）发酵(fājiào)工艺流程第十九页，共67页。赖氨酸发酵工艺(gōngyì)及控制要点(2)（2）发酵培养基组成(zǔchénɡ)不同菌株，发酵培养基的组成(zǔchénɡ)不完全相同，赖氨酸发酵培养基的组成(zǔchénɡ)见有关文献。第二十页，共67页。赖氨酸发酵工艺及控制(kòngzhì)要点(3)（3）发酵工艺条件及影响因素温度(wēndù)、pH值控制、种龄和接种量、供氧对赖氨酸发酵的影响、生物素对赖氨酸生物合成的影响、硫酸铵对赖氨酸发酵的影响。第二十一页，共67页。如果洗脱(xǐtuō)剂浓度太低，洗脱(xǐtuō)时间长，收集不集中，赖氨酸浓度低。5赖氨酸的精制(jīngzhì)生物(shēngwù)素对赖氨酸生物(shēngwù)合成的影响（续）5赖氨酸的精制(jīngzhì)将赖氨酸盐酸盐粗结晶(jiéjīng)加一定量的水，加热70~80℃使其溶解成16ºBé浓度，加入3%~5%活性炭，搅拌脱色，过滤得赖氨酸盐酸盐清液。浓缩(nónɡsuō)与除氨(2)0被弱酸性阳离子交换树脂吸附。第二十二页，共67页。一般比上柱流速慢些，多用6L/min的速度洗脱，可根据柱的大小而异。上柱吸附(xīfù)－上柱流速1赖氨酸发酵液的主要(zhǔyào)性质L-赖氨酸生产(shēngchǎn)菌种（续）第三十七页，共67页。赖氨酸的提取(tíqǔ)(4)另一方面，过量生物素使细胞内合成的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶起反馈(fǎnkuì)抑制作用，抑制谷氨酸的大量合成，使代谢流转向合成天冬氨酸的方向进行。由于游离的赖氨酸易吸收空气中的二氧化碳，故制取结晶比较(bǐjiào)困难。赖氨酸发酵工艺及控制(kòngzhì)要点(4)温度：幼龄菌对温度敏感，在发酵前期(qiánqī)，提高温度，生长代谢加快，产酸期提前，但菌体的酶容易失活，菌体衰老，赖氨酸产量少。赖氨酸发酵，前期(qiánqī)控制温度32℃，中后期30℃。第二十二页，共67页。赖氨酸发酵工艺及控制(kòngzhì)要点(5)pH值控制(kòngzhì)赖氨酸发酵最适pH值为6.5～7.0。控制(kòngzhì)范围在pH=6.5～7.5,在整个发酵过程中，应尽量保持pH值平稳。第二十三页，共67页。赖氨酸发酵(fājiào)工艺及控制要点(6)种龄和接种量一般在采用二级种子扩大培养时，接种量较少，约2%，种龄一般为8～12h，当采用三及种子扩大培养时，种量较大约10%，种龄一般为6～8h。总之(zǒngzhī)，以对数生长期的种子为好。第二十四页，共67页。赖氨酸发酵工艺(gōngyì)及控制要点(7)供氧对赖氨酸发酵的影响

赖氨酸是天冬氨酸族氨基酸，它的最大生成量是在供氧充足(chōngzú)，细菌呼吸充足(chōngzú)条件下实现的。供氧不足，细菌呼吸受抑制，赖氨酸产量降低，供氧不足只是轻微影响赖氨酸生成。严重供氧不足时，产赖氨酸量很少而积累乳酸。第二十五页，共67页。赖氨酸发酵工艺(gōngyì)及控制要点(8)生物素对赖氨酸生物合成的影响

在以葡萄糖，丙酮酸为唯一碳源的情况(qíngkuàng)下，添加过量生物素（200～500μg/L），赖氨酸积累量显著增加。因为生物素量增加，促进了草酰乙酸的合成，增加了天冬氨酸供给。第二十六页，共67页。生物(shēngwù)素对赖氨酸生物(shēngwù)合成的影响（续）另一方面，过量生物素使细胞内合成的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶起反馈(fǎnkuì)抑制作用，抑制谷氨酸的大量合成，使代谢流转向合成天冬氨酸的方向进行。第二十七页，共67页。赖氨酸发酵(fājiào)工艺及控制要点(9)硫酸铵对赖氨酸发酵的影响

硫酸铵对赖氨酸发酵影响很大。当硫酸铵含量大时菌体生长迅速，使赖氨酸产量低。但在无其他铵离子(lízǐ)情况下，用量为4.0%～4.5%时赖氨酸产量最高。第二十八页，共67页。6.赖氨酸的提取(tíqǔ)和精制赖氨酸的提炼过程(guòchéng)包括：发酵液预处理提取精制第二十九页，共67页。6.1赖氨酸发酵液的主要(zhǔyào)性质赖氨酸发酵液由于(yóuyú)所用的原料、培养基组成及浓度、菌种和发酵工艺不同，其组成也不同，一般由以下四部分组成：氨基酸、菌体、培养基残留物、第三十页，共67页。（1）氨基酸氨基酸代谢主产物赖氨酸，含量(hánliàng)为7~8g/L；少量其他氨基酸，如缬氨酸，丙氨酸和甘氨酸，当发酵不正常时含有谷氨酸；少量有机酸，特别是发酵工艺控制不好时，含有乳酸。第三十一页，共67页。（2）菌体菌体一般(yībān)含量在15~20g（干重）/L。第三十二页，共67页。（3）培养基残留物培养基残留物如残糖6~20g/L(随原料不同而异)，无机离子（如NH4+、Ca2+、Mg2+、K+和一些(yīxiē)阴离子，其中NH4+浓度较高）。第三十三页，共67页。（4）色素(sèsù)色素发酵液中的这些杂质对赖氨酸的提取和精制影响(yǐngxiǎng)很大，特别是菌体和钙离子等，应尽量除去。第三十四页，共67页。6.2发酵液的预处理发酵液的预处理，包括除菌体和影响提取收率的杂质离子。去除菌体的方法有离心分离法和添加(tiānjiā)絮凝剂沉淀两种方法。第三十五页，共67页。离心分离法采用高速离心机分离除去，如菌体体积(tǐjī)小时需反复分离，成本高。添加絮凝剂沉淀法是先将发酵液调节到一定的pH值，加适宜絮凝剂如聚丙烯酰胺，使菌体絮凝而沉淀，加助滤剂过滤出去。第三十六页，共67页。发酵液的预处理(3)钙离子一般通过(tōngguò)添加草酸或硫酸，成钙盐沉淀而除去。经验证明，发酵液经过预处理后，提取收率明显提高。第三十七页，共67页。6.3赖氨酸的提取(tíqǔ)从发酵液中提取赖氨酸通常有四种方法：a.沉淀法，利用(lìyòng)赖氨酸生成难溶性盐而沉淀分离，或使赖氨酸结晶析出；b.有机溶剂萃取法；c.离子交换法；d.电渗析法。第三十八页，共67页。赖氨酸的提取(tíqǔ)(2)工业生产主要采用离子交换法提取赖氨酸，该法回收率高，产品(chǎnpǐn)纯度高。赖氨酸是碱性氨基酸，等电点(pI)为9.59。在pH=2.0左右能最大程度地被强酸性阳离子交换树脂吸附。pH=7.0~9.0被弱酸性阳离子交换树脂吸附。第三十九页，共67页。赖氨酸的提取(tíqǔ)(3)强酸性阳离子交换树脂(shùzhī)和弱酸性阳离子交换树脂(shùzhī)对纯赖氨酸溶液和发酵液中赖氨酸的吸附量是不同的。第四十页，共67页。赖氨酸的提取(tíqǔ)(4)弱酸性阳离子交换(jiāohuàn)树脂对纯赖氨酸的吸附能力大，但对发酵液中的赖氨酸吸附能力大为降低，这是因为发酵液中除赖氨酸外还有相当多杂质影响所致。因此，从发酵液中提取赖氨酸常选用强酸性阳离子交换(jiāohuàn)树脂。第四十一页，共67页。赖氨酸的提取(tíqǔ)(5)强酸性阳离子交换树脂的氢型对赖氨酸的吸附(xīfù)比铵型容易得多。但是铵型强酸性阳离子交换树脂能选择性地吸附(xīfù)赖氨酸和其他碱性氨基酸，不吸附(xīfù)中性和酸性氨基酸，故容易与其他氨基酸分离。第四十二页，共67页。赖氨酸的提取(tíqǔ)(6)另外，选用铵型树脂，可以简化树脂的转型操作，如在用氨水洗脱赖氨酸的同时，树脂已转成铵型，不必再生。所以从发酵液中提取(tíqǔ)赖氨酸均选用铵型强酸性阳离子交换树脂。第四十三页，共67页。赖氨酸提取(tíqǔ)精制工艺流程第四十四页，共67页。6.4离子交换(lízǐjiāohuàn)法提取赖氨酸离子交换法提取赖氨酸可用三柱串联(chuànlián)的方式，以提高收率。上柱吸附：上柱方式、交换量、上柱流速洗脱剂（氨水洗脱、氨水+氯化铵洗脱、氢氧化钠洗脱）第四十五页，共67页。上柱吸附(xīfù)－上柱方式上柱方式上柱方式有正上柱和反上柱两种。如果发酵液含菌体等固形物较多，流速(liúsù)较快时，容易造成树脂层堵塞，这是采用反上柱较好。第四十六页，共67页。上柱吸附(xīfù)－交换量交换量正向上柱时，一般为每吨树脂可吸附90~100kg赖氨酸盐酸盐，反向上柱可吸附70~80kg赖氨酸盐酸盐。流出液pH=5时表明(biǎomíng)吸附达饱和。第四十七页，共67页。上柱吸附(xīfù)－上柱流速上柱流速上柱流速应根据上柱液性质、树脂的性质、柱大小及上柱方式等具体情况决定。应在小柱中进行试验确定适合的上柱流速。一般正向上柱速度大些，可以(kěyǐ)10L/min的流速吸附；反上柱流速小些。第四十八页，共67页。洗涤(xǐdí)上柱后，需用水洗去停留在树脂的菌体、残糖等杂质，直至洗涤水清亮(qīngliàng)，同时使树脂疏松以利洗涤。第四十九页，共67页。洗脱(xǐtuō)剂（1）氨水洗脱优点是洗脱液经浓缩除氨后，含杂质较小，有利于后工序精制；缺点是树脂吸附(xīfù)的阳离子，如Ca2+、Mg2+等不易洗脱。第五十页，共67页。洗脱(xǐtuō)剂（续）残留在树脂中，随着(suízhe)操作次数的增加而积累，造成树脂吸附氨基酸能力下降。因此在树脂使用一段时间后需要用酸或食盐溶液进行再生处理。第五十一页，共67页。洗脱(xǐtuō)剂(2)（2）氨水+氯化铵洗脱特点是可以洗脱树脂吸附的Ca2+等阳离子，提高树脂的交换容量，由于在碱性条件下赖氨酸先被洗脱，然后才有Ca2+等离子被洗脱，采取分段收集不会导致(dǎozhì)赖氨酸收集液中Ca2+含量增加。第五十二页，共67页。氨水(ānshuǐ)+氯化铵洗脱通过调节氨水与氯化铵的物质的量之比为1:1，可直接(zhíjiē)使赖氨酸成单盐酸盐形式存在，不需在中和。第五十三页，共67页。洗脱(xǐtuō)剂(3)（3）氢氧化钠洗脱特点是没有氨味，容易操作，但在洗脱液中Na+含量较高，影响(yǐngxiǎng)赖氨酸的提纯精制。第五十四页，共67页。洗脱(xǐtuō)剂(4)洗脱(xǐtuō)剂的浓度对洗脱(xǐtuō)效果有影响。一般来讲，为了分离只能用适当浓度的洗脱(xǐtuō)剂。如果洗脱(xǐtuō)剂浓度太高，达不到洗脱(xǐtuō)目的。如果洗脱(xǐtuō)剂浓度太低，洗脱(xǐtuō)时间长，收集不集中，赖氨酸浓度低。第五十五页，共67页。洗脱(xǐtuō)剂(5)使用氨水洗脱时，一般浓度为3.6%~5.4%。如果用5％的氨水洗脱，收集液赖氨酸平均(píngjūn)浓度可达6%~8%，洗脱高峰段，赖氨酸盐酸盐含量和达15%~16%。第五十六页，共67页。洗脱(xǐtuō)剂(6)洗脱操作及洗脱液收集，采用单柱顺流洗脱，为了使洗脱集中，赖氨酸浓度高，应控制(kòngzhì)好洗脱液流速。一般比上柱流速慢些，多用6L/min的速度洗脱，可根据柱的大小而异。第五十七页，共67页。洗脱(xǐtuō)剂(7)用茚三酮检查流出液，当有赖氨酸流出时即可收集。一般(yībān)为pH=9.5~12，前后流分赖氨酸浓度低而铵含量高，可合并于洗脱用氨水中，以提高收得率。一般(yībān)收得率可达90%~95%。第五十八页，共67页。6.5赖氨酸的精制(jīngzhì)浓缩与除氨赖氨酸盐酸盐的结晶(jiéjīng)与分离赖氨酸盐酸盐的重结晶(jiéjīng)与干燥第五十九页，共67页。浓缩(nónɡsuō)与除氨经过离子交换提取的赖氨酸洗脱液，体积较